CROMATOGRAFÍA

Cromatografía es el término con el que se denomina a un conjunto de métodos

analíticos utilizados para separar, identificar y cuantificar los componentes de una
muestra. Mediante una cromatografía es posible separar analitos muy parecidos entre sí en
cuanto a sus propiedades físico-químicas. Por ejemplo nos permite separar mezclas de
aminoácidos; mezclas de proteínas; mezclas de ácidos grasos; pigmentos; pesticidas; etc.

¿Por qué cromatografía?

La primera vez que se utilizó el método fue para separar pigmentos vegetales
a partir de un extracto de hojas y el resultado obtenido fue una serie de
bandas coloreadas (verdes y amarillas correspondientes a clorofilas y carotenoides)
por lo que se denominó al método de separación CROMATOGRAFIA,
término que deriva del griego “chromatos” que significa color (1903, Tswett).

Para realizar una cromatografía se necesitan dos fases (fase estacionaria y fase móvil) y
un soporte:
1- Fase estacionaria (FE): será un componente que estará contenido en un soporte
adecuado y como su nombre lo indica permanecerá fija en un espacio determinado. Puede
ser sólida o líquida. Según qué tipo de soporte que se utilice para contener a la fase
estacionaria las cromatografías pueden ser planas o en columna.
2- Fase móvil (FM): será un compuesto químico, o una mezcla sencilla de compuestos
químicos y como su nombre lo indica debe fluir (moverse) a través de la fase estacionaria.
La fase móvil es la que arrastrará a la muestra obligándola a atravesar la fase estacionaria.
Puede ser líquida o gaseosa dando lugar a las denominadas “Cromatografías Liquidas”
y “Cromatografías Gaseosas” respectivamente.
Por lo tanto en toda cromatografía hay una fase estacionaria inmovilizada en un
soporte y una fase móvil que arrastrará a la muestra a través de la fase estacionaria.
Durante este proceso cada componente de la muestra se va a desplazar según sus propias
características físico-químicas las que van a determinar que interaccione más con la fase
estacionaria o que prefiera a la fase móvil. El concepto general será que aquellos analitos
que prefieren a la fase estacionaria son más retenidos, es decir van quedando más atrasados,
mientras que aquellos que prefieran a la fase móvil se desplazarán más rápido.

1
I- Existen al menos tres maneras de clasificar a las cromatografías:

1- Clasificación de las cromatografías según el estado de agregación de las fases.

2- Clasificación de las cromatografías según el soporte que contiene a la fase estacionaria.
3- Según el mecanismo físicoquímico por el que se produce la separación de los analitos.

1- Clasificación de las cromatografías según el estado de agregación de las fases:

2- Clasificación de las cromatografías según el proceso fisicoquímico que se pone

en juego para la separación de los analitos

Nombre Algunas características

Cromatografía de Adsorción FE sólida y FM líquido o gas

Cromatografía de Reparto
Cromatografía de intercambio
iónico
Cromatografía de Exclusión
molecular
Cromatografía de Afinidad
Los analitos son adsorbidos por el sólido según su
polaridad.
FE líquido y FM líquido / gas
Los analitos se reparten entre dos líquidos según
su polaridad.
FE resina (sólido) con grupos unidos
covalentemente de carga opuesta al ión que
intercambian. Hay resinas de intercambio catiónico
(con grupos sulfónicos negativos) y resinas de
intercambio aniónico (con grupos aminas
cuaternarias positivas).
FM líquido
Se basa en la atracción entre cargas opuestas.
FE gel poroso.
FM líquido / gas
Separa los analitos por tamaños. Los poros del gel
serán atravesados por las moléculas pequeñas
pero no por las moléculas grandes. Las moléculas
pequeñas tardarán másen atravesar la fase
estacionaria.
FE especialmente diseñada para atrapar a un
soluto en particular. Muy selectiva

2
3- Clasificación de las cromatografías según el soporte que contiene a la fase
estacionaria:

