ACTUALIZACIÓN

ACTUALIZACIÓN
SOBRE
SOBRE
NEURODEGENERACIÓN
NEURODEGENERACIÓN

Laboratorio
Laboratorio de
de Fisiología
Fisiología de
de la
la Conducta
Conducta
Febrero -Abril 2005
Febrero-Abril 2005
Junio
Junio 2005
2005
 SERIES
I.
I. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN

II.
II. PATOGENIA
PATOGENIA MOLECULAR
MOLECULAR

III.
III. ENFERMEDADES
ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
NEURODEGENERATIVAS

IV.
IV. FUTURO
FUTURO EN
EN PREVENCIÓN,
PREVENCIÓN, DIAGNÓSTICO
DIAGNÓSTICO
YY TERAPÉUTICA
TERAPÉUTICA
 integración
Virus adeno-asociado
Vector
amplicón virus
virus
Terapia Genética
Transgen
Transgen
Plásmido
retrovirus
clonas lentivirus
recombinante ARN
ARN
HERPES
HERPES SIMPLE
SIMPLE 11 replicación
Virus
Virus “helper”
“helper” genoma
 USO DE
VECTORES VIRALES
IN VIVO
II parte

Laboratorio de Fisiología de la Conducta

2005
Aplicaciones

* Modelos animales de enfermedades

neurodegenerativas

* Terapia genética de enfermedades

neurológicas
 VECTORES
PARA

LLEVAR TRANSGENES
AL

CEREBRO
¿QUÉ QUEREMOS HACER NOSOTROS?

Aplicaciones
Aplicaciones preclínicas
preclínicas
** Usar
Usar genes
genes que
que aumenten
aumenten oo disminuyan
disminuyan una
una determinada
determinada
función
función en
en un
un área
área particular
particular del
del cerebro
cerebro de
de ratas
ratas

** Esos
Esos genes
genes pueden
pueden ser
ser para
para enzimas,
enzimas, receptores,
receptores,
canales,
canales, factores
factores neurotróficos
neurotróficos etc.
etc.

** En
En los
los casos
casos particulares
particulares de
de enfermedades
enfermedades
neurodegenerativas
neurodegenerativas (modelos
(modelos animales)
animales) puede
puede ser
ser para
para
estudiar
estudiar mecanismos
mecanismos etiopatogénicos
etiopatogénicos oo para
para inducir
inducir
mejoría
mejoría
Si tenemos,

1.
1. El
El transgen
transgen de
de interés
interés insertado
insertado en
en el
el vector
vector
viral
viral apropiado
apropiado

2.
2. El
El vector
vector viral
viral en
en cantidad
cantidad suficiente
suficiente como
como
para
para lograr
lograr la
la expresión
expresión genética
genética esperada
esperada

Entonces,

Podremos
Podremos administrar
administrar el
el transgen
transgen
intracerebralmente
intracerebralmente simplemente
simplemente como
como
una
una DROGA!
DROGA!
Vectores
Vectores virales
virales

** AAV
AAV recombinantes
recombinantes::
Modelo
Modelo Alzheimer
Alzheimer en
en ratones
ratones

** HSV1
HSV1 amplicones
amplicones::
Modelo
Modelo EP
EP temporal
temporal en
en ratas
ratas
Virus Adeno-Asociado Virus Herpes Simple 1

Ventajas
Ventajas Ventajas
Ventajas

°° Poco
Poco inmunogénicos
inmunogénicos °° Neurotropismo
Neurotropismo
°° No
No son
son patógenos
patógenos °° Transgenes
Transgenes grandes
grandes

Desventajas
Desventajas Desventajas
Desventajas
°Transgenes
°Transgenes pequeños
pequeños <4kb
<4kb °° Son
Son patogénicos
patogénicos
°Posible
°Posible mutación
mutación insercional
insercional °° Inmunogénicos
Inmunogénicos
Tecnología de Terapia Genética

1.
1. CONSTRUCCIÓN
CONSTRUCCIÓN TRANSGENES
TRANSGENES DE
DE INTERÉS
INTERÉS

2.
2. PRODUCCIÓN
PRODUCCIÓN VECTORES
VECTORES VIRALES
VIRALES
Desarrollo
Desarrollo de
de vectores
vectores derivados
derivados del
del virus
virus de
de
herpes
herpes simplex
simplex tipo
tipo 11 (HSV-1)
(HSV-1)

Alberto
Alberto L.
L. Epstein
Epstein
Centre
Centre de
de Génétique
Génétique Moléculaire
Moléculaire et
et Cellulaire
Cellulaire
Université
Université Claude
Claude Bernard
Bernard Lyon
Lyon II
Université Claude Bernard Lyon 1
VIRUS HERPES SIMPLE 1
 VIRUS
VIRUS DEL
DEL HERPES
HERPES SIMPLE
SIMPLE TIPO
TIPO II (HSV-
(HSV-1)
(HSV-1)

glicoproteínas Virus neurotrópico

cubierta
bicapa con cubierta
lipídica 1
Familia herpesviridae,
proteína de
membrana sub-familia α
herpesvirinae
tegumento 2
capside 3

