Ut 7. Clonacion de Acidos Nucleicos 2

UT 7.
CLONACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS 2
Fases del proceso de clonación 2
• Fase I: creación de un vector

recombinante.
• Fase II: Introducción del vector
recombinante en la célula hospedadora.
• Fase III: Selección e identificación de los
clones que portan la secuencia de
interés.
Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018
Creación de un vector
3
recombinante
• Un vector recombinante es aquel que
contiene un inserto de ADN extraño.
• Su creación requiere:
• Preparar el ADN que se va clonar
• Preparar el vector de clonación
• Provocar la unión de ambos mediante la acción de
una ligasa.
• Para ello es necesario crear extremos
cohesivos y complementarios en los extremos
de ambas moléculas.
4

Preparación del ADN que se va
a clonar 5
• Se trata con una enzima de restricción que genere

extremos cohesivos
• Se digiere el ADN genómico completo de un
organismo con la enzima de restricción
• La diana de restricción no debe estar en el interior
de la secuencia de interés (la que queremos clonar)
• El vector debe tener una diana de restricción para
la misma enzima (compatibilidad ADN-vector).
a clonar 6
• La digestión del ADN genómico genera múltiples
fragmentos de diferentes tamaños, alguno de los
cuales contendrá la secuencia de interés.
• Conocer que fragmento concreto posee la secuencia de
interés es complicado (requiere la realización de varias
clonaciones, tantas como fragmentos se han originado
y la identificación del clon de interés)
• Esto sólo es rentable cuando se quiere elaborar
librerías genómicas, es decir, obtener células
hospedadoras productoras de todos los fragmentos
generados a partir del ADN genómico.
a clonar 7
• Cuando interesa en realidad la clonación de un único

gen, se recurre a la PCR
• Se amplifica, previamente, el gen de interés mediante
PCR a partir del ADN genómico
• Si se emplean polimerasas sin actividad correctora se
generan amplicones con una A extra en cada extremo
3’, desapareada y sobresaliendo de la doble hélice.
• Estos amplicones se pueden insertar en vectores que
tienen sendas T desapareadas en sus extremos 3’,
llamados vectores-T.
Preparación del vector de
clonación 8
• Consiste en digerirlo con la misma enzima de
restricción que se utilizó para preparar el ADN
que se va a clonar.
• Hay varias situaciones posibles:
• Vector circular, con diana de restricción única: tras el
tratamiento enzimático, el vector se transforma en
una molécula lineal con extremos cohesivos.
• Vector circular con dos dianas de restricción. Tras la
digestión enzimática se obtienen dos moléculas
lineales con extremos cohesivos y con tamaños muy
diferentes:
clonación 9
• Fragmento de mayor tamaño, que contiene los

marcadores genéticos de selección e
identificación y va a ser la base para el vector
recombinante
• Fragmento pequeño, que no porta
información genética de interés para la
clonación y que va a ser sustituido por el ADN
extraño.
clonación 10
• Vector lineal con diana de restricción única, que tras la

digestión enzimática, se divide en dos fragmentos o brazos,
izquierdo y derecho, cada uno con un extremo romo y un
extremo cohesivo.
• Vector lineal con dos dianas de restricción (como el fago
λ, con la acción enzimática se obtienen
• dos brazos: izquierdo y derecho, con un extremo romo y otro
cohesivo
• y una región central con ambos extremos cohesivos.
• La región central no se requiere para la clonación y será sustituida
por el ADN extraño. Los brazos portan los marcadores de
selección e identificación.
11

Inserción del ADN extraño en
el vector 12
• Se mezclan ambas moléculas en concentraciones

adecuadas
• Se incuban en las condiciones óptimas
• En presencia de la ligasa, se unen a través de los
extremos cohesivos generados por la misma enzima de
restricción mediante complementariedad de bases
• La ligasa sella covalentemente las mellas en la doble
hélice de ADN, produciendo el vector recombinante.
• Esta reacción se denomina ligación.
Inserción del ADN extraño en
el vector 13
• Tras la ligación se obtiene el vector recombinante
específico.
• También se obtienen muchos productos no deseados:
• Vectores recircularizados sin ADN extraño
• Moléculas de ADN extraño unidas entre sí
• Vectores unidos entre sí
• Combinaciones de vector y ADN extraño con distintos
grados de complejidad, etc.
• Todos estos productos se introducen en células
hospedadoras y se van eliminando en fases
posteriores de la clonación.
Introducción del vector en la
célula hospedadora 14
• Los métodos más habituales:

