Reyes - Roca - Rodriguez - Laboratorio Purificación y Cinética Enzimática

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO CÓDIGO DE DOCUMENTO:
DCVI-INF-V1-2019-015
CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA
DEPARTAMENTO: CARRERA: ☐Ing. Agropecuaria ☒Ing. Biotecnología
AGRICULTURA
PERíODO
ASIGNATURA: Enzimología MAY21-SEP21 NIVEL: VI
LECTIVO:
DOCENTE: Rodrigo Avalos NRC: 5273 PRÁCTICA N°: 2
ESTUDIANTE(s): Reyes Angie, Roca Emilia y Rodriguez Gabriela

TEMA DE LA
Purificación y cinética de la enzima Cardosina A y B :
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
La elaboración de quesos se ha convertido en una herramienta indispensable dado el amplio consumo de este a nivel mundial. Y
son precisamente ciertas enzimas las que inducen el proceso,se conoce desde 1992 el uso del cuajo como tratamiento de la leche
para la elaboración de quesos, existen varios beneficios en relación al consumo de lácteos, entre ellos está ciertos estudios que
relacionan este consumo con la disminución de la presión arterial(Paul & Hekken, 2011; (Llorente, 2002).
Dentro de la producción de quesos de forma tradicional se ha usado el cuajo que se obtiene del estómago de mamíferos lactantes.
Su contenido principal es la quimosina, la endopeptidasa aspártica responsable de la hidrólisis específica del enlace Phe105-Met106
de la κ-caseína bovina, en el momento que este enlace se rompe el macro péptido se difunde en el suero, disminuye la actividad
estabilizante y al ser hidrolizada suficiente κ-caseína se da la coagulación (Llorente, 2002).
Las enzimas proteolíticas tienen una misma función, que es la escisión de un enlace carbono-nitrógeno entre dos aminoácidos en
un péptido o proteína, pero son muy diversas. Tienen distintos mecanismos catalíticos. En su mayoría las enzimas proteolíticas son
peptidasas que activan una molécula de agua que da como resultado la hidrólisis del enlace peptídico, estas son las hidrolasas. Hay
seis nucleófilos diferentes que provocan la hidrólisis. En tres de estos, el agua activada se une a residuos de ácido aspártico
(peptidasas aspárticas), residuos de ácido glutámico (peptidasas glutámicas) o uno o dos iones metálicos (metalopeptidasas)
(Rawlings & Bateman, 2019).
Las peptidasas son utilizadas en variados procesos tecnológicos, como la tiernización de carnes, la elaboración de cerveza y de
quesos, la panificación, detergentes y el procesado de fibras textiles y cueros, además de su utilización en la industria farmacéutica
y en el tratamiento de efluentes industriales. Es decir que su uso es de alto espectro y con gran importancia económica. A nivel
vegetal se han aislado y caracterizado pocas especies de plantas (Llorente, 2002).
Dentro de las peptidasas aspárticas hay dos nuevas peptidasas en los estigmas frescos que son la cardosinas A y B. Especificamente
en los estigmas de flores frescas de cardo, las cardosinas A y B se expresan en la parte femenina de las flores (pistilo) desde estadios
tempranos del desarrollo floral hasta estadios senescentes.La cardosina A tiene una estructura cristalográfica e incluye
dos moléculas glicosiladas que se mantienen unidas por interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno
con un peso molecular de 28 y 14 kDa respectivamente, tienen un mecanismo proteolíticos mediados por
adhesión, los cuales estan asociados con el crecimiento del tubo polínico. La cardosina B posee dos cadenas
de 30 y 14 kDa respectivamente y tiene tiene un rol en defensa o en la interacción polen-pistilo (Llorente, 2002).
Cynara cardunculus
Cynara cardunculus L.es una especie de planta mediterránea que posee tres variedades, a saber, la var. sylvestris (L.) Fiori (cardo
salvaje), var. scolymus (L.) Fiori (alcachofa) y var. altilis (DC) (cardo cultivado). Se caracteriza por una alta producción de biomasa y
metabolitos secundarios y por una buena adaptación al cambio climático, además logra su crecimiento en ambiente estresante, que
se asocia con una mejor biosíntesis de compuestos biológicamente activos en estas plantas, finalmente son una buena fuente de
grasas y proteínas, mientras que también contienen cantidades considerables de K, Mg y Fe y poca cantidad de Na (Pappalardo
et al., 2020; Petropoulos et al., 2019). El cardo se ha cultivado en gran medida dado sus tallos carnosos y pecíolos de las hojas. Es
usado en países europeos, como fuente de proteínas aspárticas para la coagulación de la leche durante la fabricación de queso de
oveja, además tiene uso en la medicina tradicional y aplicaciones industriales relacionadas como producción de celulosa y papel,
generación de energía, calefacción , et (Faria et al., 2018).
Este estudio es de gran aporte científico ya que dado su amplio uso y descubrimiento de presencia de peptidasas en el Cynara
cardunculus L. Esto se facilita mediante el uso de cultivo in vitro de células para producción de metabolitos así se evita problemas
CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

climáticos y sanitarios, por lo que constituye una importante herramienta para la producción continua de peptidasas y para realizar
estudios celulares y metabólicos (Llorente, 2002).
En el presente trabajo se estudiaron las peptidasas coagulantes de la leche presentes en flores de cardo (Cynara cardunculus L.)
Green Globe. Las peptidasas de flores maduras fueron aisladas, purificadas y caracterizadas, se debe tomar en cuenta antes del
proceso de análisis la realización de la prueba de biuret (Llorente, 2002).
Prueba con reactivo de Biuret
La prueba de Biuret se fundamenta en el uso del hidróxido de potasio, sulfato cúprico y tartrato de sodio y potasio. El hidróxido con
el fin de alcalinizar el medio y hacer estable la reacción, el tartrato evita la formación de hidróxidos de sodio y el sulfato reacciona
con la proteína. Este es un método que detecta la presencia de compuestos de tres o más enlaces peptídicos y, por tanto, sirve para
todas las proteínas y péptidos cortos. El reactivo de Biuret consiste en una solución acuosa de sulfato cúprico (CuSO4) en medio
alcalino (NaOH). Este reactivo da un ensayo positivo con los enlaces peptídicos entre aminoácidos, cuando la solución queda de
color violeta. Esto se debe a que el cobre tiene la propiedad de formar iones complejos, especialmente entre los enlaces peptídicos
(Gil, 2019; Ramírez, y Reyes, 2003).
Aislamiento y purificación de proteínas vegetales
Aislamiento de proteínas
La extracción de proteínas se da según su naturaleza y estabilidad, ya que tiene menor contenido de proteínas y contienen en sus
vacuolas peptidasas, alcaloides y compuestos polienólicos estos pueden interferir en la actividad proteica.La primera etapa en el
aislamiento de una proteína es su liberación de las células que la contienen. Como métodos de ruptura mecánica de las células
vegetales para liberar sus proteínas se pueden mencionar: 1) trituración con arena o alúmina, 2) trituración en mezclador de alta
velocidad, 3) homogenizador a piston, 4) prensa francesa, 5) sonicación y 6) congelación con nitrógeno líquido y macerado. Existen
varios métodos de extracción como son la extracción con buffer acuoso,con detergentes,precipitación directa con TCA, con acetona
y con TCA-acetona. Para evitar proteolisis se extraer con buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato), mediante un cóctel de
inhibidores de peptidasas al buffer de extracción, y uso de agentes protectores (Llorente, 2002)..
Purificación de proteínas
Se realiza la purificación de proteínas mediante procedimientos de fraccionamiento. Se debe considerar ciertas características como
la solubilidad, carga iónica, tamaño molecular, propiedades de absorción y capacidad de unión a otras moléculas biológicas
Solubilidad
Los múltiples grupos ácido-base de una proteína determinan que sus propiedades de solubilidad dependen de la concentración de
las sales disueltas, de la polaridad del disolvente, del pH y de la temperatura (Llorente, 2002).
Separaciones cromatográficas
La fase móvil de una cromatografía consiste en una mezcla de sustancias que se fraccionaran disueltas en un líquido, que fluye por
una columna de una matriz porosa, que constituye la fase estacionaria.
Las interacciones de los solutos individuales con la fase estacionaria determinan que cada componente migre con velocidades
diferentes y que la mezcla se separe en bandas de sustancias puras. Entre los métodos cromatográficos tenemos cromatografía de
intercambio iónico, de adsorción, de exclusión molecular, de interacción hidrofóbica o de afinidad
Separaciones electroforéticas (Llorente, 2002).
Este es un método analítico de alto poder resolutivo capaz de separar moléculas biológicas cargadas por la combinación de su
migración en un campo eléctrico y el efecto de tamizado molecular a través de un gel de corrida. Ya que las proteínas con moléculas
anfotéricas polivalentes, migran en un campo eléctrico de acuerdo con su carga neta,esto depende de la carga macromolecular,
tamaño y forma, y de propiedades fisicoquímicas del medio electroforético.A agregar detergente SDS a la solución proteica se
separan todos tipos de proteínas, incluyendo las insolubles en agua. Así la electroforesis separa los polipéptidos en función de su
tamaño, proporcionándonos su peso molecular. Finalmente al agregar un agente reductor como el β-mercaptoetanol reduce los
enlaces disulfuro que pudieran existir en las proteínas, para lograr visualizar todos los polipéptidos constitutivos de las moléculas
poliméricas (Llorente, 2002).
OBJETIVOS:
General
● Purificar y analizar la cinética de la enzima Cardosina A y B