ADN viral 4

an b b ’ a’n c ’ c a
Genoma lineal doble banda
UL US de ADN 152kpb
152 kpb
El
El hombre
hombre eses el
el huésped
huésped
natural
natural del
del HSV
HSV

La
La infección
infección es
es casi
casi
universal,
universal, casi
casi todos
todos los
los
adultos
adultos son
son seropositivos
seropositivos
1. Replicación lítica en la puerta de entrada epitelial

2. Viriones liberados del epitelio entran en los terminales sensoriales

3. Nucleocápside y tegumento van por transporte axónico retrógrado al soma

4. ADN viral entra al núcleo e inicia cascada lítica de expresión

genética o se vuelve latente

5. Durante la latencia el genoma viral permanece episomal o nuclear, sólo los genes
LAT se expresan

6. Inmunosupresión, enfermedad intercurrente u otros estímulos

“reactivan” la infección lítica

7. Los viriones son formados por gemación de la membrana nuclear

8. Nucleocápside y glicoproteínas transportadas separadamente por transporte

axonal anterógrado

9. Ensamblaje del virion y salida del terminal

10. Infección epitelial recurrente en el sitio de la lesión primaria o

cerca de ella
 Genoma Virus Herpes Simple 1

°° Doble
Doble banda
banda de
de ADN
ADN lineal
lineal 152Kb
152Kb
Tiene
Tiene 81
81 genes,
genes, la
la mitad
mitad no
no esenciales
esenciales que
que pueden
pueden
reemplazarse
reemplazarse por
por 40-50kb
40-50kb de
de genes
genes extraños
extraños
GENES principales para la REPLICACIÓN

1. Alfa
1 Alfa o
o tempranos
tempranos inmediatos:
inmediatos:
ICPO,
ICPO, ICP4,
ICP4, ICP22,
ICP22, ICP27,
ICP27, ICP47
ICP47 que
que
son
son factores
factores transactivantes
transactivantes que
que
permiten
permiten producción
producción de
de los
los

2.
2. Tempranos
Tempranos :codifican
:codifican para
para metabolismo
metabolismo de
de
nucleótidos
nucleótidos yy replicación
replicación de
de
ADN
ADN

3.
3. Tardíos
Tardíos :: activados
activados por
por los
los anteriores
anteriores yy
codifican
codifican para
para proteínas
proteínas estructurales
estructurales
VECTORES DERIVADOS DE HSV-1
HSV-1

Tropismo variado, neurotropismo

Células mitóticas y post-mitóticas

Se mantienen como episomas
Genoma de 152 kpb
Vectores
Vectores derivados
derivados de
de HVS1
HVS1
** Recombinantes
Recombinantes

** Amplicones
Amplicones
Recombinantes
Recombinantes HSV1
HSV1
** Son
Son virus
virus con
con replicación
replicación deficiente
deficiente
por
por eliminar
eliminar uno
uno de
de los
los genes
genes tempranos
tempranos
inmediatos
inmediatos como
como ICP4
ICP4

** Son
Son menos
menos patogénicos
patogénicos yy pueden
pueden
dirigir
dirigir la
la expresión
expresión del
del transgen
transgen en
en el
el
cerebro
cerebro
Amplicon
Amplicon
Un
Un término
término para
para cualquier
cualquier pequeño
pequeño
fragmento
fragmento replicante
replicante de
de ADN
ADN
Amplicones HSV1
Plásmidos
Plásmidos producidos
producidos en
en bacterias
bacterias que
que tienen:
tienen:

1.
1. Sitio
Sitio de
de origen
origen de
de replicación de E.
replicación de E. coli
coli (col
(col E
E ori)
ori)
2.
2. Sitio
Sitio de
de origen
origen de
de replicación
replicación de
de HSV
HSV 11 (OriS)
(OriS)
3.
3. Secuencia
Secuencia dede empaquetamiento
empaquetamiento de de HSV
HSV 11
4.
4. Transgen
Transgen bajo
bajo control
control de
de un
un promotor
promotor temprano
temprano
inmediato
inmediato
5.
5. Marcador
Marcador seleccionable
seleccionable
Plásmido amplicón
pA-EUA2

CGMC (Lyon)

° colE1
° oriS
° Resist. Ampicilina
° GFP
° HCMV promotor
Ori
EL VECTOR AMPLICON
plásmido Amplicon
(pA)
HSV-1
pac TRANSGEN
 VECTORES AMPLICONES
1.
1. Desprovistos
Desprovistos de
de genes
genes virales
virales
-ausencia
-ausencia de
de toxicidad
toxicidad
-capacidad
-capacidad de
de transferir
transferir >130
>130 kpb
kpb ADN
ADN exógeno
exógeno