A continuación podemos observar los esquemas que representan un proceso

cromatográfico, es decir la separación de los componentes de una muestra a través de la
interacción de los mismos con cada una de las dos fases involucradas, cada banda de color
representa a un analito separado:

Cromatografía plana: Cromatografía en columna:

(En este caso la fase móvil asciende.) (En este caso la fase móvil desciende)

3.1- Generalidades de las CROMATOGRAFÍAS PLANAS:

De acuerdo al soporte utilizado hay dos tipos de cromatografías planas:

cromatografía en papel y cromatografía en capa fina. En ambos casos el soporte puede ser
a su vez la fase estacionaria, pero para ello se debe activar el papel o la “capa fina”, lo que
quiere decir que se colocarán en una estufa para quitar la humedad ambiente. De lo
contrario, la fase estacionaria será una fina película de líquido adsorbido en la superficie del
papel o de la capa fina, en general agua (humedad ambiente).
Las cromatografías planas pueden realizarse en forma ascendente o descendente.
En la forma ascendente la fase móvil arrastra a la muestra recorriendo la fase estacionaria
desde abajo hacia arriba mientras que en la forma descendente el camino será desde arriba
hacia abajo. En la cromatografía plana ascendente la fase móvil sube por capilaridad
mientras que en la descendente la fase móvil se mueve principalmente por gravedad.

3
 El parámetro que se mide en una cromatografía plana se denomina relación
de frentes, Rf, y representa la distancia que recorre un analito sobre la fase estacionaria
respecto a la distancia que recorre la fase móvil en la cromatografía:

Rf A = distancia recorrida por el analito A / distancia recorrida por la FM

Este parámetro puede tomar valores entre 0 y 1. Cuanto más cercano a 0 es el valor de Rf
significa que el analito tiene afinidad por la fase estacionaria (es muy retenido) mientras que
cuanto más cercano a 1 sea el valor de Rf significa que el analito tiene más afinidad por la
fase móvil, por lo tanto es poco retenido por la fase estacionaria.

En general las cromatografías planas necesitan las siguientes etapas (Figura 1):
1- Siembra de la muestra: consiste en colocar una pequeña cantidad de la muestra a
analizar en uno de los extremos del soporte donde está contenida la fase estacionaria.
2- Desarrollo del cromatograma: la fase móvil recorre la fase estacionaria “empujando” a
la muestra, cada analito se desplaza a una velocidad diferente. Esta etapa finaliza cuando la
fase móvil llegue cerca del otro extremo del soporte.
3- Si los analitos tienen color (por ejemplo los pigmentos vegetales) se puede observar a
simple vista la separación de los mismos sobre la fase estacionaria. Si los analitos no tienen
color al finalizar el desarrollo no podremos ver la separación, es necesario realizar una
etapa de REVELADO para poner en evidencia donde quedó cada analito separado.
4- Cálculo de Rf: realizar las medidas correspondientes para calcular los valores de Rf de
cada analito.
Figura 1: El rectángulo representa la fase
estacionaria retenida en un soporte plano. La
línea trazada cerca del extremo inferior representa
la línea de siembra. El círculo azul sin relleno
representa la muestra sembrada (1). Es una
cromatografía plana ascendente por lo tanto la
FM subirá por capilaridad a través de la fase
estacionaria durante el desarrollo hasta llegar
cerca del extremo superior, a esto se le denomina
“frente de la fase móvil” (2). Finalmente se
realiza un revelado para observar los analitos
separados (3). Se miden las distancias recorridas
para obtener el Rf de cada analito. Las distancias
se miden desde la línea de siembra hasta el lugar
donde llegó cada analito y en el caso de la fase
móvil desde la línea de siembra hasta el “frente”
donde llegó la fase móvil.

Comentario a tener en cuenta: Muchas veces en las cromatografías

se suele denominar a la fase móvil como solvente, lo cual es cierto
siempre que la cromatografía use como fase móvil un líquido
menos polar que el agua. En esos casos se suele decir “frente del
solvente” en lugar de frente de fase móvil.