• transformación bacteriana,
• transfección
• transducción
• electroporación

Transformación bacteriana 15
• Consiste en la captación e internalización por

parte de una bacteria de moléculas de ADN
desnudas presentes en el medio externo.
• Sólo pueden hacerlo las bacterias llamadas
“competentes”
• La bacteria más utilizada como hospedadora, E.
coli, no es competente de forma natural, por
lo que hay que transformarla en competente.
Transformación bacteriana 16
• El método más habitual para hacer competente para E.

coli consiste en un tratamiento :
• químico (con cloruro cálcico)
• y físico (choque térmico)
• Aumenta la permeabilidad de la pared y la membrana
celular, facilitando la incorporación del vector
recombinante al interior de las bacterias.
• Finalizado el protocolo, las bacterias se siembran en
placas con medio de cultivo adecuado y se precede a
la selección de los clones recombinantes
Transfección 17
• Las células hospedadoras con eucariotas,

de origen animal
• La transfección se podría definir como
la introducción de vectores
recombinantes en células eucarióticas no
mediada por virus.
• Se utilizan agentes químicos

Transfección 18
• Ejemplos:
• Se añade el vector recombinante en una solución
tamponada de fosfato cálcico sobre un cultivo de
células animales en monocapa. El vector
coprecipita junto con el fosfato cálcico sobre las
membranas celulares y es introducido en el
interior de la célula por endocitosis.
• Otro método con el que se consigue una mayor
eficiencia se basa en incluir el vector en el
interior de liposomas. Estos se fusionan con las
membranas celulares y liberan su contenido al
interior de la célula.
Transducción 19
• Consiste en la introducción de material

genético extraño en una célula por la acción de
un virus.
• El vector recombinante se empaqueta dentro de
la cápside de un virus con el que se infecta un
cultivo de células hospedadoras.
• La situación más habitual es la infección de
cultivos bacterianos con fagos recombinantes o
cósmidos empaquetados en fagos
Transducción 20
• Al infectar un cultivo bacteriano sensible, los

viriones introducen el material genético que
contienen (vector) en el interior de la bacteria
infectada.
• Si el vector es un fago recombinante, se
desencadena un ciclo lítico, ya que contiene
todos los genes necesarios para ejecutarlo.
• Los genes de ciclo lisogénico se han sustituido
por el ADN extraño a clonar
21
Estructura del genoma del fago λ. Su utilización como vector implica la

sustitución de la región central por ADN extraño, previa digestión con
EcoRI. La molécula recombinante puede circularizar gracias a las
secuencias COS de los extremos. Estas secuencias son necesarias para su
empaquetamiento dentro de la cápside vírica.
Electroporación 23
• Consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto

voltaje a una mezcla de células hospedadoras en
suspensión y vectores recombinantes en solución.
• Los pulsos aumentan la permeabilidad de las
membranas, permitiendo el paso de los vectores al
interior de la célula.
• Es un método de gran eficiencia y se puede aplicar
con todo tipo de células hospedadoras (bacterias,
levaduras, células vegetales, células animales,
etc.).
Selección e identificación de
clones recombinantes 24
• Una vez terminado el proceso de introducción del

vector en la célula hospedadora, se obtiene una
mezcla con tres tipos de células:
• Células no transformadas, que no han captado
ninguna molécula de ADN extraño.
• Células transformadas que portan el vector
recombinante específico.
• Células transformadas que portan un vector no
recombinante o alguna molécula de ADN no
deseada producida durante la ligación.
• Es necesario un proceso de:
• Selección para la eliminación de

células no trasformadas
• Identificación de los clones

recombinantes, que serán aquellos que
porten el vector recombinante
específico.
• La selección e identificación se realiza

estudiando los marcadores genéticos que porta el
vector:
• genes de resistencia a antibióticos
• enzimas que producen reacciones coloreadas
• proteínas fluorescentes
• genes letales, etc.