2.
2. Expresión
Expresión TRANSITORIA
TRANSITORIA

3.
3. Construcción
Construcción de
de plásmido
plásmido amplicón
amplicón fácil
fácil yy
rápida
rápida

4.
4. Necesidad
Necesidad de de un
un virus
virus AUXILIAR
AUXILIAR para para su
su
producción,
producción, que
que provea
provea los
los genes
genes
reguladores
reguladores yy estructurales
estructurales que
que faltan
faltan para
para
replicación
replicación yy empaquetamiento
empaquetamiento de de las
las
partículas
partículas virales
virales
 VIRUS DEFECTUOSO AUXILIAR
(HELPER) HSV1-Lal∆J

Barreras
Barreras de
de seguridad
seguridad independientes:
independientes:

** Carece
Carece dede los
los GENES
GENES queque codifican
codifican para,
para,
°° proteína
proteína esencial
esencial ICP4
ICP4
°° factor
factor de
de virulencia
virulencia ICP34.5
ICP34.5

** No
No se empaqueta durante
durante la
la
producción
producción de
de vectores
vectores amplicones,
amplicones, por
por tanto
tanto
se
se producirán
producirán muy
muy pocos
pocos helpers
helpers que
que es
es lo
lo
deseable
deseable
 Sistema auxiliar (helper)
basado en Cre-loxP
loxP

Deleción Sitio-específica a loxP

de secuencias «a» de
empaquetamiento HSV-1
CRE

CRE
CRE

a loxP

+ HSV-1 ∆a

loxP HSV1-LaL∆J
 Elementos del nuevo sistema de
producción de vectores amplicones

* Virus HSV-1 LaLdeltaJ (virus auxiliar):

ºº defectuoso
defectuoso (no
(no tiene
tiene ICP4;
ICP4; ICP34.5)
ICP34.5)
ºº encapsidación
encapsidación inhibida
inhibida en
en presencia
presencia de
de recombinasa
recombinasa
Cre
Cre

* Línea celular BHK CINA (ICP4+)

* Línea celular TE CRE GRINA (ICP4+; Cre+)

 El sistema HSV-1 LaL-∆J/TE CRE GRINA

∆a LaL ∆a/ICP4 ∆a/ICP4

1. HSV-1 LaL∆J
Virus HSV1 UL44
auxiliar

2.
HCMV ICP4 IRES NeoR
Células BHK-CINA

GRE5 ICP4 IRES NeoR

3.

Células TE CRE GRINA HCMV CRE

 Producción
Producción de
de AMPLICONES
AMPLICONES HSV1
HSV1
CGCM,
CGCM, Lyon
Lyon Francia
Francia
Etapa
Etapa II
Día
Día 0:
0: Células
Células BC6
BC6 (BHK
(BHK que
que expresan
expresan ICP4)
ICP4)
Día
Día 1:
1: Transfección
Transfección con
con pA-transgen
pA-transgen
Día 2: Super-infección
Día 2: Super-infección con
con virus
virus defectuoso
defectuoso helper
helper LaL∆J
LaL∆J
Día
Día 3:
3: Esperar
Esperar
Día 4: Recoger
Día 4: Recoger STOCK
STOCK 1: 1:

vector
vector amplicón
amplicón ++ virus
virus helper
helper

Etapa
Etapa 22
Día
Día 0:
0: Células
Células TE
TE CRE
CRE GRINA
GRINA 129
129 (expresan
(expresan ICP4
ICP4 yy CRE)
CRE)
Día 1: Infección
Día 1: Infección con
con STOCK
STOCK 11
Día
Día 2:
2: Recoger
Recoger STOCK
STOCK 2:
2:

vectores
vectores amplicón
amplicón 55 xx 10
6
106
1%
1% max
max de contaminación 55 xx 10
de contaminación 1044
Titulación
Titulación al
al final
final de
de cada
cada etapa
etapa
 Producción Vectores Amplicones
oriS
Plásmido a Helper virus
Amplicon

TRANSFECCIÓN INFECCIÓN

CÉLULAS Replicación y
BHK-CINA empaquetamiento

FASE I

Vectores Virus
Amplicones auxiliar
 Producción Amplicones usando el sistema LaL-∆J
HSV-1 LaL-∆J
pA (VIRUS AUXILIAR)

Infección

ICP4 HSV-1 LaL-DJ FASE II

CÉLULAS
CÉLULAS
BHK-CINA
TECRE GRINA
ICP4
CRE
Amplicones

FASE I

AMPLICONES
 El sistema HSV-1 LaL-∆J/TE CRE GRINA

∆a LaL ∆a/ICP4 ∆a/ICP4

HSV-1 LaL∆J
UL44

Amplicones +
Helper virus
FASE I HCMV ICP4 IRES NeoR 3:1
Células BHK-CINA

FASE II GRE5 ICP4 IRES NeoR

Amplicones +
Helper virus
Células TE CRE GRINA HCMV CRE
200:1
 TITULACIÓN

Amplicones
Amplicones células
células Gli
Gli 36
36 (glioblastoma)
(glioblastoma)
Día
Día 0:
0: Células
Células Gli
Gli 36
36
Día
Día 1:
1: infección
infección
Día
Día 2:
2: contar
contar número
número de
de células
células GFP+
GFP+