4
Ejemplo de cálculo del parámetro Rf (relación de frentes):

Frente de FM

Posición final
del analito

Punto de
siembra

¿Qué utilidad práctica puede tener una cromatografía plana y su parámetro Rf?
Rf como criterio de NO IDENTIDAD

El valor de Rf es un parámetro que nos permite asegurar la ausencia de un analito

en una muestra, pero por si sólo no puede garantizar la presencia del analito. Esto se
denomina criterio de NO IDENTIDAD y es una herramienta útil en los análisis para el
control del uso de compuestos no permitidos. Ejemplos de aplicación de este concepto:
detectar la presencia de pesticidas en frutas y verduras; detectar la presencia de algún metal
pesado en pinturas para maderas; detectar algún compuesto que revele adulteración de un
producto.
Uso del criterio de NO IDENTIDAD para controlar el uso de un pesticida no habilitado
en un cultivo de lechuga:
1- Aplicar el criterio de NO IDENTIDAD implica conocer el valor de Rf del analito de
interés, en este caso el pesticida no habilitado para lechuga.
2- Se realizan las cromatografías planas de un gran número de muestras: extractos de hojas
de lechuga provenientes de la producción que se está controlando.
3- Se analizan los Rf obtenidos en cada muestra de lechuga.
4- Interpretación de resultados:
 Si la muestra de lechuga no tiene un valor de Rf que sea igual al del pesticida
prohibido podemos asegurar que NO TIENE el pesticida prohibido por lo
tanto se acepta la lechuga.
 Si alguna muestra de lechuga dio positivo para el pesticida ya que algún
componente dio un valor de Rf igual al del pesticida la lechuga se descarta
momentáneamente hasta que el resultado se confirme por otro método.

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3.2- Generalidades de las CROMATOGRAFÍAS EN COLUMNA:

En las cromatografías en columna, se usa como soporte un tubo de vidrio que

contiene en su interior una fase estacionaria sólida finamente molida (sacarosa, silicagel,
alúmina, resinas activas) o bien un tubo de vidrio relleno con un sólido inerte finamente
molido, lo que en conjunto actuará como soporte de una fase estacionaria líquida absorbida
en ese sólido. También pueden utilizarse columnas capilares en las cromatografías que
tienen FM gaseosa.
Las cromatografías en columna se suelen denominar según la naturaleza de la fase
móvil: “Cromatografía líquida” y “Cromatografía gaseosa”. En las cromatografías en
columna la fase móvil se desplaza sobre la fase estacionaria por acción de la gravedad y/o
por aplicación de una presión para que sea posible la circulación del fluido por el interior
de la columna de diámetro pequeño.
Las cromatografías en columna se realizan generalmente utilizando un equipo
denominado CROMATÓGRAFO, el que permite obtener un registro de la cromatografía
realizada que se denomina CROMATOGRAMA.

Las etapas necesarias para realizar una cromatografía en columna son (Figura 3):
1- Inyección de la muestra: es el equivalente a sembrar la muestra en la cromatografía
plana, el lugar de inyección será en un extremo de la columna.
2- Desarrollo de la cromatografía: la fase móvil empuja a los analitos obligándolos a
atravesar la fase estacionaria contenida en la columna. Durante este proceso los analitos se
separan dentro de la columna.
3- Elución: en las cromatografías en columna es necesario que los analitos separados
dentro de la columna lleguen a salir de la columna para poder detectarlos. Se hace circular
fase móvil hasta que los analitos se recuperen a la salida de la columna.Por este motivo
muchas veces se nombra a la fase móvil como “eluyente”.

Figura 3: Representación
esquemática de las etapas de
una cromatografía en
columna. 1 representa la
inyección de la muestra; 2 el
desarrollo de la
cromatografía y 3 representa
la elución de analitos.