Específicos
● Realizar el cultivo, obtención de la planta y finalmente el extracto de Cynara cardunculus L
● Purificar el extracto crudo de Cynara cardunculus L
● Calcular y analizar la cinética de la enzima.
MATERIALES:
REACTIVOS:
● NaClO
● HgCl2
● Agua destilada INSUMOS:
● Agua estéril ● Medio MS
● Ácido ascórbico ● Tubos de ensayo
● Ácido cítrico ● Cajas Petri
● BA ● Papel filtro
● ANA ● Columna Pharmacia
● EDTA ● Columna de DEAE-Sepharose Fast Flow
● Buffer fosfato potásico 0,1 M, de pH 7 ● Zimograma con gelatin
● Buffer fosfato de potasio 0,1 M de pH 6
● NaOH
● Ácido tricloroacético
EQUIPOS:
● Centrífuga
● Vortex
● Espectrofotómetro
MUESTRA:
● Extracto crudo de flores Cynara cardunculus L
Instrucciones
Bioseguridad:
● Uso de mandil, guantes, gafas de protección.
● Cumplir las normas de buenas prácticas de laboratorio.
PROCEDIMIENTO:
MATERIAL VEGETAL
Selección del material
● Usar plantas de Cynara cardunculus L de los cultivares Green Globe y Francés Precoz cultivadas a campo en Nogoyá
● Elegir los explantes de las yemas apicales de Cynara cardunculus L cv. Francés Precoz
Desinfección del material vegetal para cultivo in vitro
● Lavar bien el material vegetal.
● Esterilizar con HgCl2 (5 g l-1) durante 5 minutos y NaClO al 17 % (1 g/l de cloro activo) durante 10 minutos.
● Enjuagar 3 veces con agua destilada estéril,
● Mantener las yemas en una solución antioxidante con ácido ascórbico (100 mg l-1) y ácido cítrico (150 mg l-1).
● Esterilizar con solución de HgCl2 (5 g l-1) durante 5 minutos, NaClO al 20 % por 20 minutos y finalmente enjuagadar 3
veces con agua estéril.
Cultivo in vitro
● Cultivar en un medio constituido por sales MS modificadas por la reducción a la mitad de concentración de los componentes
nitrogenados y suplementadas con tiamina.HCl (0,4 mg/ l), piridoxina (0,5 mg/ l), ácido nicotínico (0,5 mg/ l), mioinositol (100
mg/ l), sacarosa (30 g/ l), agar (8 g/ l), ANA (5 mg/ l) y BA (2 mg/ l).
● Ajustar el pH de los medios de cultivo a 5,8

● Incubar a 24 ± 2°C y en oscuridad.
● Transferir los callos al medio base con BA (0,1 mg l-1) y ANA (0,1; 2,5 y 5 mg/ l),
● Cultivar en oscuridad a 24 ± 2°C. A los 7, 14, 21 y 28 días y evaluar el peso fresco y seco, y las proteínas totales.
Obtención de las plantas mediante aclimatación en campo.
EXTRACTIVOS VEGETALES
Obtención de preparaciones crudas
● Macerar en trituradora eléctrica el material vegetal con buffer fosfato potásico 0,1 M; de pH 7
● Agregar EDTA 5 mM y cisteína 5 mM.
● Extraer con agitación suave e intermitente y en baño de hielo-agua para prevenir la proteólisis.
● Filtrar mediante gasa doble y se centrifugó a 16000 g durante 20 minutos a 4°C en una centrífuga refrigerada Sorval.
● Verificar la existencia de gomas y otros materiales insolubles y remover.
● Filtrar el sobrenadante a través de papel y se conservó a -20°C hasta su análisis.
Obtención de polvos acetónicos
● Realizar un homogeneizando de las muestras frescas (10 g) en una trituradora con acetona fría a -20°C (30 ml) y en baño
de hielo.
● Filtrar por tamiz de malla gruesa recibiendo sobre filtro Buchner, se lavó con acetona fría y secó al vacío.
● Conservar en frascos herméticos en heladera hasta su uso.
● Los polvos acetónicos de cada tejido se obtuvieron mediante la suspensión del polvo con 30 ml de buffer fosfato de potasio
0,1 M de pH 6, conteniendo EDTA 5 mM y cisteína 5 mM, con agitación, durante 60 minutos y a 4°C.
● Centrifugar a 16000 g durante 30 minutos a 4°C y se descartó el precipitado
● Congelar el sobrenadante a -20°C hasta su análisis.
Peso fresco y seco
● El peso fresco de los callos se determina después de eliminar la humedad superficial con papel absorbente
● El peso seco se evalua secando en estufa a 65 °C hasta peso constante.
● Se determina pesando el pellet obtenido después de centrifugar los cultivos a 16000 g en centrífuga refrigerada durante
20 minutos sobre papeles de filtro y expresar los resultados en g/l.
Prueba de biuret
● Colocar 100 ul de la muestra en un tubo de ensayo
● Añadir 2 ml de hidróxido de sodio y se homogeneizó
● Colocar 5 ml del reactivo de Biuret, se mezcló y se dejó reposar durante 25 min a temperatura ambiente.
● Se observó el cambio o ausencia de cambio en la coloración y se midió electroforeticamente.
Curva de calibración
● Mediante la albúmina sérica bovina como patrón spreparar cuatro soluciones de 10, 25, 50 y 100 % (p/v).
● Relacionar con concentraciones conocidas y se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.
● Mediante las concentraciones conocidas, leer las absorbancias y se hacer la curva de calibración.
● Se usó como patrón de calibración la albúmina sérica bovina al 0,1-2 mg/ml.
● Medir con espectrofotómetro a 540 nm.
Prueba en tubo
Actividad coagulante
● A baño maría 37 ± 0,2°C se colocar tubos con 500 µl de los extractos crudos
● Agregar 3 ml de una solución al 10 % (p/v) de leche descremada en polvo en solución de CaCl2 10 mM.
● Introducir un tubo con tinta azul en el interior del tubo de reacción.
● La prueba se realiza por triplicado y como control negativo
● A 500 µl de leche descremada se adiciono 100 µl de los extractos de callos
● Observar el tiempo de floculación
● Una unidad de actividad coagulante de la leche (UCL) se definió como la cantidad de enzima necesaria para coagular 1 ml
de leche en 40 minutos
● Expresar la actividad específica como UCL por mg de proteína
ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
● Determinar la actividad proteolítica en los diferentes materiales vegetales usando como sustrato la caseína.
Caseína
● Preparar cuatro soluciones al 10, 25, 50 y 100 % de caseína tipo Hammersten con NaOH 0,1 M y llevando a 100 ml con
buffer fosfato de potasio 0,1 M de pH 6.
● Poner a baño maría por 20 minutos
● Filtrar por papel en caliente, se ajustó el pH a 6 y se llevó a volumen con agua destilada.
● Mezclar 0,5 ml de solución de enzima y 5,5 ml de caseína al 10, 25, 50 y 100 % (p/v) e incubar en baño maría a 37°C
durante 30 minutos.
● Añadir 1,8 ml de ácido tricloroacético al 5 % (p/v) para detener la reacción.
● Para los blancos colocar el ácido tricloroacético a la enzima y posteriormente el sustrato.
● Centrifugar 4000 g durante 20 minutos y la absorbancia de los sobrenadantes se midió a 280 nm
● Para expresar la actividad enzimática con sustratos proteicos, defina para este caso una unidad enzimática arbitraria (Ucas,
unidad caseinolítica) como la cantidad de enzima requerida para producir un incremento de una unidad de absorbancia a
280 nm.
PROTEÍNAS TOTALES
● El contenido proteico determinar utilizando el método de Bradford
● Las curvas de calibración confeccionar utilizando seroalbúmina bovina en el rango 0,1 a 1 mg / ml para el ensayo estándar
y entre 5 y 100 µg / ml para el microensayo.
● En este último la mezcla de reacción consiste en 200 µl de muestra con 2 ml del reactivo de Bradford, y el otro con 50 µl
de muestra a 2,5 ml de reactivo.
● La lectura se realizar a 595 nm dentro de los 30 minutos.
PURIFICACIÓN DE LAS PREPARACIONES CRUDAS
● Los extractos crudos de las flores someter a una primera purificación utilizando la precipitación fraccionada con sulfato de
amonio
● Separar las fracciones con actividad proteolítica mediante cromatografía de intercambio aniónico (DEAESepharose),
● Establecer el grado de purificación alcanzado en cada etapa y el porcentaje de recuperación de la actividad proteolítica.
● El peso molecular relativo estimar por cromatografía de exclusión molecular y por SDS-PAGE y la masa molecular por
espectrometría de masa para determinar el grado de pureza.
● La aplicación de isoelectroenfoque permite establecer el grado de homogeneidad y el valor del punto isoeléctrico de cada
una de las fracciones activas.
● La actividad proteolítica en los geles detectar mediante zimogramas con gelatina
Precipitación fraccionada con sulfato de amonio
● Los extractos crudos obtenidos con buffer fosfato de potasio 0,1 M y a pH 7 precipitar fraccionadamente con sulfato de
amonio al 30, 45, 60 y 80 %.
● Agregar el sulfato de amonio lentamente y con agitación suave a la muestra colocar en hielo hasta llegar al 30 % de
saturación.
● Luego de 30 min la concentración de (NH4)2SO4 deseada y la mezcla centrifugar a 16000 g durante 20 minutos y a 4°C.
● Al sobrenadante, agregar (NH4)2SO4 hasta obtener el 45 % de saturación y así sucesivamente se continuar con la
precipitación fraccionada.
● Los precipitados fueron redisolver con buffer fosfato 0,1 M de pH 6.
● Las muestras desaladar por pasaje en columna con Sephadex G-25 (Pharmacia) usando como solvente de elución buffer
fosfato 0,1 M de pH 6.
● Medir la absorbancia a 280 nm y se colectaron 10 ml de cada una de las cuatro fracciones precipitadas con (NH4)2SO4 de
los eluidos con alta absorbancia.
Cromatografía de intercambio iónico