Virus
Virus helper
helper células
células E5
E5 (Vero
(Vero que
que expresan
expresan ICP4)
ICP4)
Días
Días 00 yy 1:
1: igual
igual aa amplicón
amplicón
Días
Días 33 yy 4:
4: contar
contar número
número de
de placas
placas de
de lisis
lisis

Recombinante
Recombinante células
células Vero
Vero (African
(African green
green monkey
monkey kidney)
kidney)
Igual
Igual aa E5:
E5: ver
ver signos
signos de
de citotoxicidad
citotoxicidad
Células GFP +
PRODUCCIÓN
PRODUCCIÓN DE
DE VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES CON
CON EL
EL SISTEMA
SISTEMA LAL-∆J
LAL-∆J

1E+09

1E+08

Helper virus
1E+07 (pfu/ml)

Amplicons
1E+06 (tu/ml)

1E+05

1E+04
Líneas
celulares BHK CINA TE CRE GRINA

En células BHK-CINA, la razón vector/auxiliar es 3:1

En células TE CRE GRINA, la razón vector/auxiliar es 200:1
 Ausencia
Ausencia de
de citotoxicidad
citotoxicidad de
de VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES (48
(48 p.i)
p.i)
Marcaje
Marcaje con
con ioduro
ioduro de
de propidium
propidium (PI)
(PI)

Línea celular Gli36

PI+ =1,8% PI+ = 2,1% PI+ = 36,2%

104
104

104
103
103

103
102
102
PI

PI

102
PI
101
100 101

100 101
100

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
GFP GFP GFP

No infectadas Vector amplicon Vector amplicon (5 TU/cell)

(5 TU/cell) + HSV-1 LaLDJ (2 PFU/cell)
 AUSENCIA
AUSENCIA DE
DE CITOTOXICIDAD
CITOTOXICIDAD DE DE
VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES (48 (48 P.I.)
P.I.)
(coloración
(coloración cristal
cristal violeta)
violeta)
Línea celular Gli36 No infectadas
120
% de supervivencia

Vector amplicon
100 ( 5 TU/cel)

80 Vector amplicon
(5 TU/cel)
60 + HSV-1 LaL∆J
43 %
27 % (2 PFU/cel)
40
HSV-1 LaL∆J
20 (5 PFU /cel)
1,6 %
0 HSV-1 17+
(5 PFU/cel)
 VECTORES AMPLICONES
derivados de HSV-1

Terapia genética Vacunas Transferencia de genes

Enf. cerebrales VHC, VIH Bibliotecas genómicas

bacteria humanas y murinas
 PROCESO
PROCESO DESDE
DESDE DISEÑO
DISEÑO HASTA
HASTA LA
LA
PRODUCCIÓN
PRODUCCIÓN DE
DE UN
UN VECTOR
VECTOR

1.
1. Diseñar
Diseñar el
el “INSERTO”
“INSERTO”

2.
2. Hacer
Hacer el
el plásmido
plásmido con
con el
el transgen
transgen

3.
3. Amplificar
Amplificar plásmido
plásmido VECTOR
VECTOR yy VIRUS
VIRUS
HELPER
HELPER

4. Producir VECTORES
 pA-GFP-loxP

Plásmido amplicón

E. Coli loxP
Cre
loxP Bac-Contig X

Secuencia genómica

CLONAJE
CLONAJE DE
DE UNA
UNA SECUENCIA
SECUENCIA
GENÓMICA
GENÓMICA
DENTRO
DENTRO DE
DE UN
UN PLÁSMIDO
PLÁSMIDO
AMPLICÓN
AMPLICÓN Plásmido amplicón
pA-Contig X
con el transgen
Contig X

pAmplicon
 Construcción de un plásmido amplicón
que lleva una secuencia genómica

p Amplicón virus auxiliar

pA-Contig X

Transfección Infección
Contig X

pAmplicon
Replicación
Encapsidación Encapsidación

Vector amplicón que porta

150 kbp de ADN exógeno
Vectores amplicones
No contaminados
 Clonaje
Clonaje de
de la
la biblioteca
biblioteca genómica
genómica humana
humana en
en amplicones
amplicones
loxP
loxP Contig A
B
C 10 kbp Plásmido amplicón
genes

E. coli-CRE

pA-Contig A pA-Contig B pA-Contig C

Encapsidación
Vectores
Vectores virales
virales

** AAV
AAV recombinantes
recombinantes::
Modelo
Modelo Alzheimer
Alzheimer en
en ratones
ratones

** HSV1
HSV1 amplicones:
amplicones:
Modelo
Modelo EP
EP temporal
temporal en
en ratas
ratas
* Modelo de EPILEPSIA
Parcial Compleja, o del lóbulo temporal
(ratas
(ratas TRANSGÉNICAS)
TRANSGÉNICAS)