1 2 3 3

El parámetro que se mide en una cromatografía en columna es el tiempo de retención

(tr) o el volumen de retención (Vr), ambos parámetros tienen la misma interpretación
sólo que se miden en distintas unidades:

Tiempo de retención: es el tiempo que transcurre desde que se inyectó la muestra hasta
que el analito sale de la columna.

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Volumen de retención: es el volumen de FM que circuló por la columna desde que se
inyectó la muestra hasta que el analito sale de la columna.
Un analito con un bajo tiempo de retención (o volumen de retención) tendrá alta afinidad
por la FM, interacciona poco con la fase estacionaria y por lo tanto sale pronto de la
columna. Por el contrario, un analito que tiene alta afinidad por la FE será retenido mucho
tiempo dentro de la columna y tardará en salir de la misma.

Tiempo muerto de la columna: algunas veces en el cromatograma aparece el “tiempo

muerto” (tm) o “volumen muerto” (Vm) de la columna que corresponde al primer pico
del gráfico y aparece rápidamente (es un tiempo muy corto). Corresponde a un analito que
no interacciona con la fase estacionaria y por lo tanto es una medida del tiempo (o
volumen de FM) que se necesita para recorrer la columna desde que se inyectó la muestra.
Si el cromatograma tiene un dato de tm, todos los tiempos de retención se corrigen
respecto a él y se denominan tiempo de retención neto.

Volveremos a estudiar estos conceptos en la sección de la guía: ¿Qué parámetros podemos obtener de un
cromatograma?

II- Componentes del CROMATÓGRAFO GASEOSO (Figura 4)

(Cromatografía en columna)

En este caso la FM es gaseosa, por lo tanto el recipiente que contiene a la FM (eluyente) es

una garrafa con su correspondiente regulador de presión. Antes de llegar a la columna
habrá un regulador de flujo que permite controlar a qué velocidad se hará circular la FM a
través de la columna. Dentro del horno que nos permite regular la temperatura de trabajo
encontramos la columna donde está contenida la FE. En el extremo de la columna
próximo al ingreso de la FM se encuentra el inyector, donde se va a colocar la muestra que
se analizará. En el extremo opuesto de la columna, que corresponde a la salida de la
columna, estará ubicado el detector. Finalmente y nuevamente fuera del horno
encontramos el procesador y el registro del CROMATOGRAMA.

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 III- Componentes del CROMATÓGRAFO LÍQUIDO (Figura 5)
(Cromatografía en columna)

En el reservorio de FM, que en este caso es un líquido, está conectada una bomba de alta
presión que permite seleccionar con que presión se hará circular la FM líquida a través de la
columna que contiene la fase estacionaria. Antes de la columna encontramos el inyector
donde se colocará la muestra, luego la columna que contiene a la FE y luego de la columna
el detector que permite obtener los datos necesarios para obtener finalmente el
CROMATOGRAMA.

ESQUEMA BÁSICO PARA AMBOS CROMATÓGRAFOS

Reservorio de FM Inyector Columna (FE) Detector Registro:

Cromatograma

¿Dónde se produce la separación de analitos?

IV- CROMATOGRAMA (Cromatografía en columna)

Es el gráfico donde se registran los analitos separados durante el proceso

cromatográfico. Este registro se logra mediante un detector ubicado a la salida de la
columna del cromatógrafo. El detector dará una señal base (línea de base) cuando por la
salida de la columna circule la fase móvil. Cuando la fase móvil contenga un analito la señal

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del detector se levantará dando lugar a un pico correspondiente al analito que está saliendo
con la fase móvil (Figura 6).

Figura 6- Representación esquemática de un cromatograma en el que se obtuvieron tres analitos

separados: a, B y C. En el eje Y se grafica la señal del detector y en el eje X se grafica el tiempo en
minutos desde que se inyectó lamuestra hasta que sale el analito. En este esquema t1 t2 y t3
representan los minutos a los que salió cada analito (A, B y C respectivamente).

En algunos cromatógrafos el cromatograma que se obtiene representa

la señal del detector (en el eje Y) en función del volumen de fase móvil
que circula desde la inyección de la muestra (en el eje X) en lugar del
tiempo que transcurrió desde la inyección de la muestra.

