Discusión Práctica 7

1. ¿Qué es un plásmido?
Pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentran en bacterias y
otras células. Los plásmidos son separados del cromosoma bacteriano y se
replican independientemente de ella. Por lo general, tienen sólo un número
pequeño de genes, algunos de ellos asociados con resistencia a los antibióticos.
Los plásmidos se pueden transmitir entre las distintas células bacterianas.
2. Diferencia entre el cromosoma de la bacteria y plásmido.
Cada célula bacteriana suele producir muchas copias de un plásmido, a diferencia
de su propio cromosoma del cual hace una copia única. El hecho de que los
plásmidos son más pequeños y en mayor número que el cromosoma del huésped
hace que sea más fácil aislarlos en forma pura.
 3. ¿Por qué se incuba a E.coli por 3 horas a 37°C?
Se incuba a 37°C porque es su temperatura optima de crecimiento y se incuba por
3 horas porque solo se necesita de una pequeña cantidad de colonias, es decir,
que solo emplearemos la fase de latencia del crecimiento microbiano (Los
microorganismos son transferidos de un cultivo en fase estacionaria a un medio
fresco, sufren un cambio en su composición química antes de ser capaces de
iniciar la multiplicación. Hay aumento de los componentes macromoleculares y de
la actividad metabólica, casi sin división celular, asociado a un incremento de la
susceptibilidad a los agentes físicos y químicos); además de que, si dejamos
incubar por más tiempo, puede existir la probabilidad de que tenga mucha carga
microbiana.
4. ¿Por qué se agrega la solución de MgCl2-CaCl2 a E.coli?
Se usa para transformar a E.coli con el plásmido. El tratamiento con CaCl2 es muy
importante para lograr la competencia y hace que las cargas positivas del Ca2+
neutralicen las cargas negativas de los fosfatos del DNA y de los fosfolípidos de la
membrana bacteriana, disminuyendo de esta manera la repulsión natural de estas
biomoléculas.
El CaCl2 también altera la pared celular y hace más fácil la entrada del DNA.
5. ¿Qué ocurre cuando colocamos los tubos en baño hielo por 30 minutos,
luego a 42°C por 90 segundos para que después se coloquen en baño de
hielo por 2 minutos (qué ocurre cuando se cambian las temperaturas a las
células)?
Se provoca estrés celular por medio de un choque térmico, el cual, consiste en
inducir cambios bruscos de temperatura para inducir la apertura de poros en la
membrana, haciéndolos permeables a las moléculas de ADN, como los plásmidos.
Si no hay choque térmico, se producirán una decima parte de transformaciones, o
si la duración del choque es de 90 segundos, se obtendrán la mitad de
transformaciones que con 90 segundos.
Es importante destacar que para obtener la mayor eficiencia en el proceso de
transformación es fundamental el cambio brusco en la fluidez de la membrana, por
lo que el shock térmico debe ser generado por el pasaje inmediato del tubo que
contiene las bacterias junto al DNA, desde el hielo directamente al baño de 42°C
 6. Investigar la estructura del plásmido pGLO
Plásmido que contiene la secuencia codificante para la proteína GFP. Además,
contiene el gen de resistencia a ampicilina, β-lactamasa.

7. Investigar la naturaleza de GFP.

La fuente natural del gen GFP es la medusa bioluminiscente Aequorea victoria. El
producto del gen GFP es una proteína fluorescente, que hace que la medusa
fluoresca y brille en la oscuridad. Las bacterias transformadas con el plásmido que
contiene este gen, adquieren la propiedad de fluorescer con un color verdoso
intenso que se hace visible al ser expuestas éstas a la luz ultravioleta.
8. Cómo funciona el operón de arabinosa.
Puede ser usada como sustrato metabólico a través de la vía de las pentosas-
fosfato; las enzimas necesarias para su metabolización son: arabinosa isomerasa,
ribulosa quinasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa que están codificadas por los
genes estructurales araA, araB y araD. El operón ara incluye además de los tres
genes estructurales: a) una región reguladora que a su vez tiene dos operadores
araO1 y araO2, b) un sitio de unión para la proteína reguladora (araC)
denominado araI (I=inductor), c) un promotor adyacente a araI y en la proximidad
del promotor se encuentra, d) un sitio de unión para la CAP-AMPc.
La proteína araC está codificada por un gen araC próximo que se transcribe desde
su propio promotor (próximo a araO1) en dirección opuesta a los genes
estructurales. El papel de la proteína es complejo, ya que es capaz de regular su
propia síntesis uniéndose a araO1 y cuando su concentración supera las cuarenta
copias por célula reprime su síntesis. Respecto a los genes estructurales, actúa
también como un regulador positivo y negativo, uniéndose a araO2 y a araI, lo cual
permite una acción distinta dependiendo de las siguientes condiciones
metabólicas: a) Si la glucosa es abundante y la arabinosa es escasa: la proteína
reguladora araC se une en dos puntos, a araO2 y araI formándose un lazo de
ADN que no permite la transcripción de los genes estructurales.
b) Si la glucosa es escasa y la arabinosa es abundante: el complejo CAP-AMPc es
abundante y se une a su sitio del ADN, adyacente a araI. La arabinosa funciona
como un activador, al unirse a la proteína araC altera su conformación, y al unirse
ésta a araI se combina con CAP-AMPc y aumenta la transcripción.
c) Si ambos son escasos o ambos son abundantes, el sistema de regulación no
está claro, aunque se sabe que hay represión.
9. Investigar qué es el Caldo Luria
Es el principal medio de enriquecimiento y mantenimiento de Escherichia coli, este caldo
se fundamenta en que se presenta contenido de hidrolizado enzimático y de extracto de
levadura se aportan los elementos nutritivos del medio. El cloruro de sodio aporta la
concentración salina necesaria para mantener un nivel osmótico apropiado para un buen
crecimiento, su composición es la siguiente:
Composición (g/L):