● Para purificar el extracto crudo y el precipitado con sulfato de amonio utilizar una columna Pharmacia K 15/30 (1,5 cm x 30
cm) rellena con 30 ml de DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrada con buffer fosfato potásico 50 mM de pH 6 y
con gradientes salinos de NaCl
● Con un volumen de elución de 180 ml, recoger fracciones de 2 ml. L, la velocidad de flujo fue de 45 cm3 h-1 y medir los
valores de absorbancia a 280 nm
Extracto de flor precipitado con sulfato de amonio
● Con sulfato de amonio obtener un precipitado al 80 % del extractivo de las flores tratado fraccionadamente
● Disolver en 10 ml de buffer y purificar en la columna de DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrada con buffer
fosfato de potasio 50 mM de pH 6.
● La elución realizarla con un gradiente lineal de NaCl (0 a 0,9 M) en el mismo buffer
● El pool de las fracciones con actividad proteolítica (10 ml cada una) recromatografiar, eluyendo con un gradiente de NaCl
0,3 a 0,6 M.
CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS DE PUREZA DE LOS EXTRACTOS ENZIMÁTICOS
Electroforesis bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)
● Realizar la técnica descrita por Laemmli
● Los geles (7 cm x 8 cm x 0,75 mm) con una concentración de acrilamida del 14 % en el gel de resolución, 5 % en el gel
concentrador (stacking) y el agregado de SDS
● El buffer de corrida utilizar Tris-glicina pH 8,3 y β-mercaptoetanol.
● Los extractivos vegetales solubilizar en buffer de muestra a una concentración de 1 µg µl -1 de proteínas y centrifugados a
16000 g,
● Se escanearon los geles y se analizaron utilizando el programa Scion Image
● Para determinar los pesos moleculares usar una curva de calibración obtenida al graficar los logaritmos de los pesos
moleculares de las proteínas patrones en función de la movilidad relativa de cada especie proteica.
Actividad enzimática en geles
Detectar en geles nativos o en SDS-PAGE si las muestras son preparadas sin reducción ni calentamiento y si son
renaturalizadas después de la electroforesis.
Zimograma con gelatina incluída
● Realizar electroforesis nativas y SDS-PAGE en condiciones no desnaturalizantes con geles de resolución al 14 % y stacking
al 5 %,
● Se agregó la gelatina al 0,7 % previamente a la polimerización.
● Luego de la electroforesis, colocar los geles en buffer cítrico-citrato 0,1 M de pH 4 por 2 horas a 37°C o toda la noche a
temperatura ambiente.
● Detener la proteolisis al transferir los geles a la solución colorante (Coomassier Blue R-250).
● Visualizar las proteínas con actividad proteolítica sobre gelatina como bandas no teñidas sobre el fondo oscuro del gel.
EFECTO DE ACTIVADORES E INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
● Determinar mediante el preincubando las muestras con el activador o inhibidor durante 30 minutos a 37°C y estimando la
actividad caseinolítica residual a pH 6
● Evaluar el inhibidor pepstatina A (1 µM) y fenilmetilsulfonil fluoruro (1 mM).
● Realizar una preincubando las preparaciones enzimáticas con el solvente utilizado para disolver los activadores o
inhibidores.
● Realizar para ver el grupo al que pertenecen las peptidasas.
RESULTADOS OBTENIDOS:
Tabla 1: Resultados de la prueba de Biuret.

Proteínas
Muestra Color Resultado
(mg)
Extracto Crudo

Tabla 2: Etapas de purificación para Cardosina
%
Etapa Proteína (mg/ml) AT (U) AE (U/mg) GP
Recuperación
Extracción
Primera Purificación
Segunda Purificación
EXTRACCIÓN, 1era PURIFICACIÓN Y 2da PURIFICACIÓN
Tabla 3: Velocidades en función de las concentraciones

Concentraciones [S]
Vo (U/mg)
(mg/ml)
Tabla 4: Linealización de Lineweaver-Burk
1/S 1/V
Tabla 5: Linealización de Eadie Hofstee
Vo Vo/S
Tabla 6. Constantes cinéticas en los diferentes procedimientos
Km
Etapa Ecuación de Linealización Vmax (umol/min)
(mg/ml)
Extracto crudo
Primera purificación
Segunda purificación

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
Tabla 7. Acción del inhibidor pepstatina A
Vo (U/mg)
Concentraciones [S]
(mg/ml) [I]=0 [I]= 1μM
Tabla 8. Linealización
1/S 1/Io 1/I1
Tabla 9. Valores de Km y Vmax
Sin inhibidor Con inhibidor

Km 2.166 3.919
Vmax 1666.66 138.88
Ki - 0.091
Grado de inhibición
[𝐼]
𝜀=
[𝑆𝑜]
[𝐼] + 𝐾𝑖 (1 + )
𝐾𝑚
CONCLUSIONES
● Las peptidasas son utilizadas en variados procesos tecnológicos, sin embargo la obtención de peptidasas a nivel vegetal
es baja.
● La cardosinas A y B son peptidasas aspárticas localizadas en los estigmas frescos y son utilizados para lograr la actividad
coagulante de la leche.
● La flor de cardo Cynara cardunculus L.es una especie considerada como fuente de proteínas aspárticas para la coagulación
de la leche durante la fabricación de queso de oveja.
● Para la actividad proteolítica se usa como sustrato la caseína y se realiza el cálculo de las proteínas totales mediante el
método de Bradford, además es necesario el uso de inhibidores y activadores con el fin de determinar el grupo al que
pertenecen las peptidasas.
● Para la purificación se debe realizar un precipitado fraccionada con sulfato de amonio, una cromatografía de intercambio
iónico, y se debe realizar la caracterización y análisis de pureza de los extractos enzimáticos mediante electroforesis con
SD-PAGE y el uso de zimograma con gelatina para la actividad.
RECOMENDACIONES

● Se debe considerar la solubilidad, carga iónica, tamaño molecular, propiedades de absorción y capacidad de unión a otras
moléculas biológicas para el proceso de purificación.
● Se debe usar un buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato) para evitar procesos de proteolisis.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA:
Faria, E. L. P., Gomes, M. V., Cláudio, A. F. M., Freire, C. S. R., Silvestre, A. J. D., & Freire, M. G. (2018). Extraction and
recovery processes for cynaropicrin from Cynara cardunculus L. using aqueous solutions of surface-active ionic liquids.
Biophysical Reviews, 10(3), 915-925. https://doi.org/10.1007/s12551-017-0387-y
Gil, M. (2019, julio 3). Biuret: Fundamento, reactivos, procedimiento, usos. Lifeder. https://www.lifeder.com/biuret/
Llorente, B. E. (2002). Aislamiento, purificación, caracterización y producción in vitro de peptidasas de alcaucil
coagulantes de la leche [Doctor en Ciencias Exactas, área Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de La Plata].
https://doi.org/10.35537/10915/2211
Paul, M., & Hekken, D. L. V. (2011). Short communication: Assessing antihypertensive activity in native and model Queso
Fresco cheeses1. Journal of Dairy Science, 94(5), 2280-2284. https://doi.org/10.3168/jds.2010-3852
Rawlings, N. D., & Bateman, A. (2019). Origins of peptidases. Biochimie, 166, 4-18.
https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.07.026
Ramírez, J., Reyes, A. (2003). Manual de prácticas de laboratorio de biología. México: Pearson Educación . Recuperado
de: https://books.google.com.mx/books?id=xBxiLyO2uYEC&pg=RA1-PA20&dq=practica+carbohidratos+lugol&hl=es-
419&sa=X&ved=2ahUKEwjMkMrT3Z3sAhUMP60KHYypBvoQ6AEwBHoECAUQAg#v=onepage&q&f=false
FIRMAS EVALUACIÓN
F: ………………...………………………. F: …………………..………………………. …………………………………

Nombre: Nombre: Nota:
ALUMNO / RESPONSABLE DOCENTE / INSTRUCTOR

CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA
DEPARTAMENTO: CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología
AGRICULTURA
PERíODO
ASIGNATURA: Enzimología MAY21-SEP21 NIVEL: VI
LECTIVO:
DOCENTE: Rodrigo Avalos NRC: 5273 PRÁCTICA N°: 2
ESTUDIANTE(s): Reyes Angie, Roca Emilia y Rodriguez Gabriela