Genes de resistencia a
antibióticos 27
• Se basa en el empleo de vectores con dos genes de

resistencia a antibióticos, normalmente ampicilina y
tetraciclina
• El punto de inserción del ADN extraño se encuentra en
el interior de la secuencia de uno de los genes de
resistencia (por ejemplo, tetraciclina),
• En los vectores recombinantes ese gen no es
funcional, ya que su secuencia está interrumpida por el
inserto de ADN extraño (inactivación por inserción).
antibióticos 28
• Cuando se introduce este vector en bacterias sensibles a la

ampicilina y la tetraciclina se obtienen tres tipos de
células:
• Células que no han incorporado el vector: NO
TRANSFORMADAS, sensibles a la ampicilina y la
tetraciclina
• Células que han incorporado el vector recombinante:
TRANSFORMADAS, resistentes a la ampicilina y sensibles a
la tetraciclina.
• Células que han incorporado el vector sin inserto:
TRANSFORMADAS, resistentes a la ampicilina y a la
tetraciclina
antibióticos 29
• SELECCIÓN: para seleccionar las células que

incorporaron el vector se cultivan las células en un
medio de cultivo sólido con ampicilina, en el que solo
crecerán las bacterias transformadas.
• IDENTIFICACIÓN: para identificar aquellas
transformadas que portan el vector recombinante se
replica la placa con ampicilina en otra placa con
tetraciclina, en la que solo crecerán las bacterias
transformadas con el vector no recombinante.
• En consecuencia, los clones recombinantes serán las
colonias que crecen en la placa con ampicilina y no
crecen en la placa con tetraciclina.
Selección e identificación de colonias con plásmidos recombinantes
basados en dos genes de resistencia a antibióticos. En una placa con
ampicilina crecen todas las bacterias transformadas, puesto que todos
los vectores conservan intacto el gen de resistencia para ese antibiótico. 30
En la placa con tetraciclina solo crecen las bacterias transformadas con
el plásmido no recombinante, ya que en el plásmido recombinante el gen
de resistencia a la tetraciclina se ha inactivado por inserción del ADN
extraño.

Estrategia cromogénica 31
• Se combinan:
• Bacterias hospedadoras lactosa negativas (Lac – )
(incapaces de producir β-galactosidasa). La bacteria
es además sensible al antibiótico para el que porta
resistencia el vector
• Vectores que contienen un gen de resistencia al
antibiótico y el gen LacZα con un polylinker en su
interior.
• En los vectores recombinantes este gen no es
funcional ya que su secuencia se interrumpe por el
inserto de ADN extraño.
• Cuando se introduce el vector en bacterias

sensibles al antibiótico se obtienen tres tipos de
células:
• Células no transformadas, sensibles al antibiótico y
lac –.
• Células transformadas con el vector recombinante
resistentes al antibiótico y lac -
• Células transformadas con el vector no
recombinante, resistentes al antibiótico y lac +
• la SELECCIÓN y la IDENTIFICACIÓN se realizan

simultáneamente cultivando las bacterias en un medio de
cultivo sólido con:
• el antibiótico,
• un inductor del operón lac (IPTG) (la célula produce lactasa)
• y el sustrato cromogénico X-gal (sustituye a la lactosa)
• En este medio solo crecen las bacterias transformadas.
• Las bacterias que portan el vector recombinante (lac –)
producen colonias blancas y las bacterias que portan el
vector no recombinante (lac +) producen colonias azules.
34
Esquema de clonación en un
BAC, en el que la selección e
identificación de los clones
recombinantes se realiza
simultáneamente mediante un
gen de resistencia al
cloranfenicol y una reacción
coloreada basada en la acción
de la β-galactosidasa sobre un
sustrato cromogénico.
Lola Conesa. BMC. APC
08/02/2018
Proteínas fluorescentes 35
• Se emplean vectores con un gen de resistencia

para realizar la selección y un gen que codifica
una proteína fluorescente para la identificación.
• La región polylinker se incluye en el gen de la
proteína fluorescente, de manera que los insertos
inactivan el gen.
• La proteína más utilizada es la proteína verde
fluorescente (GFP), cuyo gen se aisló de una
medusa.
Proteínas fluorescentes 36
• La SELECCIÓN de bacterias transformadas se realiza

por crecimiento en medios de cultivo sólidos con
antibiótico
• La IDENTIFICACIÓN se realiza iluminando las placas
de cultivo con luz ultravioleta.
• Las colonias de bacterias transformadas con
plásmidos no recombinantes presentarán
fluorescencia verde,
• Las colonias transformadas con plásmidos
recombinantes no tendrán fluorescencia.
Genes letales 37
• SELECCIÓN: Utiliza vectores con un gen de