VECTOR:
VECTOR: HSV1
HSV1 amplicon
amplicon
Gen:
Gen: enzima
enzima glutamato
glutamato decarboxilasa
decarboxilasa (GAD)
(GAD)
GEN REPORTERO: GFP
GEN REPORTERO GFP junto
junto con
con el
el transgen
transgen

CGMC (Lyon, Francia)

 ¿Qué es EPILEPSIA?
** Crisis
Crisis recurrentes
recurrentes que
que resultan
resultan de
de descargas
descargas
anormales
anormales en
en el
el cerebro
cerebro
Alteración
Alteración de
de conciencia,
conciencia, movimiento
movimiento oo
sensación
sensación

** Causas
Causas desconocidas
desconocidas
Predisposición
Predisposición genética
genética aa heredar
heredar umbral
umbral
bajo
bajo para
para descargas
descargas en
en algunos
algunos casos
casos
Trauma,
Trauma, infección,
infección, tumor
tumor oo ACV
ACV

** No
No hay
hay cura,
cura, puede
puede haber
haber buen
buen control
control
farmacológico
farmacológico
 BALANCE

Inhibición Excitación

Reducción glutamato
Aumento glutamato
Aumento GABA
Reducción GABA
Epilepsia
Aumento
Aumento dede excitabilidad
excitabilidad y/o
y/o
Disminución
Disminución de
de inhibición
inhibición en
en la
la
función
función cerebral
cerebral
Síndrome EPILÉPTICO

1.
1. Exceso
Exceso función
función excitadora
excitadora (( Glutamate)
Glutamate)

2.
2. Déficit
Déficit función
función inhibidora
inhibidora (( GABA)
GABA)

3.
3. Exceso
Exceso de
de función
función Na+
Na+ canales
canales
Síndrome epiléptico:
* Crisis generalizadas (Grand Mal, ausencias)::
Involucra
Involucra todo
todo el
el cerebro
cerebro
Pérdida
Pérdida de
de conciencia
conciencia

* Crisis parciales::
Involucra
Involucra sólo
sólo una
una parte
parte del
del cerebro
cerebro
No
No siempre
siempre hay
hay pérdida
pérdida de
de conciencia
conciencia
1.
1. Simple
Simple
Sensaciones
Sensaciones oo movimientos
movimientos locales
locales no
no
usuales
usuales
2. Compleja
Compleja (EP
(EP temporal)
temporal)
Una
Una disminución
disminución en
en el
el estado
estado de
de
conciencia
conciencia con
con movimientos
movimientos repetitivos
repetitivos
Epilepsia Parcial
EP del Lóbulo Temporal

EP compleja parcial
puede comenzar en una
pequeña área del lóbulo
temporal: AMÍGDALA,
parte del sistema límbico

Estos pacientes
presentan alteraciones
del estado de
conciencia y con
frecuencia síntomas
psíquicos
 Epilepsia parcial compleja
(psycomotora
(psycomotora or
or temporal)
temporal)

** Deterioro
Deterioro de
de la
la conciencia
conciencia

** Compleja
Compleja distorsión
distorsión de
de sensaciones
sensaciones yy
pensamiento
pensamiento (gozo,
(gozo, temor,sonidos,
temor,sonidos, olores)
olores)
Actividad
Actividad motora
motora parcialmente
parcialmente
coordinada
coordinada (automatismos)
(automatismos)

** Con
Con frecuencia
frecuencia difícil
difícil de
de controlar
controlar
Tratamiento
Tratamiento quirúrgico
quirúrgico para
para 30%
30% de
de casos
casos
(sólo
(sólo 50%-60%
50%-60% mejoran)
mejoran)
 “KINDLING”
“KINDLING”
Modelo
Modelo animal
animal EP
EP Parcial
Parcial Compleja
Compleja
** Estimulación
Estimulación eléctrica
eléctrica repetida
repetida con
con
intensidad
intensidad subumbral
subumbral

** En
En regiones
regiones específicas
específicas del
del cerebro
cerebro como
como la
la
amígdala
amígdala

** Esto
Esto lleva
lleva aa aumento
aumento permanente
permanente de
de la
la
susceptibilidad
susceptibilidad aa crisis
crisis EP
EP
Sustrato anatómico SISTEMA LÍMBICO
-- EP
EP parcial
parcial compleja
compleja
-- ‘kindling’
‘kindling’

Una red de estructuras localizadas debajo de la

corteza implicadas en el control de emociones,
afecto y memoria.
‘Kindling’
‘Kindling’
Unas
Unas 22 semanas
semanas luego
luego de
de repetida
repetida estimulación
estimulación sub-
sub-
umbral
umbral los
los animales
animales exhiben
exhiben convulsiones
convulsiones al
al aplicarse
aplicarse la
la
estimulación
estimulación eléctrica
eléctrica
Sus
Sus cerebros
cerebros se
se “sensibilizan”
“sensibilizan” al
al estímulo
estímulo sub-umbral!
sub-umbral!
El
El nombre
nombre viene
viene del
del término
término inglés
inglés “encender”
“encender” por
por la
la
comparación
comparación de
de encender
encender leña
leña con
con pequeños
pequeños tizones,
tizones,
Es
Es como
como “encender”
“encender” el
el cerebro
cerebro
La teoría detrás del kindling…