TEMA DE LA
Purificación y cinética de la enzima Cardosina A y B :
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
La elaboración de quesos se ha convertido en una herramienta indispensable dado el amplio consumo de este a nivel mundial. Y
son precisamente ciertas enzimas las que inducen el proceso,se conoce desde 1992 el uso del cuajo como tratamiento de la leche
para la elaboración de quesos, existen varios beneficios en relación al consumo de lácteos, entre ellos está ciertos estudios que
relacionan este consumo con la disminución de la presión arterial(Paul & Hekken, 2011; (Llorente, 2002).
Dentro de la producción de quesos de forma tradicional se ha usado el cuajo que se obtiene del estómago de mamíferos lactantes.
Su contenido principal es la quimosina, la endopeptidasa aspártica responsable de la hidrólisis específica del enlace Phe105-Met106
de la κ-caseína bovina, en el momento que este enlace se rompe el macro péptido se difunde en el suero, disminuye la actividad
estabilizante y al ser hidrolizada suficiente κ-caseína se da la coagulación (Llorente, 2002).
Las enzimas proteolíticas tienen una misma función, que es la escisión de un enlace carbono-nitrógeno entre dos aminoácidos en
un péptido o proteína, pero son muy diversas. Tienen distintos mecanismos catalíticos. En su mayoría las enzimas proteolíticas son
peptidasas que activan una molécula de agua que da como resultado la hidrólisis del enlace peptídico, estas son las hidrolasas. Hay
seis nucleófilos diferentes que provocan la hidrólisis. En tres de estos, el agua activada se une a residuos de ácido aspártico
(peptidasas aspárticas), residuos de ácido glutámico (peptidasas glutámicas) o uno o dos iones metálicos (metalopeptidasas)
(Rawlings & Bateman, 2019).
Las peptidasas son utilizadas en variados procesos tecnológicos, como la tiernización de carnes, la elaboración de cerveza y de
quesos, la panificación, detergentes y el procesado de fibras textiles y cueros, además de su utilización en la industria farmacéutica
y en el tratamiento de efluentes industriales. Es decir que su uso es de alto espectro y con gran importancia económica. A nivel
vegetal se han aislado y caracterizado pocas especies de plantas (Llorente, 2002).
Dentro de las peptidasas aspárticas hay dos nuevas peptidasas en los estigmas frescos que son la cardosinas A y B. Especificamente
en los estigmas de flores frescas de cardo, las cardosinas A y B se expresan en la parte femenina de las flores (pistilo) desde estadios
tempranos del desarrollo floral hasta estadios senescentes.La cardosina A tiene una estructura cristalográfica e incluye
dos moléculas glicosiladas que se mantienen unidas por interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno
con un peso molecular de 28 y 14 kDa respectivamente, tienen un mecanismo proteolíticos mediados por
adhesión, los cuales estan asociados con el crecimiento del tubo polínico. La cardosina B posee dos cadenas
de 30 y 14 kDa respectivamente y tiene tiene un rol en defensa o en la interacción polen-pistilo (Llorente, 2002).
Cynara cardunculus
Cynara cardunculus L.es una especie de planta mediterránea que posee tres variedades, a saber, la var. sylvestris (L.) Fiori (cardo
salvaje), var. scolymus (L.) Fiori (alcachofa) y var. altilis (DC) (cardo cultivado). Se caracteriza por una alta producción de biomasa y
metabolitos secundarios y por una buena adaptación al cambio climático, además logra su crecimiento en ambiente estresante, que
se asocia con una mejor biosíntesis de compuestos biológicamente activos en estas plantas, finalmente son una buena fuente de
grasas y proteínas, mientras que también contienen cantidades considerables de K, Mg y Fe y poca cantidad de Na (Pappalardo
et al., 2020; Petropoulos et al., 2019). El cardo se ha cultivado en gran medida dado sus tallos carnosos y pecíolos de las hojas. Es
usado en países europeos, como fuente de proteínas aspárticas para la coagulación de la leche durante la fabricación de queso de
oveja, además tiene uso en la medicina tradicional y aplicaciones industriales relacionadas como producción de celulosa y papel,
generación de energía, calefacción , et (Faria et al., 2018).
Este estudio es de gran aporte científico ya que dado su amplio uso y descubrimiento de presencia de peptidasas en el Cynara
cardunculus L. Esto se facilita mediante el uso de cultivo in vitro de células para producción de metabolitos así se evita problemas
climáticos y sanitarios, por lo que constituye una importante herramienta para la producción continua de peptidasas y para realizar
estudios celulares y metabólicos (Llorente, 2002).
En el presente trabajo se estudiaron las peptidasas coagulantes de la leche presentes en flores de cardo (Cynara cardunculus L.)
Green Globe. Las peptidasas de flores maduras fueron aisladas, purificadas y caracterizadas, se debe tomar en cuenta antes del
proceso de análisis la realización de la prueba de biuret (Llorente, 2002).
Prueba con reactivo de Biuret
La prueba de Biuret se fundamenta en el uso del hidróxido de potasio, sulfato cúprico y tartrato de sodio y potasio. El hidróxido con
el fin de alcalinizar el medio y hacer estable la reacción, el tartrato evita la formación de hidróxidos de sodio y el sulfato reacciona
con la proteína. Este es un método que detecta la presencia de compuestos de tres o más enlaces peptídicos y, por tanto, sirve para
todas las proteínas y péptidos cortos. El reactivo de Biuret consiste en una solución acuosa de sulfato cúprico (CuSO4) en medio
alcalino (NaOH). Este reactivo da un ensayo positivo con los enlaces peptídicos entre aminoácidos, cuando la solución queda de
color violeta. Esto se debe a que el cobre tiene la propiedad de formar iones complejos, especialmente entre los enlaces peptídicos
(Gil, 2019 ; Ramírez, y Reyes, 2003).
Aislamiento y purificación de proteínas vegetales
La extracción de proteínas se da según su naturaleza y estabilidad, ya que tiene menor contenido de proteínas y contienen en sus
vacuolas peptidasas, alcaloides y compuestos polienólicos estos pueden interferir en la actividad proteica.La primera etapa en el
aislamiento de una proteína es su liberación de las células que la contienen. Como métodos de ruptura mecánica de las células
vegetales para liberar sus proteínas se pueden mencionar: 1) trituración con arena o alúmina, 2) trituración en mezclador de alta
velocidad, 3) homogenizador a piston, 4) prensa francesa, 5) sonicación y 6) congelación con nitrógeno líquido y macerado. Existen
varios métodos de extracción como son la extracción con buffer acuoso,con detergentes,precipitación directa con TCA, con acetona
y con TCA-acetona. Para evitar proteolisis se extraer con buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato), mediante un cóctel de
inhibidores de peptidasas al buffer de extracción, y uso de agentes protectores (Llorente, 2002)..
Purificación de proteínas
Se realiza la purificación de proteínas mediante procedimientos de fraccionamiento. Se debe considerar ciertas características como
la solubilidad, carga iónica, tamaño molecular, propiedades de absorción y capacidad de unión a otras moléculas biológicas
Solubilidad
Los múltiples grupos ácido-base de una proteína determinan que sus propiedades de solubilidad dependen de la concentración de
las sales disueltas, de la polaridad del disolvente, del pH y de la temperatura (Llorente, 2002).
Separaciones cromatográficas
La fase móvil de una cromatografía consiste en una mezcla de sustancias que se fraccionaran disueltas en un líquido, que fluye por
una columna de una matriz porosa, que constituye la fase estacionaria.
Las interacciones de los solutos individuales con la fase estacionaria determinan que cada componente migre con velocidades
diferentes y que la mezcla se separe en bandas de sustancias puras. Entre los métodos cromatográficos tenemos cromatografía de
intercambio iónico, de adsorción, de exclusión molecular, de interacción hidrofóbica o de afinidad
Separaciones electroforéticas (Llorente, 2002).
Este es un método analítico de alto poder resolutivo capaz de separar moléculas biológicas cargadas por la combinación de su
migración en un campo eléctrico y el efecto de tamizado molecular a través de un gel de corrida. Ya que las proteínas con moléculas
anfotéricas polivalentes, migran en un campo eléctrico de acuerdo con su carga neta,esto depende de la carga macromolecular,
tamaño y forma, y de propiedades fisicoquímicas del medio electroforético.A agregar detergente SDS a la solución proteica se
separan todos tipos de proteínas, incluyendo las insolubles en agua. Así la electroforesis separa los polipéptidos en función de su
tamaño, proporcionándonos su peso molecular. Finalmente al agregar un agente reductor como el β-mercaptoetanol reduce los
enlaces disulfuro que pudieran existir en las proteínas, para lograr visualizar todos los polipéptidos constitutivos de las moléculas
poliméricas (Llorente, 2002).
OBJETIVOS:
General