resistencia a un antibiótico
• IDENTIFICACIÓN: Un gen que codifica para una
proteína letal para las bacterias con un
polylinker en su interior.
• En los vectores recombinantes la proteína
letal no es funcional porque la secuencia
génica queda interrumpida por el inserto de
ADN extraño.
Genes letales 38
• Se cultivan las bacterias en un medio con el
antibiótico en cuestión.
• En este medio únicamente se desarrollan las
bacterias que porten el vector recombinante.
• Las bacterias no transformadas no crecen
porque son sensibles al antibiótico
• Las bacterias transformadas con el vector no
recombinante mueren por efecto de la proteína
letal.
TASA DE TRANSFORMACIÓN 39
• La tasa de transformación mide la eficiencia

de la introducción del vector en la célula
hospedadora.

• VT es el volumen total de la solución en la que se

realiza la transformación (µl)
• C, la cantidad del vector empleado (mezcla que
incluye vector recombinante y vector no
recombinante) (µg)
• Vs , el volumen de suspensión bacteriana
transformada utilizada para sembrar una placa de
medio de cultivo sólido con antibiótico
• UFC, las unidades formadoras de colonias que crecen
en dicha placa.
• Se expresa, entonces, como número de células
transformadas/µg de vector.
• En las estrategias cromogénicas se

calcula la tasa de transformación
recombinante, sustituyendo en la
expresión matemática el número de
colonias crecidas en la placa con
antibiótico por el número de colonias
blancas (bacterias transformadas con el
vector recombinante).
• Se calcula también, en la estrategia

cromogénica, el porcentaje de
células transformadas recombinantes
(colonias blancas) respecto del total
de células transformadas (colonias
blancas + colonias azules).

• Si se siembra una placa control sin

antibiótico con el mismo volumen de
suspensión bacteriana transformada crecerán
todas las bacterias
• Se puede calcular así, el porcentaje de
células transformadas (número de colonias de
la placa con antibiótico) respecto de las
células totales en la suspensión (número de
colonias en la placa sin antibiótico).
Bibliotecas de ADN 44
• Una biblioteca o librería de ADN es una colección

de vectores recombinantes clonados cuyas
secuencias de ADN extraño se han obtenido de un
único organismo.
• Las bibliotecas de ADN pueden ser de tres tipos,
dependiendo del origen del ADN clonado:
• Genómicas,
• Cromosómicas
• de ADNc.
Bibliotecas de ADN: GENÓMICA 45
• Se suelen realizar en fagos, cósmidos, BAC o YAC.

• En ella están representados, supuestamente, todos
los genes de un organismo.
• El número mínimo de clones necesario para que esta
condición se cumpla con una probabilidad
prácticamente del 100% puede calcularse
matemáticamente.
• Como referencia, una biblioteca genómica humana
en fago λ debería contener varios cientos de miles
(aproximadamente 8 ∙ 105) de clones para
asegurarnos la representación de todo el genoma.
Obtención de una biblioteca genómica en
fagos e identificación de un clon
recombinante concreto mediante
hibridación en placas virales. 46

Bibliotecas de ADN: CROMOSÓMICA 47
• Son bibliotecas de ADN construidas a partir

de un único cromosoma o fracción
cromosómica.
• Se fabrican partiendo de un único
cromosoma previamente aislado de células
mitóticas en metafase, bien por
microdisección, centrifugación en gradiente
de densidad o citometría de flujo.
Bibliotecas de ADN: ADNc 48
• Se obtienen a partir del ARNm de un tejido o una

población celular determinada, previa transcripción
inversa con una retrotranscriptasa.
• Representan solo el subconjunto de genes de un
organismo que se están expresando en un tipo celular
y un estado metabólico concretos.
• En este tipo de bibliotecas, cada clon porta un gen
completo, pero su secuencia difiere de la secuencia
genómica de ese mismo gen, puesto que carece de
intrones, promotores y secuencias reguladoras.
Análisis de una biblioteca de
ADN 49
• El final del proceso de clonación supone