Ejemplo de un cromatograma real obtenido en un

cromatógrafo líquido de alta presión (HPLC) (figura 7)

Figura 7- En el eje Y se
representa la señal del
detector y en el eje X el
tiempo en min.
Corresponde a la
separación de azúcares
solubles a partir de un
extracto etanólico de
pulpa de un fruto.

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 ¿Qué parámetros podemos obtener en un cromatograma?
1- Tiempo de retención (tr):
Es el tiempo que tarda en salir un analito de la columna, este valor se mide en minutos a
partir de la inyección de la muestra. Un analito con un tr bajo es un analito que tiene baja
afinidad por la fase estacionaria, es decir que es poco retenido en la fase estacionaria. Por el
contrario, un tr alto será un analito que tiene gran afinidad por la fase estacionaria y por lo
tanto es fuertemente retenido y tardará más tiempo en salir de la columna.
 Si el cromatograma representa la señal del detector en función del volumen de fase móvil que
circula el parámetro se denomina Volumen de retención (Vr) y se interpreta del mismo modo que
el tiempo de retención.

Tiempo muerto (tM): tiempo que

tarda en recorrer la columna la fase
móvil desde que se inyectó lamuestra.
Para determinar el tiempo muerto es
necesario agregarle a la muestra un
analito que a priori sabemos que no
interactúa en absoluto con la fase
estacionaria. No todos los
cromatogramas tendrán este dato. En
aquellos cromatogramas que tienen el
valor de tM se calculan los tiempos de
retención netos para cada analito
restándole el tiempo muerto al valor
del tiempo de retención (figura 8).

tR´ = tR - tM Figura 8- Tiempo muerto, de retención y de retención neto.

2- Área bajo el pico: es proporcional a la cantidad del analito al que corresponde ese pico.
Podemos decir que cuanto mayor es el área bajo el pico, mayor la cantidad del analito que
representa ese pico. Para poder cuantificar es necesario previamente realizar una calibración
de la cromatografía (como ocurre con todos los métodos instrumentales) (Figura 9).

Figura 9- Cromatograma
del mismo analito pero
en cantidades diferentes.
A mayor concentración
en la solución, mayor el
área del triángulo. Para
calcular el área se
aproxima el dibujo a un
triángulo y se calcula el
área del triángulo:
(base x altura /2)

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3- Ancho en la base del pico (W): se mide en las unidades que se grafican en el eje X
(minutos o mililitros) y es un parámetro que permite interpretar si la cromatografía es
eficiente para separar prolijamente un analito. Si la cromatografía es eficiente significa que
el analito queda concentrado en una porción estrecha de la fase estacionaria contenida en la
columna (no existe efecto de “desparramo” dentro de la columna (Figura 10).
Concretamente cuanto menor es el ancho de la base del pico más eficiente es la
cromatografía (menor efecto desparramo).

Figura 10- Eficiencia de un pico en un cromatograma. Cuanto más finito (agudo) es el pico
obtenido para un analito, más eficiente es la cromatografía para ese analito.

La Eficiencia de la cromatografía realizada se puede calcular para cada analito obtenido a

partir de los datos del pico correspondiente: tiempo de retención y ancho de la base del
pico. Asumiendo que los picos son simétricos alrededor del máximo, asumimos que la
eficiencia se calcula con la siguiente fórmula:

Eficiencia = 16 (tr/W)2
4- Resolución de la cromatografía: es un parámetro que nos permite evaluar si los analitos
fueron separados correctamente (están resueltos) o si hay desprolijidades en la separación,
lo que significa que hay zonas a la salida de la columna donde dos analitos consecutivos
salen mezclados. La resolución se calcula a partir de los datos del cromatograma para dos
picos consecutivos. Corresponde a la diferencia entre los tiempos de retención divido el
promedio del ancho de bases:

Rs = ( trB-trA )
(WA + WB) Rs debe ser ≥1,5
2

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 Figura 11- Representación de
tres cromatogramas para los
analitos A y B.
Los analitos se separaron
bien en el gráfico inferior
donde la resolución (Rs) dio
por lo menos 1,5.
En los otros dos casos las
resoluciones dieron valores
menores a 1,5 y como se
observa en el dibujo los dos
picos no están bien
separados.