● Purificar y analizar la cinética de la enzima Cardosina A y B

Específicos
● Realizar el cultivo, obtención de la planta y finalmente el extracto de Cynara cardunculus L
● Purificar el extracto crudo de Cynara cardunculus L
● Calcular y analizar la cinética de la enzima.
MATERIALES:
REACTIVOS:
● NaClO
● HgCl2
● Agua destilada INSUMOS:
● Agua estéril ● Medio MS
● Ácido ascórbico ● Tubos de ensayo
● Ácido cítrico ● Cajas Petri
● BA ● Papel filtro
● ANA ● Columna Pharmacia
● EDTA ● Columna de DEAE-Sepharose Fast Flow
● Buffer fosfato potásico 0,1 M, de pH 7 ● Zimograma con gelatin
● Buffer fosfato de potasio 0,1 M de pH 6
● NaOH
● Ácido tricloroacético
EQUIPOS:
● Centrífuga
● Vortex
● Espectrofotómetro
MUESTRA:
● Extracto crudo de flores Cynara cardunculus L
PROCEDIMIENTO:
MATERIAL VEGETAL
Selección del material
● Se usaron plantas de Cynara cardunculus L de los cultivares Green Globe y Francés Precoz cultivadas a campo en Nogoyá
● Los explantes elegidos fueron las yemas apicales de Cynara cardunculus L cv. Francés Precoz
Desinfección del material vegetal para cultivo in vitro
● Se lavó bien el material vegetal.
● Se esterilizó con HgCl2 (5 g l-1) durante 5 minutos y NaClO al 17 % (1 g/l de cloro activo) durante 10 minutos.
● Se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril,
● Una vez desinfectadas las yemas se mantuvieron en una solución antioxidante con ácido ascórbico (100 mg l-1) y ácido
cítrico (150 mg l-1).
● Se esterilizaron con solución de HgCl2 (5 g l-1) durante 5 minutos, NaClO al 20 % por 20 minutos y finalmente fueron
enjuagadas 3 veces con agua estéril.
Cultivo in vitro
● Se cultivó en un medio constituido por sales MS modificadas por la reducción a la mitad de concentración de los
componentes nitrogenados y suplementadas con tiamina.HCl (0,4 mg/ l), piridoxina (0,5 mg/ l), ácido nicotínico (0,5 mg/ l),
mioinositol (100 mg/ l), sacarosa (30 g/ l), agar (8 g/ l), ANA (5 mg/ l) y BA (2 mg/ l).
● Se ajustó el pH de los medios de cultivo a 5,8
● Se incubaron a 24 ± 2°C y en oscuridad.
● Posteriormente los callos se transfirieron al medio base con BA (0,1 mg l-1) y ANA (0,1; 2,5 y 5 mg/ l),
● Se cultivó en oscuridad a 24 ± 2°C. A los 7, 14, 21 y 28 días fueron evaluados el peso fresco y seco, y las proteínas totales.
Obtención de las plantas mediante aclimatación en campo.
EXTRACTIVOS VEGETALES
Obtención de preparaciones crudas
● Se maceró en trituradora eléctrica el material vegetal con buffer fosfato potásico 0,1 M; de pH 7
● Se agregó de EDTA 5 mM y cisteína 5 mM.
● Se extrajo con agitación suave e intermitente y en baño de hielo-agua para prevenir la proteólisis.
● Se filtró mediante gasa doble y se centrifugó a 16000 g durante 20 minutos a 4°C en una centrífuga refrigerada Sorval.
● Si existe la presencia de gomas y otros materiales insolubles se deben remover.
● Se filtró el sobrenadante a través de papel y se conservó a -20°C hasta su análisis.
Obtención de polvos acetónicos
● Se realizó un homogeneizando de las muestras frescas (10 g) en una trituradora con acetona fría a -20°C (30 ml) y en baño
de hielo.
● Se filtró por tamiz de malla gruesa recibiendo sobre filtro Buchner, se lavó con acetona fría y secó al vacío.
● Se conservaron en frascos herméticos en heladera hasta su uso.
● Los polvos acetónicos de cada tejido se obtuvieron mediante la suspensión del polvo con 30 ml de buffer fosfato de potasio
0,1 M de pH 6, conteniendo EDTA 5 mM y cisteína 5 mM, con agitación, durante 60 minutos y a 4°C.
● Se centrifugó a 16000 g durante 30 minutos a 4°C y se descartó el precipitado
● El sobrenadante se congeló a -20°C hasta su análisis.
Peso fresco y seco
● El peso fresco de los callos se determinó después de eliminar la humedad superficial con papel absorbente
● El peso seco se evaluó secando en estufa a 65 °C hasta peso constante.
● Se determinó pesando el pellet obtenido después de centrifugar los cultivos a 16000 g en centrífuga refrigerada durante
20 minutos sobre papeles de filtro y expresando los resultados en g/l.
Prueba de biuret
● Se colocó 100 ul de la muestra en un tubo de ensayo
● Se añadió 2 ml de hidróxido de sodio y se homogeneizó
● Se colocó 5 ml del reactivo de Biuret, se mezcló y se dejó reposar durante 25 min a temperatura ambiente.
● Se observó el cambio o ausencia de cambio en la coloración y se midió electroforeticamente.
Curva de calibración
● Mediante la albúmina sérica bovina como patrón se prepararon cuatro soluciones de 10, 25, 50 y 100 % (p/v).
● Se relacionó con concentraciones conocidas y se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.
● Mediante las concentraciones conocidas, se leyó las absorbancias y se hizo la curva de calibración.
● Se usó como patrón de calibración la albúmina sérica bovina al 0,1-2 mg/ml.
● Finalmente se midió con espectrofotómetro a 540 nm.
Prueba en tubo
● Actividad coagulante
● A baño maría 37 ± 0,2°C se colocaron tubos con 500 µl de los extractos crudos
● Se agregó 3 ml de una solución al 10 % (p/v) de leche descremada en polvo en solución de CaCl2 10 mM.
● Se introdujo un tubo con tinta azul en el interior del tubo de reacción.
● La prueba fue realizada por triplicado y como control negativo
● A 500 µl de leche descremada se adiciono 100 µl de los extractos de callos
● Se observó el tiempo de floculación
● Una unidad de actividad coagulante de la leche (UCL) se definió como la cantidad de enzima necesaria para coagular 1 ml
de leche en 40 minutos
● La actividad específica se expresó como UCL por mg de proteína
ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
● La actividad proteolítica fue determinada en los diferentes materiales vegetales usando como sustrato la caseína.
Caseína
● Se prepararon cuatro soluciones al 10, 25, 50 y 100 % de caseína tipo Hammersten con NaOH 0,1 M y llevando a 100 ml
con buffer fosfato de potasio 0,1 M de pH 6.
● Se puso a baño maría por 20 minutos
● Se filtró por papel en caliente, se ajustó el pH a 6 y se llevó a volumen con agua destilada.
● Para la mezcla de reacción se usó 0,5 ml de solución de enzima y 5,5 ml de caseína al 10, 25, 50 y 100 % (p/v) y se incubó
en baño maría a 37°C durante 30 minutos.
● Se adicionó 1,8 ml de ácido tricloroacético al 5 % (p/v) para detener la reacción.
● Para los blancos se realizó colocando el ácido tricloroacético a la enzima y posteriormente el sustrato.
● Se centrifugó 4000 g durante 20 minutos y la absorbancia de los sobrenadantes se midió a 280 nm
● Para expresar la actividad enzimática con sustratos proteicos, se definió para este caso una unidad enzimática arbitraria
(Ucas, unidad caseinolítica) como la cantidad de enzima requerida para producir un incremento de una unidad de
absorbancia a 280 nm.
PROTEÍNAS TOTALES
● El contenido proteico se determinó utilizando el método de Bradford
● Las curvas de calibración se confeccionaron utilizando seroalbúmina bovina en el rango 0,1 a 1 mg / ml para el ensayo
estándar y entre 5 y 100 µg / ml para el microensayo.
● En este último la mezcla de reacción consistió en 200 µl de muestra con 2 ml del reactivo de Bradford, y el otro con 50 µl
de muestra a 2,5 ml de reactivo.
● La lectura se realizó a 595 nm dentro de los 30 minutos.
PURIFICACIÓN DE LAS PREPARACIONES CRUDAS
Precipitación fraccionada con sulfato de amonio
● Los extractos crudos obtenidos con buffer fosfato de potasio 0,1 M y a pH 7 fueron precipitados fraccionadamente con
sulfato de amonio al 30, 45, 60 y 80 %.
● Se agregó el sulfato de amonio lentamente y con agitación suave a la muestra colocada en hielo hasta llegar al 30 % de
saturación.
● Luego de 30 min la concentración de (NH4)2SO4 deseada y la mezcla se centrifugó a 16000 g durante 20 minutos y a 4°C.
● Al sobrenadante, se agregó (NH4)2SO4 hasta obtener el 45 % de saturación y así sucesivamente se continuó con la
precipitación fraccionada.
● Los precipitados fueron redisueltos con buffer fosfato 0,1 M de pH 6.
● Las muestras fueron desaladas por pasaje en columna con Sephadex G-25 (Pharmacia) usando como solvente de elución
buffer fosfato 0,1 M de pH 6.
● Se midió la absorbancia a 280 nm y se colectaron 10 ml de cada una de las cuatro fracciones precipitadas con (NH4)2SO4
de los eluidos con alta absorbancia.
Cromatografía de intercambio iónico
● Para purificar el extracto crudo y el precipitado con sulfato de amonio se utilizó una columna Pharmacia K 15/30 (1,5 cm x
30 cm) rellena con 30 ml de DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrada con buffer fosfato potásico 50 mM de pH
6 y con gradientes salinos de NaCl
● Con un volumen de elución de 180 ml, y recogiendo fracciones de 2 ml. L, la velocidad de flujo fue de 45 cm3 h-1 y se
midieron los valores de absorbancia a 280 nm
Extracto de flor precipitado con sulfato de amonio
● Con sulfato de amonio se obtiene un precipitado al 80 % del extractivo de las flores tratado fraccionadamente
● Se redisuelve en 10 ml de buffer y se purifica en la columna de DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrada con
buffer fosfato de potasio 50 mM de pH 6.
● La elución fue realizada con un gradiente lineal de NaCl (0 a 0,9 M) en el mismo buffer
● El pool de las fracciones con actividad proteolítica (10 ml cada una) fue recromatografiado, eluyendo con un gradiente de
NaCl 0,3 a 0,6 M.

CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS DE PUREZA DE LOS EXTRACTOS ENZIMÁTICOS

● Se realizó utilizando la técnica descrita por Laemmli
● Los geles (7 cm x 8 cm x 0,75 mm) con una concentración de acrilamida del 14 % en el gel de resolución, 5 % en el gel
concentrador (stacking) y el agregado de SDS
● El buffer de corrida se utilizó Tris-glicina pH 8,3 y β-mercaptoetanol.
● Los extractivos vegetales fueron solubilizados en buffer de muestra a una concentración de 1 µg µl -1 de proteínas y
centrifugados a 16000 g,
● Se escanearon los geles y se analizaron utilizando el programa Scion Image
● Para determinar los pesos moleculares se usó una curva de calibración obtenida al graficar los logaritmos de los pesos
moleculares de las proteínas patrones en función de la movilidad relativa de cada especie proteica.
Actividad enzimática en geles
Se detectó en geles nativos o en SDS-PAGE si las muestras son preparadas sin reducción ni calentamiento y si son
renaturalizadas después de la electroforesis.
Zimograma con gelatina incluída
● Se realizaron electroforesis nativas y SDS-PAGE en condiciones no desnaturalizantes con geles de resolución al 14 % y
stacking al 5 %,
● Se agregó la gelatina al 0,7 % previamente a la polimerización.
● Luego de la electroforesis, se colocaron los geles en buffer cítrico-citrato 0,1 M de pH 4 por 2 horas a 37°C o toda la noche
a temperatura ambiente.
● Se detuvo la proteolisis al transferir los geles a la solución colorante (Coomassier Blue R-250).
● Se visualizaron las proteínas con actividad proteolítica sobre gelatina como bandas no teñidas sobre el fondo oscuro del
gel.
EFECTO DE ACTIVADORES E INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA

● Se determinó preincubando las muestras con el activador o inhibidor durante 30 minutos a 37°C y estimando la actividad
caseinolítica residual a pH 6
● Se evalúan los inhibidores de cisteína (5 mM), con pepstatina A (1 µM)).
● Los controles se realizaron preincubando las preparaciones enzimáticas con el solvente utilizado para disolver los
activadores o inhibidores.
● Esto se realizó para ver el grupo al que pertenecen las peptidasas.
RESULTADOS OBTENIDOS:
Tabla 1: Resultados de la prueba de Biuret

Proteínas
Muestra Color Resultado
(mg)
Extracto Crudo Violeta Positivo 18
Tabla 2: Etapas de purificación para Cardosina

%
Etapa Proteína (mg/ml) AT (U) AE (U/mg) GP
Recuperación
Extracción 18 2666,7 148,15 1 100
Primera Purificación 6,5 1333,3 205,12 2,786 49,998
Segunda Purificación 0,7 400 571,43 3,857 15,000

EXTRACCIÓN
Tabla 3: Velocidades en función de las concentraciones
Concentraciones [S]
Vo (U/mg)
(mg/ml)
0.1 74.11
0.25 170.17
0.5 305.98
1 541.43
Gráfica de Michaelis -
Menten
600
500
Vo (U/mg)
400
300
200
100
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
[S] (mg/ml)
Figura 1: Gráfica de Michaelis y Menten para el sustrato crudo.

1/S 1/V
10 0.0135
4 0.0059
2 0.0033
1 0.0018
Linealización de Linewaber y Burk

0,0140
y = 0,0013x + 0,0006
0,0120 R² = 0,9998
0,0100
0,0080
1/Vo
0,0060
0,0040
0,0020
0,0000
0 2 4 6 8 10 12
1/[S]
Figura 2: Gráfica de linealización de Lineweaver-Burk para el sustrato crudo.


Vo Vo/S
74.11 741.100
170.17 680.680
305.98 611.960
541.43 541.430
Eadie Hofstee y = -0,4639x + 788,94

R² = 0,9724
800,000
700,000
600,000
500,000
400,000
Vo
300,000
200,000
100,000
0,000
0 100 200 300 400 500 600
Vo/S
Figura 3: Gráfica de linealización de Eadie Hofstee para el sustrato crudo
1era PURIFICACIÓN
Tabla 6: Velocidades en función de las concentraciones.
Concentraciones [S]
Vo (U/mg)
(mg/ml)
0.1 75.61
0.25 177.29
0.5 308.01
1 544.98
Gráfica de Michaelis y Menten

600
500
Vo (U/mg)
400
300
200
100
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
[S] (mg/ml)
Figura 4: Gráfica de Michaelis y Menten para la primera purificación.