obtener una colección de miles de
clones en forma de :
• Colonias bacterianas
• Fagos recombinantes
• Colonias de levaduras
• Células vegetales o animales
• HAY QUE ORDENAR Y CLASIFICAR (ANALIZAR LA
BIBLIOTECA)
Análisis de una biblioteca de
ADN: PASOS PRINCIPALES 50
1. La identificación del clon o clones que contienen
un gen o una secuencia concreta. Para identificar
los clones que portan un inserto determinado se
utilizan técnicas de hibridación
2. El paseo cromosómico, metodología que sirve para
la identificación de clones que porten secuencias
consecutivas. Se basa en el empleo de bibliotecas
obtenidas mediante restricción enzimática.
3. La secuenciación. El análisis definitivo de un clon
consiste en descifrar la secuencia del ADN insertado
que porta el vector recombinante
Aplicaciones de la clonación
molecular 51
• La clonación en vectores de expresión, que posibilitan la

producción a nivel industrial de proteínas
recombinantes. Como ejemplo, podemos citar:
• De interés médico y farmacéutico: la insulina, la hormona del
crecimiento, el factor VIII, vacunas, reactivos para diagnóstico,
etc.
• De interés en la industria química y de la alimentación: enzimas
y catalizadores.
• De interés medioambiental: la creación de microorganismos
capaces de metabolizar petróleo, productos tóxicos y materiales
de desecho, etc.
Aplicaciones de la clonación
molecular 52
• Creación de OMG por transferencia caracteres de

interés a plantas y animales, produciéndose
individuos más resistentes a enfermedades o a
productos tóxicos, más fértiles, con mayores tasas
de producción, etc.
• En medicina hay dos aplicaciones de la clonación
molecular que tienen actualmente un singular
interés: la creación de ratones transgénicos y la
terapia génica.

Ratones transgénicos 53
• Un ratón transgénico es aquel al que se le ha

modificado su ADN, ya sea por la introducción
de un gen nuevo o por la eliminación de un gen
propio. (ratones knockin y knockout)
• Una aplicación importante de los ratones
transgénicos es el estudio de enfermedades
genéticas, tanto a nivel de comprensión de la
enfermedad, como a nivel de tratamiento.
Terapia génica 54
• Consiste en transferir genes normales a células
somáticas para corregir una enfermedad genética.
• Con esto se pretende conseguir que las células
tratadas sinteticen el producto génico normal,
evitando así un tratamiento farmacológico de por
vida.
• Como en el caso de los OMG, la terapia génica está
sometida a un riguroso control legislativo y ético.
• Así, una posible terapia de células germinales, que
originaría cambios genéticos permanentes en todas
las células de un individuo y su descendencia, es
ampliamente considerada como no ética en humanos

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• Fase I: creación de un vector

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• Se trata con una enzima de restricción que genere

• Cuando interesa en realidad la clonación de un único

• Fragmento de mayor tamaño, que contiene los

• Vector lineal con diana de restricción única, que tras la

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• Se mezclan ambas moléculas en concentraciones

• Los métodos más habituales:

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• Consiste en la captación e internalización por

• El método más habitual para hacer competente para E.

• Las células hospedadoras con eucariotas,

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• Consiste en la introducción de material

• Al infectar un cultivo bacteriano sensible, los

Estructura del genoma del fago λ. Su utilización como vector implica la

• Consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto

• Una vez terminado el proceso de introducción del

• Es necesario un proceso de:

• Selección para la eliminación de

• Identificación de los clones

• La selección e identificación se realiza

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• Se basa en el empleo de vectores con dos genes de

• Cuando se introduce este vector en bacterias sensibles a la

• SELECCIÓN: para seleccionar las células que

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• Cuando se introduce el vector en bacterias

• la SELECCIÓN y la IDENTIFICACIÓN se realizan

• Se emplean vectores con un gen de resistencia

• La SELECCIÓN de bacterias transformadas se realiza

• SELECCIÓN: Utiliza vectores con un gen de

• La tasa de transformación mide la eficiencia

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• VT es el volumen total de la solución en la que se

• En las estrategias cromogénicas se

• Se calcula también, en la estrategia

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• Si se siembra una placa control sin

• Una biblioteca o librería de ADN es una colección

• Se suelen realizar en fagos, cósmidos, BAC o YAC.

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• Son bibliotecas de ADN construidas a partir

• Se obtienen a partir del ARNm de un tejido o una

• El final del proceso de clonación supone

• La clonación en vectores de expresión, que posibilitan la

• Creación de OMG por transferencia caracteres de

Lola Conesa. BMC. APC 08/02/2018

• Un ratón transgénico es aquel al que se le ha

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