 Peptona de caseína……. 10,0

 Extracto de levadura……. 5,0
 Cloruro de sodio…………10,0
pH: 7,0 ± 0,2
10. ¿Qué es la ampicilina y cómo actúa en las bacterias?
Es un antibiótico penicilínico semisintético, de amplio espectro y activo por vía
oral. Aunque es más activo que las penicilinas naturales no estables frente a las
beta-lactamasa producidas por bacterias gram-postitivas o gram-negativas. La
ampicilina se utiliza para el tratamiento de infecciones debidas a organismos
susceptibles como la otitis media, la sinusitis y las cistitis. Debido al aumento de
resistencias ya no se recomienda la ampicilina para el tratamiento de la gonorrea.
Los β-lactámicos son compuestos bactericidas que inhiben las fases finales de la
síntesis del peptidoglucano, en la que intervienen activamente las ya citadas
encimas PBP. Las PBP tienen actividad transpeptidasa, transglucosilasa y
carboxipetidasa, por lo que pueden entrelazar los componentes del
peptidoglucano. Los β-lactámicos bloquean estas enzimas porque el anillo β-
lactámico tiene una estructura espacial similar a la del residuo acil-D-alanin-D-
alanina de las cadenas del peptidoglicano, que es el sustrato natural de las PBP.
11. ¿Qué pasa en la placa que tiene Luria/ ampicilina +arabinosa?
Si hay crecimiento, pero muy poco. Esto es porque la arabinosa expresa a la
proteína GFP.
12. ¿Qué contienen las soluciones de lisis I, II y III?
La alcalinización con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico
(SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalización del DNA cromosómico y de las
proteínas, y la liberación de los plásmidos. Los plásmidos se ven menos afectados
por su pequeño tamaño y estructura superenrollada. La neutralización del medio
en presencia de una concentración alta de sal (acetato potásico), provoca la
precipitación de las proteínas (por el tratamiento con el detergente y la
insolubilidad de la sal potásica del dodecil sulfato) y la del DNA cromosómico (por
reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de proteínas
y DNA cromosómico se separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda
en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa.
13. ¿Para qué se agrega el etanol absoluto en la extracción de ADN?
El DNA es una molécula polar, pero la reacción con el etanol a muy baja
temperatura hace que se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un
precipitado justo entre la capa con etanol líquido y la capa con el extracto. El DNA
es el único componente de la solución que no es soluble en el etanol, y se hace
visible porque las diferentes cadenas se van aglutinando entre sí al precipitar
debido a la acción de fuerzas físicas. El alcohol es menos denso que el agua del
extracto y por eso flota sobre la capa del extracto.
14. ¿Para qué se agrega el regulador TE?
Es el nombre común de tris(hidroximetil) aminometano. Se trata de un compuesto
muy utilizado en el laboratorio para preparar disoluciones tampón; el grupo ácido-
base que ejerce el tamponamiento es el amino. Se comercializa en sus formas
básica ("Tris base") y ácida ("Tris hidrocloruro"), aunque la primera es la de uso
más común.
En la electroforesis, es el agente tamponante que mantiene el pH. Se incluye tanto
en el gel como en el tampón de celda.
15. ¿Por qué se usa el gel de agarosa en la electroforesis?
El gel de agarosa tiene poros que permiten que las moléculas de DNA puedan
moverse hacia el polo negativo. Cuanto más grande sea el DNA, los fragmentos
ya no pueden viajar a través de la matriz del gel tan rápido como los fragmentos
cortos y se quedan atrapados cerca del inicio del gel donde la muestra se ha
cargado. Los fragmentos más cortos se mueven con más facilidad y así viajarán
más lejos. Esto da lugar a un patrón único de bandas para el DNA de cada
individuo.
Se trata de un polisacárido sintetizado por algunas algas, que forma parte del
agar-agar (ingrediente de medios de cultivo). Para su uso en electroforesis se
emplea un producto más purificado. Tiene la propiedad de disolverse en caliente
(50-60°C) y solidificar cuando se enfría, formando un gel de alta porosidad.
En la electroforesis, forma la matriz del gel y provoca el retardo dependiente del
tamaño que marca la separación.
16. ¿Cuál es la función del colorante para electroforesis?
Azul de bromofenol:
Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el
progreso de la electroforesis. Más detalles.
En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas
o que la mayoría de moléculas de DNA (aquéllas superiores a 300 pb), es decir,
marca el "frente de avance". Puesto que su color azul-violeta es bien visible,
permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas de proteína
o DNA no se hayan salido del gel.
Xileno-cianol
Se trata de compuestos coloreados y con carga, utilizados para comprobar el
progreso de la electroforesis.
En la electroforesis el xileno-cianol se mueve aproximadamente como las
moléculas de DNA de 3500 a 5000 pb (depende del tampón y el % de agarosa en
el gel).
Ambos tienen un color azul turquesa que permite detener la electroforesis con la
confianza de que las moléculas grandes de DNA no se hayan salido del gel.
Glicerol
El glicerol (glicerina) se utiliza como agente denso en la composición del tampón
de carga.
La muestra + tampón de carga se deposita al fondo del pozo y no difunde por el
tampón que llena la celda y cubre el gel. De ese modo no se pierde y se mantiene
concentrada.
17. ¿Qué hace el bromuro de etidio y por qué se considera mutagénico?
Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al
DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a su geometría
plana y su estructura aromática, que interacciona favorablemente con el interior
hidrófobo de la doble hélice. En menor medida, interacciona también con DNA
monocatenario.
Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un
entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz ultravioleta de
onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-
anaranjado.
En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el
gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de bromuro de
etidio, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el
gel.
Precaución: el etidio es cancerígeno, debido a su capacidad para intercalarse y así
dificultar la replicación y transcripción correctas. Debe manejarse con precaución,
especialmente el polvo sólido y las disoluciones concentradas.
18. ¿Cuáles son los errores comunes que hay en la electroforesis?