1/S 1/V
10 0.0132
4 0.0056
2 0.0032
1 0.0018

y = 0,0013x + 0,0006
0,0140 R² = 0,9998
0,0120
0,0100
0,0080
1/Vo
0,0060
0,0040
0,0020
0,0000
0 2 4 6 8 10 12
1/[S]
Figura 5: Gráfica de linealización de Lineweaver-Burk para la primera purificación.

Vo Vo/S
75.61 756.100
177.29 709.160
308.01 616.020
544.98 544.980

R² = 0,9724
800,000
700,000
600,000
500,000
400,000
Vo
300,000
200,000
100,000
0,000
0 100 200 300 400 500 600
Vo/S
Figura 6: Gráfica de linealización de Eadie Hofstee para la primera purificación.

2da PURIFICACIÓN
Tabla 9: Velocidades en función de las concentraciones.
Concentraciones [S]
Vo (U/mg)
(mg/ml)
0.1 75.53
0.25 179.59
0.5 310.99
1 544.78
Gráfica de Michaelis y Menten

600
500
400
Vo (U/mg)
300
200
100
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
[S] (mg/ml)
Figura 7: Gráfica de Michaelis y Menten para la segunda purificación.

1/S 1/V
10 0.0132
4 0.0056
2 0.0032
1 0.0018

0,0140
0,0120 y = 0,0013x + 0,0006
0,0100 R² = 0,9998
0,0080
1/Vo
0,0060
0,0040
0,0020
0,0000
0 2 4 6 8 10 12
1/[S]
Figura 8: Gráfica de linealización de Lineweaver-Burk para la segunda purificación.


Vo Vo/S
75.53 755.300
179.59 718.360
310.99 621.980
544.78 544.780

R² = 0,9724
800,000
700,000
600,000
500,000
400,000
Vo
300,000
200,000
100,000
0,000
0 100 200 300 400 500 600
Vo/S
Figura 9: Gráfica de linealización de Eadie Hofstee para la segunda purificación.
Etapa Ecuación de Linealización Km (mg/ml) Vmax (umol/min)
Extracto crudo y = 0,0011x + 0,0008 1,375 1250
Primera purificación y = 0,0013x + 0,0006 2,167 1666,667

Segunda purificación y = 0,0013x + 0,0006 2,167 1666,667
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
Vo (U/mg)
Concentraciones [S] (mg/ml) [I]=0 [I]= 1µM
0.1 75.53 3.52
0.25 179.59 8.98
0.5 310.99 15.55
1 544.78 27.209

Inhibición enzimática
600
500
400
Vo (U/mg)
300
200
100
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
[S] (mg/ml)
[I]=0 [I]= 1μM
Figura 10: Gráfica de la inhibición enzimática.

1/S 1/Io 1/I1
10 0.0132 0.284
4 0.0056 0.111
2 0.0032 0.064
1 0.0018 0.037
Linealización
0,3000
y = 0,0275x + 0,0072
0,2500 R² = 0,9987
0,2000
0,1500
0,1000
0,0500 y = 0,0013x + 0,0006

R² = 0,9998
0,0000
0 2 4 6 8 10 12
1/Io 1/I1 Lineal (1/Io)

Lineal (1/Io) Lineal (1/I1) Lineal (1/I1)
Figura 11: Gráfica de linealización de la inhibición enzimática

Km 2.166 3.919
Vmax 1666.66 138.88
Ki - 0.091

Grado de inhibición
[𝐼]
𝜀=
[𝑆𝑜]
[𝐼] + 𝐾𝑖 )1 +
𝐾𝑚 .
1
𝜀=
5𝐸 − 3
1 + 0.091 21 + 2.166 9
𝜀 = 0.92
GRAFICO/FOTOS:
Figura 12. SDS-PAGE

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
Conclusiones
• Las peptidasas son utilizadas en variados procesos tecnológicos, sin embargo la obtención de peptidasas a nivel vegetal
es baja.
• La cardosinas A y B son peptidasas aspárticas localizadas en los estigmas frescos y son utilizados para lograr la actividad
coagulante de la leche.
• La flor de cardo Cynara cardunculus L.es una especie considerada como fuente de proteínas aspárticas para la coagulación
de la leche durante la fabricación de queso de oveja.
• Para la actividad proteolítica se usa como sustrato la caseína y se realiza el cálculo de las proteínas totales mediante el
método de Bradford, además es necesario el uso de inhibidores y activadores con el fin de determinar el grupo al que
• Para la purificación se debe realizar un precipitado fraccionada con sulfato de amonio, una cromatografía de intercambio
iónico, y se debe realizar la caracterización y análisis de pureza de los extractos enzimáticos mediante electroforesis con
SD-PAGE y el uso de zimograma con gelatina para la actividad.
• Se cumplieron todos los objetivos de la práctica.
• Con una purificación mediante precipitación fraccionada con sulfato de amonio posterior a la cromatografía de intercambio
iónico se dedujo que ambas técnicas dieron resultados positivos respecto al factor de pureza y su incremento en base al
rendimiento de enzima purificada.
• La pepstatina A es un inhibidor mixto y posee un grado de inhibición del 91%.
Recomendaciones
• Cumplir con todas las especificaciones de los protocolos propuestos, con el fin de evitar fallos y resultados erróneos en la
experimentación.

•
• Se debe considerar la solubilidad, carga iónica, tamaño molecular, propiedades de absorción y capacidad de unión a otras
moléculas biológicas para el proceso de purificación.
• Se debe usar un buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato) para evitar procesos de proteolisis
DISCUSIÓN/OBSERVACIONES:
En el presente trabajo se realizó un análisis completo de las 3 fases de purificación, en cada uno se realizó la linealización, se
encontró los valores de Km y Vmax. eso en cuanto a la parte cinética. Proceso que se corrobora en otro trabajo realizado en un
estudio cinético enzimático de hidrolasas por Hernandez et al.,(2015).
Dentro de la investigación realizada la reacción de biuret tuvo un cambio de coloración a un tomo violeta, esto se corrobora ya que
según lo afirma Argañaras, (2000) al obtener las peptidasas de la Cynara cardunculus L y al hacerle reaccionar con el reactivo de
Biuret se torna una solución de color violeta debido a que el reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina de NaOH
que se une con los pares de electrones no compartidos del nitrógeno formando un complejo de coordinación de cuatro enlaces
peptídicos de dos cadenas proteicas próximas la intensidad del color depende de la concentración proteica de la caseína.
Finalmente se logró determinar que la Cynara cardunculus L como fuente de proteínas aspárticas para la coagulación
específicamente la cardosinas A y B son peptidasas aspárticas localizadas en los estigmas frescos del cardo, esto se logró verificar
mediante la purificación se debe realizar un precipitado fraccionada con sulfato de amonio, una cromatografía de intercambio iónico,
y se debe realizar la caracterización y análisis de pureza de los extractos enzimáticos mediante electroforesis con SD-PAGE y el uso
de zimograma con gelatina para la actividad, además pruebas de cuagulación. Según Fogeiro et al., (2020) el cardo participa en dos
procesos importantes en la producción de queso, la coagulación y la proteólisis, contribuyendo a sus características únicas y siendo
esenciales las peptidasas aspárticas para la producción de coagulación del queso.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA:
Faria, E. L. P., Gomes, M. V., Cláudio, A. F. M., Freire, C. S. R., Silvestre, A. J. D., & Freire, M. G. (2018). Extraction and recovery
processes for cynaropicrin from Cynara cardunculus L. using aqueous solutions of surface-active ionic liquids. Biophysical
Reviews, 10(3), 915-925. https://doi.org/10.1007/s12551-017-0387-y
Fogeiro, É., Barracosa, P., Oliveira, J., & Wessel, D. F. (2020). Influence of Cardoon Flower (Cynara cardunculus L.) and Flock
Lactation Stage in PDO Serra da Estrela Cheese. Foods, 9(4), 386. https://doi.org/10.3390/foods9040386
Hernández, I., Alejo, K. M., Méndez, L., García, A., Cordova, A., & García, A. (2015). ESTUDIO CINÉTICO ENZIMÁTICO DE LA
HIDROLASA A PARTIR DE CÍTRICOS. Avances en Ciencias e Ingeniería, 9.
Gil, M. (2019, julio 3). Biuret: Fundamento, reactivos, procedimiento, usos. Lifeder. https://www.lifeder.com/biuret/
Llorente, B. E. (2002). Aislamiento, purificación, caracterización y producción in vitro de peptidasas de alcaucil coagulantes de la
leche [Doctor en Ciencias Exactas, área Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de La Plata].
https://doi.org/10.35537/10915/2211
Paul, M., & Hekken, D. L. V. (2011). Short communication: Assessing antihypertensive activity in native and model Queso Fresco
cheeses1. Journal of Dairy Science, 94(5), 2280-2284. https://doi.org/10.3168/jds.2010-3852
Rawlings, N. D., & Bateman, A. (2019). Origins of peptidases. Biochimie, 166, 4-18. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.07.026

Ramírez, J., Reyes, A. (2003). Manual de prácticas de laboratorio de biología. México: Pearson Educación . Recuperado de:
https://books.google.com.mx/books?id=xBxiLyO2uYEC&pg=RA1-PA20&dq=practica+carbohidratos+lugol&hl=es-
419&sa=X&ved=2ahUKEwjMkMrT3Z3sAhUMP60KHYypBvoQ6AEwBHoECAUQAg#v=onepage&q&f=false
Santiago_del_Estero_TPC2016_par3.pdf. (s. f.). Recuperado 29 de julio de 2021, de
http://lcve.mincyt.gob.ar/downloads/Santiago_del_Estero_TPC2016_par3.pdf
FIRMAS EVALUACIÓN
F: ………………...………………………. F: …………………..………………………. …………………………………

Nombre: Nombre: Nota:
ALUMNO / RESPONSABLE DOCENTE / INSTRUCTOR

1 2 3
Reyes Angie , Roca Emilia , Rodriguez Gabriela
Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura/Ingeniería en Biotecnología
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
Tema Caracterización de las Peptidasas de Cynara cardunculus L
Tipo de
Proveedor Creative Enzymes enzima Enzima proteolítica
Nombre
Cardosina PDB ID: 1B5F
común
Proteinasa
aspártica, Ap1,
aspartil
endoproteinasa,
aspártico Codificación EC 3.4.23.40
proteinasa de
grano de cebada,
carboxil
proteinasa, Card
Otros nombres A, Card B,
Cardosina A,
Cardosina B,
Cinarasa A,
Cinarasa B,
Cinarasa C, Número CAS 219715-98-7
Edestinasa, HvAP,
Nepentenina,
Oryzasion, PCB,
Procardosina B,
Fitepsina
Cardosina A: Dos cadenas de 28 y 14 kDa respectivamente.