Pequeños eventos repetidos de

estimulación aumentan la susceptibilidad
para futuros episodios que finalmente
pueden ocurrir espontáneamente

Algo pasa en el cerebro en el tiempo que

aumenta la vulnerabilidad del sujeto para
las crisis.
“Kindling” puede modificar “conexiones” del cerebro

Morimoto K. Progress in Neurobiology, 2004

° Crecimiento de nuevas conexiones.

° Pérdida de las conexiones existentes

En respuesta a exceso de activación neural

(kindling) que lleva a alteración permanente
de la susceptibilidad a las crisis
Epilepsia
Desbalance
Desbalance neuroquímico
neuroquímico en
en el
el cerebro
cerebro
Cambios
Cambios en,
en,

** Amino
Amino ácidos:
ácidos: GLU,
GLU, GABA
GABA
** Neuropéptidos:
Neuropéptidos: NPY
NPY oo Galanina
Galanina
** Factores
Factores neurotróficos
neurotróficos :: BDNF
BDNF
** Citokinas
Citokinas

Pueden
Pueden inducir
inducir crisis
crisis epilépticas
epilépticas
 DENTATE GYRUS
AMIGDALA Cánula Microdiálisis
electrodo
Estimulación
Eléctrica

Animal durante estimulación eléctrica y microdiálisis

 Microdiálisis en hipocampo
durante kindling en amígdala
anterior

Amígdala

Dentate Gyrus

posterior

Cerebro de rata
 MD
EE

Estimulación Eléctrica “kindling” en AMÍGDALA

Temporal lobe

Cerebro rata AP:–3.4 mm bregma

L: 4.5 mm sagittal sinus
 MD
ES

Microdiálisis DENTATE GYRUS (hippocampus)

Cerebro de rata AP:–4.5 mm bregma

L: 2.2 mm sagittal sinus
 Hipocampo
Dentate gyrus

astrocitos

microglia

neuronas
P. Rada Lab. Fisiología Conducta Larisa Poluektova CNND Omaha 2005
 Hipocampo
dentate gyrus ratas

astrocitos

microglia

neuronas

P. Rada Lab. Fisiología Conducta Larisa.Poluektova CNND Omaha 2005

Microambiente bioquímico alrededor de sinapsis

SINAPSIS
SINAPSIS

Espacio
Espacio
Extracelular
Extracelular
Transmisión
Transmisión
Microdiálisis
Microdiálisis química
química
Microdiálisis en movimiento…
Análisis de muestras
Mediciones de glutamato y otros

* HPLC
* CE-LIFD
alta sensibilidad,
buena resolución
muy bajos volúmenes de muestras
recolección en tiempos muy cortos !!
 Primera microdiálisis hipocampo
2da sesión de estimulación eléctrica – No convulsiones

Porcentaje del nivel basal

600

500 Estimulación
Eléctrica
400

300

200

100
control
0
0 100 200 300 400
Tiempo (sec.)
Glutamato aumentó > 300% (CE-LIFD)
 Segunda microdiálisis hipocampo
15ema estimulación eléctrica - Convulsiones
8
Glutamato Gyro dentado
7
Glutamate (1x10-8 M)
6

CONTROL
Control Antes
Antes de Ultima estimulacion
última estimulación

Niveles basales de glutamato están ya aumentados

antes de la estimulación eléctrica
Manipulación de Sistemas
Aminoacidérgicos
por
Transferencia Genética

En “kindling” en ratas
(modelo de EP compleja parcial)
 Transgen enzima
Glutamato
descarboxilasa
(GAD)
en HSV1 amplicones

º Más GABA en
hipocampo

º Modificación de
“Kindling” y su
correlato bioquímico ??

Sinapsis aminoacidérgicas
RESULTADOS esperados

* Cambios de conducta
-tests conductuales-

* Cambios químicos:
-microdiálisis y análisis de muestras-

Con respecto a los cambios ya conocidos durante

“kindling”
 TENDENCIAS EN TECNOLOGÍA
TRANSFERENCIA GENÉTICA

1.
1. Más
Más aplicaciones
aplicaciones pre
pre clínicas
clínicas yy clínicas
clínicas
Probar
Probar en
en más
más enfermedades
enfermedades mono,
mono, multigénicas
multigénicas yy
otras:
otras::
otras
PD,
PD, ALS,
ALS, epilepsia,
epilepsia,, diabetes,
epilepsia diabetes, hipertensión,
hipertensión,, AR
hipertensión AR etc.
etc.