Una mala eficiencia termina complicando la resolución.

Picos anchos aumentan las chances de obtener picos superpuestos
(mala resolución).
Cuanto más angostos son los picos (picos agudos)
mayor la probabilidad de obtenerlos separados.

FACTORES QUE AFECTAN LA EFICIENCIA DE UNA CROMATOGRAFIA

Básicamente los cuatro factores que determinan la eficiencia de una cromatografía en

columna son los siguientes:
1-Naturaleza de la fase estacionaria (calidad del empaquetamiento en caso de columnas
rellenas y resistencia a la transferencia de materia que ofrece la FE).
2-Naturaleza de la fase móvil (resistencia a la transferencia de materia que ofrece la FM)
3-Velocidad a la que circula la fase móvil (para cada cromatografía diseñada existirá una
velocidad óptima para la circulación de la FM).
4-Temperatura de trabajo (modifica la resistencia a la transferencia de materia de las fases
involucradas y modifica el coeficiente de difusión de los analitos).

En la práctica estos cuatro factores representan las características del método

cromatográfico que podemos cambiar para lograr que los picos anchos de un
cromatograma se transformen en picos angostos.

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 ACTIVIDADES DE LABORATORIO
1- Cromatografía plana
Separación de Fe+3, Ni+2, Cu2 por cromatografía de reparto en papel

Se realizará una cromatografía para separar iones metálicos, utilizando un papel de filtro
como soporte, una fina película de agua como FE y un”solvente” como FM.
Composición de la FM: 17 ml de acetona- 1 ml de agua-2 ml de HCl (concentrado).
La cromatografía de papel es un método de reparto o partición que utiliza como soporte de
a fase estacionaria la celulosa de una hoja de papel de filtro especial (Whatman o Schleicher
& Schull).

Procedimiento: Etapas de la cromatografía plana

1- Siembra de la muestra:
La muestra se disuelve en un solvente volátil (para que se seque fácilmente) con una
concentración de por lo menos 10 mg/ml (10μg/μl). Se utiliza una tira de papel
rectangular. Para efectuar la siembra de la muestra sobre el papel se traza con un lápiz la
“línea de siembra” a aproimadamente 1cm del extremo de la tira de papel. Mediante una
pipeta capilar (0,5 mm de diámetro) se deposita una pequeña gota tal que al extenderse
sobre el papel sea de aproximadamente 2 a 3 mm de diámetro. Dejas secar la gota y repetir
el procedimiento colocando una segunda gota en el mismo lugar.
2-Desarrollo del cromatograma:
Una vez sembrada la muestra, la hoja de papel se coloca dentro de la cámara que está
saturada con los vapores de la mezcla de solventes (Fase móvil) que se van a emplear para
el desarrollo del cromatograma. Se deja en esas condiciones durante un período variable
que se llama periodo de equilibrado, durante el cual el papel se satura sin entrar directamente en
contacto con el solvente. Luego se sumerge el borde inferior del papel en el solvente
contenido en el fondo de la cuba (cromatografía ascendente).
El reparto o partición se lleva a cabo entre el agua (fase estacionaria) retenida por la
celulosa del papel y el solvente empleado en el desarrollo del cromatograma (fase móvil).
Es decir que a medida que el solvente se desplaza sobre el papel, se produce un reparto o
distribución de los analitos de la muestra entre el solvente orgánico (FM) y el agua retenida
(FE), lográndose así una separación de los componentes de una mezcla según sus
respectivos coeficientes de reparto. Como consecuencia de esto, los componentes es
moverán con distintas velocidades. Cuando el frente del solvente (FM) llega a una adecuada
distancia del borde superior se retira el papel, se marca con lápiz el “frente del solvente
(FM)” se seca y se revela.
3-Revelado del cromatograma:
Una vez desarrollado el cromatograma, se rocía el papel seco con una solución alcohólica
de dimetilglioxima, exponiendo luego el papel a los vapores de NH3
La aparición de una mancha de color rojo de Ni-dimetilglioxima indica la presencia de Ni+2.
Luego se rocía el resto del papel con solución acuosa de ferrocianuro de potasio. La
aparición de una mancha azul y de una mancha de color marrón revelan la presencia de
Fe+3 (mancha azul de ferrocianuro férrico) y de Cu+2 (mancha marrón ferrocianuro cúprico)
respectivamente.
Se marcan con lápiz el centro de cada mancha (o la zona donde el color es más intenso).
4- Cálculo de los Rf correspondientes:
Todas las distancias se miden desde la “línea de siembra”. Con los datos obtenidos en el
papel (distancias medidas con una regla) se podrá calcular las relaciones de frente.