Peso molecular
Cardosina B: Dos cadenas de 30 y 14 kDa respectivamente.
Clasificación Proteasas aspárticas
Obtenidas de estigmas de flores frescas de cardo, las cardosinas A y B se expresan
Origen natural específicamente en la parte femenina de las flores (pistilo) desde estadios tempranos
del desarrollo floral hasta estadios senescentes.
Figura 1: Estructura tridimensional de la Cardosina A de Cynara cardunculus L.1
Estructura
Figura 2: Estructura Tridimensional de la Cardosina B de Cynara cardunculus L.2

El coagulante de C. cardunculus contiene dos enzimas, cardosina A y cardosina B
Reacción (Esteves et al., 1995), siendo ésta más proteolítica que cardosina A. Ambas enzimas
hidrolizan el enlace Phe105-Met106 de k-caseína.
Sitio activo localizado entre los dos lóbulos y que cada lóbulo contribuye con un
Sitio activo residuo de ácido aspártico
Grupo prostético Hidroxicinnamoil-coenzima A 3 (coenzima)

La cardosina A que, de forma similar a la quimosina por lo que a parámetros de
cinética enzimática se refiere, escinde la -CN bovina únicamente entre los
aminoácidos Phe105 y Met106 y la cardosina B, que es comparable a la pepsina en
Actividad
términos de especificidad y actividad, y más proteolítica que la cardosina A (Macedo
enzimática
et al., 1993; Esteves et al., 2002).
Cardosina A: 0.027x10E-5 ± 0.59x10E-6 umol/min 4
Cardosina B: 64.75 ± 5.23 umol/min 4
Cardosina A: 0.04x10E-3 ± 0.002x10E-4 U/mg de proteína4
Actividad
Cardosina B: 0.019 ± 0.005 U /mg de proteína 4
específica
kcat (s^-1) 1,04

Km (𝛍M) 0,16
kcat/Km((µ M^-1
6,5
s^-1) )
Punto isoeléctrico 5.7
Prefiere los residuos hidrófobos Phe, Val, Ile, Leu y Ala en P1 y P1 ', pero también
Acción de la
escinde los enlaces -Phe- | -Asp- y -Asp- | -Asp- en albúmina 2S de semillas de
enzima (enlaces)
plantas.
Apariencia Polvo líquido o liofilizado
Sustrato κ-caseína intacta
Afinidad de Caseína,Azocaseína, Leche descremada, Hemoglobina

sustrato
Pepstatina A, El complejo de la diazoacetil-DL-norleucina metil éster (DAN) con
Inhibidor
iones cobre y el EPNP (1,2-epoxy-3-(p- nitrofenoxi),
Tiene dos pasos:
1. Precipitación fraccionada con sulfato de amonio
2. Cromatografía de intercambio iónico
Técnica de 3. Electroforesis bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)
purificación 4. Actividad enzimática en geles
5. Zimograma con gelatina incluída
Condiciones de Temperatura 40 a 45 ºC 5 pH de extracción 7

trabajo Buffer fosfato potásico 0,1 M; de pH 7 (Extracción)
Solución Buffer
Buffer cítrico-citrato 0,1 M de pH 4 (Electroforesis)
Condiciones 70°C pH Activas: 2-7
Temperatura
óptimas Máxima actividad: 5-5,5
Almacenamos a: +4 ºC
Condiciones de Período de Temperatura de Para almacenamiento a
Tiempo
almacenamiento tiempo corto almacenamiento largo plazo, guárdelo a
-20 ºC ～ -80 ºC.
Temperatura de 60°C
inactivación
En el caso de la cardosina B tiene un rol en defensa o en la interacción polen-pistilo.
Función La cardosina A interviene en mecanismos proteolíticos mediados por adhesión, los
cuales estarían probablemente asociados con el crecimiento del tubo polínico.
Aplicación Aplicada en:

Dada su capacidad de coagulación de la leche son usados para la fabricación de
quesos
Hidrolisis in vitro del colágeno tipo l, usado como herramienta promisoria en la
prevención de la formación y reducción de adherencias en cirugías abdominales.
Dada la estabilidad de las enzimas en sistemas bifásicos acuosos-orgánicos,son
capaces de catalizar la síntesis enzimática de dipéptidos y tripéptidos en dichos
medios.
Universidad de las Fuerzas Armadas
-ESPE-
Ingeniería en Biotecnología
Purificación y cinética de la
INFORME
enzima Cardosina A y B
GRUPO 1 Integrantes:
Angie Reyes
Emilia Roca
NRC 5273 Gabriela Rodriguez
Objetivos
General
Purificar y analizar la cinética de la enzima Cardosina A y B
Específicos
● Realizar el cultivo,
● Purificar el extracto
obtención de la planta ● Calcular y analizar la
crudo de Cynara
y finalmente el extracto cinética de la enzima.
cardunculus L
de Cynara cardunculus
L
INTRODUCCIÓN
Inportancia
● Cuajo del queso

● Beneficios en disminución de
presión arterial
hidrólisis específica del enlace Phe105-Met106 de la κ-caseína bovina
● Ampliamente utilizadas ● Se une a residuos de ácido aspártico

en la industria (peptidasas aspárticas), residuos de
ácido glutámico (peptidasas
● Escisión de un enlace glutámicas) o uno o dos iones
carbono-nitrógeno entre metálicos (metalopeptidasas)
● La cardosinas A y B son peptidasas
dos aminoácidos en un
aspárticas localizadas en los estigmas
péptido o proteína frescos y son utilizados para lograr la
actividad coagulante de la leche.
Cynara cardunculus L
Planta Cultivado en gran

mediterránea que medida dado sus
posee tres tallos carnosos y
variedades pecíolos
Tiene grasas y Fuente de proteínas

proteínas, mientras aspárticas para la
que también coagulación de la
contienen leche
cantidades
considerables de K,
Mg y Fe
Aislamiento y purificación de proteínas
vegetales
Separaciones cromatográficas
Métodos de ruptura mecánica
1. Trituración con arena o alúmina,
2. trituración en mezclador de alta
3. Homogeneizador a piston,
1 2 Los métodos cromatográficos son:
1. Cromatografía de intercambio iónico
2. Cromatografía de adsorción,
4. Prensa francesa, 3. Cromatografía de exclusión molecular
5. Ponicación 4. Cromatografía de afinidad
6. Congelación con nitrógeno líquido y macerado.
Purificación de proteínas Separaciones electroforéticas
Procedimientos de fraccionamiento.
Considerar solubilidad, carga iónica,
3 4 Para visualizar todos los polipéptidos
constitutivos de las moléculas
tamaño molecular, propiedades de poliméricas
absorción y capacidad de unión a otras
moléculas biológicas.
Material
PROCEDIMIENTO vegetal
Selección del
Cultivo in vitro
material
1 2 3 4
Desinfección del
Obtención de las
material vegetal
plantas mediante
para cultivo in
aclimatación en
vitro
campo.
Peso
1 2
Obtención de fresco y
Extracto vegetal preparaciones
crudas
seco,
Prueba de
biuret.
Curva de
3 4
Obtención de calibración y
polvos prueba en
acetónicos tubo
Actividad proteolítica y
PROCEDIMIENTO proteínas totales
Actividad Proteinas
proteolítica Caseina
totales
Purificación de
preparaciones crudas
Precipitación fraccionada con

sulfato de amonio
Cromatografía de Actividad enzimática en geles- Zimograma con gelatina

intercambio iónico incluída
Se determinó preincubando las muestras con el activador o

Efecto de activadores e inhibidores inhibidor durante 30 minutos a 37°C y estimando la
actividad caseinolítica residual a pH 6
RESULTADOS - PRUEBA DE
BIURET
Tabla 1: Resultados de la prueba de Biuret
Muestra Color Resultado Proteínas

(mg)
Extracto Crudo Violeta Positivo 18

RESULTADOS - PROCESO DE
PURIFICACIÓN
Tabla 2: Etapas de purificación para Cardosina A y B.
Etapa Proteína AT (U) AE (U/mg) GP %

(mg/ml) Recuperació
n
Extracción 18 2666,7 148,15 1 100
Primera 6,5 1333,3 205,12 2,786 49,998

Purificación
Segunda 0,7 400 571,43 3,857 15,000

Purificación
RESULTADOS - EXTRACTO CRUDO
Tabla 3: Velocidades en
función de las concentraciones
Concentraciones Vo (U/mg)
[S] (mg/ml)
0.1 74.11
0.25 170.17
0.5 305.98
Figura 1: Gráfica de Michaelis y Menten para el

1 541.43 sustrato crudo.
Tabla 4: Linealización de
Lineweaver-Burk
1/S 1/V
10 0.0135
4 0.0059
2 0.0033
Figura 2: Gráfica de linealización de

1 0.0018
Lineweaver-Burk para el sustrato crudo.
Eadie Hofstee
Vo Vo/S
74.11 741.100
170.17 680.680
305.98 611.960
541.43 541.430 Figura 3: Gráfica de linealización de Eadie Hofstee

para el sustrato crudo
RESULTADOS - PRIMERA
PURIFICACIÓN
Tabla 6: Velocidades en función
de las concentraciones.
[S] (mg/ml)
0.1 75.61
0.25 177.29
0.5 308.01
Figura 4: Gráfica de Michaelis y Menten para la
1 544.98 primera purificación.
PURIFICACIÓN
Lineweaver-Burk
1/S 1/V
10 0.0132
4 0.0056
2 0.0032
1 0.0018 Figura 5: Gráfica de linealización de