Para más información, ver el siguiente link: https://kalstein.eu/a372/Errores-

comunes-en-la-electroforesis/article_info.html?language=fr
 19. Método para realizar la determinación de peso molecular de proteína
desconocido en electroforesis.
Para determinar el peso molecular de proteínas. Para ello se compara el Rf de la
proteína problema con el de proteínas de referencia cuyo peso molecular se
conoce. Recordemos que el Rf es el parámetro experimental asociado a esta
técnica, y se define como:

El frente del gel se determina por la posición de un compuesto de referencia de

movilidad máxima, como puede ser el colorante azul de bromofenol. El
procedimiento se explica detalladamente en la sección de resultados
Notas:
Si E.coli no tiene el plásmido, no tendrá resistencia a la ampicilina.
¿E.coli crece en agar luria por incubación de 18 horas? Si, si crece.
¿E.coli crece en agar luria con ampicilina? No, no crece.
Links usados en la búsqueda de información:
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Plasmido
http://materias.df.uba.ar/bioa2018c1/files/2018/06/TBM-Laboratorio5-
transformacion-2018c1.pdf
https://laboratoriosportatiles.cl/wp-content/uploads/2016/05/Libro-Biologi%CC
%81a-Molecular-y-Geno%CC%81mica-XEROX-2016-liv.pdf
https://ocw.unican.es/pluginfile.php/879/course/section/967/Tema%25208-Bloque
%2520I-Regulacion%2520Genetica.pdf
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/37%20PURIFICACION%20ACS
%20NUCLEICOS.pdf
http://genetica.uab.cat/base/documents/genetica_gen/Laura%20Mart%C3%ADnez
%20Mart%C3%ADn2015_4_19P21_19.pdf
https://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-
28-articulo-mecanismos-accion-antimicrobianos-S0213005X08000177
https://www.iqb.es/cbasicas/farma/farma04/a052.htm#:~:text=Mecanismo%20de
%20acci%C3%B3n%3A%20los%20antibi%C3%B3ticos,localizadas%20en%20la
%20pared%20celular
http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/reactivos/reactivos.htm
https://bvs.ins.gob.pe/insprint/SALUD_PUBLICA/NOR_TEC/38.pdf
https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/16%20ELECTROFORESIS%20GELES%20PAA.pdf
Referencia:
Instrumentación Científica Técnica. Manual básico de microbiología. Caldo Luria.
Cultimed. Pp. 157