13
 distancia recorrida por la muestra
Rf  
distancia recorrida por el solvente
La relación de frentes Rf se calcula para cada componente midiendo las distancias desde a
línea de siembra hasta el centro de la mancha correspondiente a cada analito y desde la
línea de siembra hasta el frente del solvente (FM).
5- Interpretación de los resultados

2- Cromatografía en columna
Eliminación de la “Dureza de agua” por cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de intercambio iónico:
En este tipo de cromatografía se utiliza como FE un sólido particular: una resina que
presenta unidos covalentemente muchos grupos de carga opuesta a los iones que se van a
intercambiar. Si es una resina de intercambio catiónico tendrá unidos covalentemente
grupos negativos (sulfónicos: RSO3 -) mientras que si se trata de una resina de intercambio
aniónico, tendrá unidos covalentemente grupos de carga positiva (aminas cuaternarias: NH3
+
).
La FM en este tipo de cromatografía es un líquido que llevará disueltos a los iones que
queremos separar. Por lo tanto cuando la FM empuje a los iones a través de la FE, los
analitos de carga opuesta a la fase estacionaria serán atraídos y retenidos por una fuerza
electrostática.

Reacción química que interpreta el funcionamiento de una resina de intercambio catiónico:

R-SO3 H + Ca+2 (R-SO3)2 Ca + 2H+

La condición inicial de la resina será cuando está equilibrada con agua destilada, por lo
tanto el grupo sulfónico estará unido a un protón (H+). Cuando intercambie el protón por
los cationes calcio tendrá como consecuencia la acidificación el agua. Una vez que la resina
se agota (todos los sitios ya fueron intercambiados) se pueden reciclar usando HCl para
recuperar la condición inicial.

¿Cómo funcionaría una resina intercambiadora de aniones?

¿Qué pasaría con el agua entonces?¿Cómo la reciclaríamos?

Muchas sustancias sólidas, naturales o sintéticas, pueden emplearse como

intercambiadores de iones. Las arcillas (naturales) son componentes de los suelos que
actúan como intercambiadoras de iones por lo tanto tendrán influencia en la
“disponibilidad de iones”. Las resinas sintéticas de intercambio de iones son polímeros
de alto peso molecular que fueron producidas por primera vez en 1935 y desde entonces
han hallado gran aplicación en el laboratorio y la industria para ablandamiento de
aguas (eliminación de Ca+2 y Mg+2), desionización de aguas, purificación de
soluciones y separación de iones.

En el trabajo práctico se utilizará como soporte una columna de vidrio rellena con una
resina de intercambio catiónico (cargada con grupos sulfónicos) la que va a retener
fuertemente los iones Ca+2 y el Mg+2 cuando una muestra de agua circule a través de la
misma.

14
 Soporte: Columna
FE: resina de intercambio catiónico (sólida)
FM: agua

La retención de los iones dentro de la columna se pondrá en evidencia mediante el uso de

Indicadores metalocrómicos los que permiten fácilmente revelar la presencia o ausencia de
los iones Ca+2 y Mg+2.