Lineweaver-Burk para la primera purificación.
PURIFICACIÓN
Tabla 8: Linealización de Eadie
Hofstee
Vo Vo/S
75.61 756.100
177.29 709.160
308.01 616.020
544.98 544.980 Figura 6: Gráfica de linealización de Eadie Hofstee para

la primera purificación.
RESULTADOS - SEGUNDA
PURIFICACIÓN
Tabla 9: Velocidades en función de
las concentraciones.
[S] (mg/ml)
0.1 75.53
0.25 179.59
0.5 310.99
Figura 7: Gráfica de Michaelis y Menten para la segunda
purificación.
1 544.78
PURIFICACIÓN
Lineweaver-Burk
1/S 1/V
10 0.0132
4 0.0056
2 0.0032
Figura 8: Gráfica de linealización de Lineweaver-Burk

1 0.0018 para la segunda purificación.
PURIFICACIÓN
Tabla 11: Linealización de Eadie
Hofstee
Vo Vo/S
75.53 755.300
179.59 718.360
310.99 621.980
Figura 9: Gráfica de linealización de Eadie Hofstee para

544.78 544.780
la segunda purificación.
RESULTADOS - Km Y Vmax
Etapa Ecuación de Km Vmax

Linealización (mg/ml) (umol/min)
Extracto crudo y = 0,0011x + 0,0008 1,375 1250
Primera y = 0,0013x + 0,0006 2,167 1666,667

purificación
Segunda y = 0,0013x + 0,0006 2,167 1666,667

purificación
RESULTADOS - INHIBICIÓN
ENZIMÁTICA
Concentraciones [S] Vo (U/mg)

(mg/ml)
[I]=0 [I]= 1μM
0.1 75.53 3.52
0.25 179.59 8.98
0.5 310.99 15.55

Figura 10: Gráfica de la inhibición enzimática.
1 544.78 27.209
ENZIMÁTICA
1/S 1/Io 1/I1
10 0.0132 0.284
4 0.0056 0.111
2 0.0032 0.064
1 0.0018 0.037
Figura 11: Gráfica de linealización de la inhibición

enzimática.
ENZIMÁTICA (Km y Vmax)
Km (mg/ml) 2.166 3.919
Vmax 1666.66 138.88

(umol/min)
Ki - 0.091
Figura 12: Cálculo del grado

de inhibición.
Discusión
Finalmente se logró determinar que la
Cynara cardunculus
Prueba de Biuret L como fuente de proteínas aspárticas
para la coagulación
específicamente la cardosinas
A y B son peptidasas aspárticas
localizadas en los estigmas frescos del
cardo,
esto se logró verificar mediante la
purificación se debe realizar un
precipitado
En el presente trabajo se realizó un
fraccionada con sulfato de amonioy según
análisis completo de las 3 fases de Fogeiro et
purificación, en cada uno se realizó al., (2020) el cardo participa en dos
la linealización, se encontró los procesos importantes en la producción de
valores de Km y Vmax. eso en queso, la coagulación y la proteólisis,
cuanto a la parte cinética. Proceso contribuyendo a sus características
que se corrobora en otro trabajo únicas y siendo esenciales las peptidasas
aspárticas para la producción de
realizado en un estudio cinético
coagulación del queso.
enzimático de hidrolasas por
Hernandez et al.,(2015).
Conclusiones
· Las peptidasas son utilizadas en
variados procesos tecnológicos, · Con una purificación mediante precipitación
· La flor de cardo Cynara cardunculus fraccionada con sulfato de amonio posterior a la
sin embargo la obtención de
L.es una especie considerada como cromatografía de intercambio iónico se dedujo que
peptidasas a nivel vegetal es fuente de proteínas aspárticas para la
baja. ambas técnicas dieron resultados positivos respecto
coagulación de la leche durante la
fabricación de queso de oveja. al factor de pureza y su incremento en base al
rendimiento de enzima purificada.
· La cardosinas A y B son
peptidasas aspárticas
localizadas en los estigmas · Para la actividad proteolítica se · Para la purificación se debe realizar un
frescos y son utilizados para usa como sustrato la caseína y precipitado fraccionada con sulfato de
lograr la actividad coagulante de se realiza el cálculo de las amonio, una cromatografía de
la leche. proteínas totales mediante el intercambio iónico, y se debe realizar la
método de Bradford, además es caracterización y análisis de pureza de
necesario el uso de inhibidores y los extractos enzimáticos mediante
activadores con el fin de electroforesis con SD-PAGE y el uso de
La pepstatina A es un inhibidor mixto y determinar el grupo al que zimograma con gelatina para la actividad.
posee un grado de inhibición del 91%.
REFERENCIAS
● Faria, E. L. P., Gomes, M. V., Cláudio, A. F. M., Freire, C. S. R., Silvestre, A. J. D., & Freire, M. G. (2018). Extraction and recovery processes for cynaropicrin from Cynara cardunculus L. using aqueous solutions of surface-active ionic
liquids. Biophysical Reviews, 10(3), 915-925. https://doi.org/10.1007/s12551-017-0387-y
● Fogeiro, É., Barracosa, P., Oliveira, J., & Wessel, D. F. (2020). Influence of Cardoon Flower (Cynara cardunculus L.) and Flock Lactation Stage in PDO Serra da Estrela Cheese. Foods, 9(4), 386. https://doi.org/10.3390/foods9040386
● Hernández, I., Alejo, K. M., Méndez, L., García, A., Cordova, A., & García, A. (2015). ESTUDIO CINÉTICO ENZIMÁTICO DE LA HIDROLASA A PARTIR DE CÍTRICOS. Avances en Ciencias e Ingeniería, 9.
● Gil, M. (2019, julio 3). Biuret: Fundamento, reactivos, procedimiento, usos. Lifeder. https://www.lifeder.com/biuret/
● Llorente, B. E. (2002). Aislamiento, purificación, caracterización y producción in vitro de peptidasas de alcaucil coagulantes de la leche [Doctor en Ciencias Exactas, área Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de La Plata].
https://doi.org/10.35537/10915/2211
● Paul, M., & Hekken, D. L. V. (2011). Short communication: Assessing antihypertensive activity in native and model Queso Fresco cheeses1. Journal of Dairy Science, 94(5), 2280-2284. https://doi.org/10.3168/jds.2010-3852
● Rawlings, N. D., & Bateman, A. (2019). Origins of peptidases. Biochimie, 166, 4-18. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.07.026
● Ramírez, J., Reyes, A. (2003). Manual de prácticas de laboratorio de biología. México: Pearson Educación . Recuperado de:
https://books.google.com.mx/books?id=xBxiLyO2uYEC&pg=RA1-PA20&dq=practica+carbohidratos+lugol&hl=es-419&sa=X&ved=2ahUKEwjMkMrT3Z3sAhUMP60KHYypBvoQ6AEwBHoECAUQAg#v=onepage&q&f=false
● Santiago_del_Estero_TPC2016_par3.pdf. (s. f.). Recuperado 29 de julio de 2021, de http://lcve.mincyt.gob.ar/downloads/Santiago_del_Estero_TPC2016_par3.pdf

Reyes - Roca - Rodriguez - Laboratorio Purificación y Cinética Enzimática

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Reyes - Roca - Rodriguez - Laboratorio Purificación y Cinética Enzimática

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO CÓDIGO DE DOCUMENTO:

ESTUDIANTE(s): Reyes Angie, Roca Emilia y Rodriguez Gabriela

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

● Ajustar el pH de los medios de cultivo a 5,8

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

Tabla 1: Resultados de la prueba de Biuret.

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

Tabla 2: Etapas de purificación para Cardosina

EXTRACCIÓN, 1era PURIFICACIÓN Y 2da PURIFICACIÓN

Tabla 3: Velocidades en función de las concentraciones

Tabla 4: Linealización de Lineweaver-Burk

Tabla 5: Linealización de Eadie Hofstee

Tabla 6. Constantes cinéticas en los diferentes procedimientos

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

Tabla 7. Acción del inhibidor pepstatina A

1/S 1/Io 1/I1

Tabla 9. Valores de Km y Vmax

Sin inhibidor Con inhibidor

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

F: ………………...………………………. F: …………………..………………………. …………………………………

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

ESTUDIANTE(s): Reyes Angie, Roca Emilia y Rodriguez Gabriela

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

● Purificar y analizar la cinética de la enzima Cardosina A y B

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS DE PUREZA DE LOS EXTRACTOS ENZIMÁTICOS

EFECTO DE ACTIVADORES E INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA

Tabla 1: Resultados de la prueba de Biuret

Tabla 2: Etapas de purificación para Cardosina

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

Figura 1: Gráfica de Michaelis y Menten para el sustrato crudo.

Tabla 4: Linealización de Lineweaver-Burk

Linealización de Linewaber y Burk

Figura 2: Gráfica de linealización de Lineweaver-Burk para el sustrato crudo.

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

Tabla 5: Linealización de Eadie Hofstee

Eadie Hofstee y = -0,4639x + 788,94

Figura 3: Gráfica de linealización de Eadie Hofstee para el sustrato crudo

Gráfica de Michaelis y Menten

Figura 4: Gráfica de Michaelis y Menten para la primera purificación.

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

Tabla 7: Linealización de Lineweaver-Burk

Linealización de Linewaber y Burk

Figura 5: Gráfica de linealización de Lineweaver-Burk para la primera purificación.

Tabla 8: Linealización de Eadie Hofstee

Eadie Hofstee y = -0,4639x + 788,94

Figura 6: Gráfica de linealización de Eadie Hofstee para la primera purificación.

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

Gráfica de Michaelis y Menten

Figura 7: Gráfica de Michaelis y Menten para la segunda purificación.

Tabla 10: Linealización de Lineweaver-Burk

Linealización de Linewaber y Burk

Figura 8: Gráfica de linealización de Lineweaver-Burk para la segunda purificación.

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20

Tabla 11: Linealización de Eadie Hofstee

Eadie Hofstee y = -0,4639x + 788,94

Figura 9: Gráfica de linealización de Eadie Hofstee para la segunda purificación.

Tabla 12. Constantes cinéticas en los diferentes procedimientos

Etapa Ecuación de Linealización Km (mg/ml) Vmax (umol/min)

Extracto crudo y = 0,0011x + 0,0008 1,375 1250

Primera purificación y = 0,0013x + 0,0006 2,167 1666,667

CÓDIGO: FRM.6.3 REVISIÓN UPDI: 2019-nov-20