2.
2. Optimización
Optimización de
de vectores
vectores como
como “drogas”
“drogas”
Seguridad:
Seguridad:: inmunogenicidad
Seguridad inmunogenicidad dede vectores
vectores
Prevención
Prevención de
de replicación
replicación viral
viral
Evitar
Evitar agentes
agentes contaminantes
contaminantes
Prevención
Prevención de
de mutaqgénesis
mutaqgénesis insercional
insercional
Prevención
Prevención de
de paso
paso de
de ADN
ADN exógeno
exógeno yy viral
viral aa la
la línea
línea
germinal
germinal
Para el futuro……

Expresión
Expresión genética
genética más
más eficientemente
eficientemente
dirigida
dirigida al
al blanco,
blanco, para
para resolver
resolver más
más
problemas
problemas médicos,
médicos, sin
sin causar
causar daño
daño aa los
los
pacientes,
pacientes, investigadores
investigadores oo ambiente!!!
ambiente!!!
Pero
Pero actualmente,
actualmente,

No
No podemos
podemos utilizar
utilizar los
los vectores
vectores preparados
preparados
fuera
fuera de
de Venezuela
Venezuela porpor regulaciones
regulaciones
aduanales
aduanales internacionales
internacionales

Por
Por tanto
tanto tenemos que producir
tenemos que producir aquí
aquí los
los
vectores
vectores virales
virales si
si queremos
queremos hacer
hacer algo
algo de
de lo
lo
anterior
anterior
 INFRAESTRUCTURA
INFRAESTRUCTURA
PRODUCCIÓN
PRODUCCIÓN DE
DE VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES

A.
A. Cultivo
Cultivo de
de BACTERIAS
BACTERIAS E. E. Coli
Coli competentes
competentes
clonaje
clonaje de
de secuencia
secuencia genómica
genómica enen plásmido
plásmido amplicón
amplicón
producción
producción de
de plásmido
plásmido amplicón
amplicón

B.
B. Cultivo
Cultivo de
de CÉLULAS
CÉLULAS
producción
producción del
del amplicón:
amplicón: células
células BHK
BHK yy TE
TE CRE
CRE GRINA
GRINA
titulación
titulación de
de los
los vectores:
vectores: células
células GLI
GLI 36,
36, E5,
E5, VERO
VERO

C.
C. Producción
Producción de
de VECTORES
VECTORES AMPLICONES
AMPLICONES
FASE
FASE I:
I: amplicones
amplicones yy helper
helper virus
virus
FASE
FASE II:
II: amplicones
amplicones
 Laboratorio de
A BACTERIAS (clonaje)

Centrífuga Campana de trabajo

Trabajo en la campana
regrigerada con bacterias
cultivo de bacterias
maxipreparación
 A Laboratorio de
BACTERIAS (clonaje)

Campana, nevera y mesón Sonicador y centrífuga

 Laboratorio de
A BACTERIAS
(clonaje)

Incubador y agitador
crecimiento de
bacterias
(tubos y matraces)
B LABORATORIOS NIVEL 2 DE SEGURIDAD
B LABORATORIOS NIVEL 2 DE SEGURIDAD

GRUPO
GRUPO 22 DE RIESGO: riesgo
DE RIESGO riesgo individual
individual moderado,
moderado,
riesgo
riesgo comunidad
comunidad bajo
bajo

** Cualquier
Cualquier patógeno
patógeno que
que pueda
pueda causar
causar enfermedad
enfermedad humana
humana
en
en CN
CN improbable
improbable que
que sea
sea un
un peligro
peligro serio
serio para
para trabajadores,
trabajadores,
comunidad,
comunidad, animales
animales oo el
el ambiente.
ambiente.

** Exposiciones
Exposiciones en
en el
el laboratorio
laboratorio rara
rara vez
vez causan
causan infección
infección que
que lleve
lleve aa
enfermedad
enfermedad grave
grave

** Debe
Debe haber
haber tratamiento
tratamiento efectivo
efectivo yy medidas
medidas preventivas
preventivas disponibles
disponibles

** El
El riesgo
riesgo de
de diseminación
diseminación es
es limitado
limitado
 LABORATORIO
LABORATORIO NIVEL
NIVEL 2
2
..
** Los
Los riesgos
riesgos de
de exposición
exposición primaria
primaria nivel
nivel 22 son
son aa través
través de:
de:
ingestión,
ingestión, inoculación
inoculación yy vía
vía de
de entrada
entrada mucosa.
mucosa.

** Aunque
Aunque los
los agentes
agentes nivel
nivel 22 no
no son
son trasmitidos
trasmitidos por
por vía
vía aérea,
aérea,
al
al generarse
generarse aerosoles
aerosoles en
en los
los mesones
mesones pueden
pueden volverse
volverse un un
riesgo
riesgo de
de ingestión
ingestión por
por contaminación
contaminación de de manos
manos oo salpicaduras
salpicaduras

** Usar
Usar dispositivos
dispositivos de
de contención
contención primaria
primaria como
como centrifugas
centrifugas con
con
rotores
rotores sellados
sellados oo tapas
tapas de
de seguridad
seguridad

** Usar
Usar epuipo
epuipo apropiado
apropiado de
de protección
protección para
para el
el personal
personal (guantes,
(guantes,
batas
batas de
de laboratorio,
laboratorio, protección
protección de
de los
los ojos).
ojos).