Procedimiento en el trabajo práctico:

a) Se toman 10 ml de una muestra de agua sin tratar, se agregan 5 ml buffer pH 10 (mezcla

de NH4Cl y NH4OH)) y se agrega una pizca de indicador negro de eriocromo. La
coloración rojo vinoso indica la presencia de Ca+2 y Mg+2.
b) Se toma otra alícuota de la misma muestra, se hace pasar lentamente por la resina
intercambiadora de cationes y se recoge la muestra a la salida de la columna en un vaso
de precipitado. Se agregan 5 ml de buffer pH 10 y una pizca de negro de eriocromo. La
aparición de una coloración azul indica la ausencia de los cationes Ca+2 y Mg+2, que
fueron entonces retenidos por la resina dentro de la columna.

Cuestionario
1. ¿Qué entiende por cromatografía?
2. ¿Cómo puede clasificar los procesos cromatográficos según los ecanismos por los que
se separan los analitos?
3. ¿Cuáles son los componentes básicos de cualquier sistema cromatográfico?
4. ¿Cómo clasifica las técnicas cromatográficas según el estado de agregación de la fase
móvil?
5. ¿Cómo clasifica a las cromatografías según el soporte utilizado?
6. Defina y explique el parámetro que se utiliza en una cromatografía plana y en una
cromatografía en columna asociado a un analito.
7. ¿Cuáles son las partes constitutivas de un cromatógrafo gaseoso? ¿Cuál es el orden de
estos componentes?
8. ¿Qué tipo de columnas pueden utilizarse en la cromatografía gas-líquido?
9. ¿En el caso de las cromatografías en columna a que llamamos cromatograma? ¿Qué
parámetros puedo obtener en el mismo?
10. ¿Cómo se calcula la eficiencia de una cromatografía en base a los datos del
cromatograma?
11. ¿Cómo se calcula la resolución de una cromatografía? ¿Qué significado tiene este
parámetro?
12. ¿Cómo se puede mejorar experimentalmente la eficiencia de una cromatografía en
columna?
13. ¿Qué tipo de cromatografía puede utilizar para ablandar un agua? ¿Qué tipo de
sustancia utiliza como soporte?
14. ¿Cómo funcionan las resinas de intercambio iónico?
15. Una vez agotadas las resinas de intercambio, ¿cómo puede regenerarlas?
16. ¿En la cromatografía de papelque realizó en el trabajo práctico, cuál es fenómeno que
permite la separación?
17. En la cromatografía de papel ¿cuál es la fase estacionaria, la fase móvil y cuál es el
soporte que se emplea?

15
18. Explique los procesos de sembrado, desarrollo y revelado del cromatograma en la
cromatografía de papel.
19. ¿Qué es el Rf? ¿Para qué se utiliza? ¿Qué valores puede tomar? ¿Qué significan?

Problemas
1- El dibujo muestra los resultados obtenidos en una cromatografía
plana en la que se estudió la presencia de un pesticida (P) en la
cáscara de 3 duraznos (D1, D2 yD3). De acuerdo a los datos
obtenidos, ¿qué puede concluir sobre la posible contaminación de los
duraznos con el pesticida?
2- Los cromatogramas de los compuestos A y B que se muestran en la figura se obtuvieron
empleando dos columnas de la misma longitud y con el mismo caudal

a) ¿Cuál de las dos columnas es más eficiente para los analitos A y B?

b) ¿Qué columna tiene mayor resolución?
3- El cromatograma de una mezcla de especies A, B, C y D proporcionó los siguientes
datos:
Tiempo de retención en min Ancho de la base en min

No retinada 3,1 -

A 5,4 0,41

B 13,3 1,07

C 14,1 1,16

D 21,6 1,72

Calcular: el tiempo de retención neto, la eficiencia para cada analito y la resolución. A

partir de los resultados obtenidos para la resolución indique si los componentes han
sido separados satisfactoriamente.

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