** Minimizar
Minimizar lala contaminación
contaminación ambiental
ambiental por
por el
el uso
uso de
de lavamanos
lavamanos yy
dispositivos
dispositivos de
de decontaminación
decontaminación (autoclaves)
(autoclaves)
Laboratorio P2
CULTIVO
CULTIVO DE
DE CÉLULAS
CÉLULAS
Y
Y TRABAJO
TRABAJO CON
CON
VECTORES
VECTORES
ambiente Puerta externa al
ambiente cerrado
cerrado aire
aire
corredor
acondicionado
acondicionado

1 2

Cuartos con flujo laminar

Laboratorio P2

Neveras a la entrada de cuartos

de FLUJO LAMINAR
2
 Laboratorio P2

Campana Campana células

vectores

congelador

nevera

Campanas de flujo laminar separadas, para trabajo con vectores

(fondo) para trabajo de cultivo de células (frente)
Laboratorio P2

CAMPANA para TRABAJO CON CÉLULAS

Laboratorio P2

CAMPANA TRABAJO
CON CÉLULAS
Laboratorio P2 Campana células
Laboratorio P2

Campana
Campana antes
antes de
de comenzar
comenzar
 Laboratorio P2
CAMPANA
CAMPANA TRABAJO
TRABAJO
CON VECTORES DESPUÉS
CON VECTORES DESPUÉS
DE
DE USO
USO

Área
Área dentro
dentro de
de la
la desechos
campana
campana
para
para descartar
descartar material
material
contaminado
contaminado con
con vectores
vectores
yy virus
virus
Laboratorio P2

Campana vectores
campana campana células
vectores

Eliminación
Eliminación de
de desechos
desechos en
en P2
P2
Laboratorio P2

Tanque CO2
Incubador 37°C 5% CO2
Líneas celulares

Incubador 34° C 5% CO2

Células infectadas
Laboratorio P2
Material autoclavado

guantes Pipetas y tubos cónicos

Laboratorio P2

Microscopio
Microscopio de
de inversión
inversión para
para ver
ver células
células en
en cultivo
cultivo
Laboratorio P2

Sonicador
Sonicador para
para romper
romper células
células yy agitador
agitador
Protectores
Protectores de
de ultrasonido
ultrasonido
 FREGADERO
FREGADERO DE DE P2
P2
Fuera
Fuera de
de los
los laboratorios
laboratorios con
con flujo
flujo laminar
laminar
 FREGADERO
FREGADERO DE DE P2
P2
Fuera
Fuera de
de los
los laboratorios
laboratorios con
con flujo
flujo
laminar
laminar

Recipientes
Recipientes desechables
desechables con
con
hipoclorito
hipoclorito de
de sodio
sodio antes
antes de
de
descartarlos
descartarlos
 FREGADERO
FREGADERO DE
DE P2
P2
WATER
WATER BATH
BATH 37°C
37°C MATERIAL
MATERIAL PARA
PARA DESCARTAR
DESCARTAR
CUARTO DE LIMPIEZA
GENERAL
Material
Material vidrio
vidrio yy plástico
plástico reusable
reusable

Autoclave
Laboratorio Biología Molecular
Laboratorio
Laboratorio Biología
Biología Molecular
Molecular
Laboratorio Biología Molecular

pipetas

papel
vidrio

químicos
Laboratorio Biología Molecular

Campana para químicos

Laboratorio Biología Molecular

Cuarto frío a 4°C

 Centífuga
Centífuga refrigerada
refrigerada eppendorfs
eppendorfs
Laboratorio Biología Molecular

PCRs
Centrífuga
Centrífuga para
para eppendorfs
eppendorfs
minipreps
minipreps
Laboratorio Biología Molecular

Vortex,
Vortex, spinner
spinner
Incubador
Incubador diferentes
diferentes temperaturas
temperaturas
Laboratorio
Biología Molecular

Electroforesis
Electroforesis de
de geles
geles
de
de agarosa
agarosa
 Laboratorio
Biología Molecular

Transiluminación
Transiluminación yy fotografía
fotografía
geles
geles de
de agarosa
agarosa
Laboratorio Biología Molecular

Baño 37°C digestiones

 Laboratorio
Biología Molecular
refrigeración
Neveras
Neveras -20ºC
-20ºC
Enzimas,
Enzimas, ADNs
ADNs

Congeladores
Congeladores -80ºC
-80ºC
Vectores
Vectores yy virus
virus
Laboratorio Biología Molecular

Fregadero
Oficina
Escritorios, computadoras
¿Podremos hacerlo?
…??