Lab. Bioquímica 1 Profra.

Miroslava Suárez

Práctica No. 7: “Extracción de ADN de Tejidos Vegetales”

OBJETIVO
Extraer mediante un método sencillo el ADN de tejido vegetal y comprobar su extracción
mediante la reacción de Dische.

INTRODUCCIÓN
La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos
son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de
la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido
molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón
contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras
sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán
fraccionado en cadenas más pequeñas y separado de él por acción del detergente. Sólo queda, por
tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol
isoamílico.
LECTURA OBLIGATORIA

Ácidos Nucleicos es una expresión que designa a todo un conjunto de moléculas con
estructura general de poliribonucleótidos y polideoxiribonucleótidos. Sin embargo, no todas estas
moléculas se encuentran en el núcleo de la célula como el nombre lo haría esperar. El término
“Ácidos Nucleicos” se sigue empleando universalmente para designar a todo este conjunto de
moléculas, prescindiendo de su localización particular en las células.
El Acido Desoxirribonucleico o ADN (DNA en inglés), es el material genético de las células.
Es un polideoxiribonucleótido capaz de replicarse, y que en su molécula tiene codificadas a todas
las características de los demás constituyentes de la célula, y en esa forma, se puede decir, que tiene
el control de todos los procesos vitales.
Cada molécula de ADN está formada por dos cadenas sencillas complementarias, unidas
entre sí por puentes de hidrógeno, para formar la doble hélice propuesta por Watson y Crick. Lo que
forma la columna vertebral de cada cadena sencilla de ADN es una cadena polimérica de 2-
deoxiribosas unidas entre sí por uniones fosfodiéster, del hidroxilo 3 de un monómero al hidroxilo
5 del siguiente monómero. En la posición 1 de cada deoxiribosa hay una base nitrogenada, que
puede ser púrica (adenina o guanina), o pirimidínica (citosina o timina).
El ácido Ribonucleico o ARN (RNA en inglés), tiene dos diferencias básicas con el ADN. El
carbohidrato es Ribosa en vez de deoxiribosa, y Uracilo sustituye a Timina como una de las bases
pirimidínicas. Sin embargo, Uracilo también puede unirse a Adenina. La molécula de ARN actúa en
el proceso de traducción del mensaje genético a estructura proteica, y así, es indispensable para la
síntesis de todas las proteínas celulares. Este proceso es muy complicado y requiere de tres distintos
tipos de ácidos ribonucleicos: el ARN mensajero (ARNm), el ARN ribosomal (ARNr) y los ARNs de
transferencia (ARNt). Cada uno de estos tres tiene su composición, estructura y función particular.
El ADN es de muy alto peso molecular, y es una doble hélice de estructura más o menos
rígida. Esto tiene como consecuencia que las soluciones de ADN sean extremadamente viscosas y
que baste calentar las soluciones para que disminuya esa viscosidad, debido al rompimiento de los
puentes de hidrógeno que unen a las dos cadenas. El ARN tiene pesos moleculares menores y por
lo general es de cadena sencilla, lo cual hace que las soluciones de ARN sean mucho menos viscosas.

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Para aislar a los Ácidos Nucleicos, libres de otros componentes tisulares, se siguen
normalmente los siguientes pasos: a) rotura de las membranas celulares por Homogenización, b)
Desnaturalización y remoción de las proteínas y c) precipitación de los ácidos nucleicos.
Todos los pasos hasta antes de la desnaturalización de las proteínas deben llevarse a cabo
a cero grados centígrados, para evitar la acción de las enzimas nucleasas, que romperían las cadenas
y evitarían el aislamiento de los ácidos nucleicos como tales.
El ADN es estable a la acción del Hidróxido de Sodio 1.0 N mientras que el ARN se hidroliza
fácilmente, debido a la presencia del hidroxilo en el carbono dos de la ribosa. Esto da la posibilidad
de separar a ambos cuando están en mezcla.
Para extraer a los ácidos nucleicos de los tejidos se puede usar las soluciones de sales
neutras o los álcalis, o con fenol. Una vez extraídos se pueden precipitar con alcohol o ácido. La
identificación se hace por reacciones de color.
Reacción de Dische (Difenilamina)
En esta reacción se produce un color azul debido a la presencia de la 2-deoxiribosa. El
intermediario responsable del color azul es el aldehído omega-hidroxilevulínico, al que se convierte
la deoxiribosa por la acción del ácido acético o sulfúrico. El hidroxilevulaldehído se condensa con la
difenilamina para dar el color azul.
Toda sustancia que dé un compuesto aldehídico como intermediario, dará positiva la
reacción. La fructosa que por la acción del ácido da Hidroximetilfurfural, produce un color verde con
este reactivo. La intensidad del color azul de la reacción positiva se puede usar para mediciones
cuantitativas. El máximo de absorción es de 595 nanómetros.
Los reactivos de Bial y Dische se pueden aplicar directamente a las soluciones de ARN y ADN,
porque los ácidos fuertes que se emplean en estos reactivos hidrolizan a los nucleótidos, y los
azúcares liberados reaccionan con los reactivos cromogénicos, para dar el color. Los azúcares unidos
a las bases en los nucleótidos NO dan positiva la reacción.
Para hacer las reacciones cuantitativas se deben tener los patrones puros para poder
comparar las intensidades de color. Para ARN se puede usar como patrón a la Ribosa pura, mientras
que para el ADN se tiene que usar un patrón de ADN purificado.
Hay que tener cuidado con las reacciones cruzadas. La deoxiribosa reacciona ligera pero
mediblemente con el reactivo de Bial, así que el cálculo colorimétrico de ARN en presencia de ADN
debe tener en cuenta la absorbancia contribuida por el ADN.
En cambio, la reacción de Dische para el ADN en presencia de ARN no tiene ninguna
interferencia. Para preparar los estándares basta hacer soluciones de 50 a 250 microgramos por
mililitro. Para hacer un análisis verdaderamente cuantitativo hay que sacar la proporción del fósforo
y de las bases para obtener el verdadero porcentaje de ribosa y deoxiribosa.

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MATERIAL NECESARIO:
- Solución amortiguadora o tampón casera (la prepararán en casa).
- Hielo (es muy importante).
- Alcohol
- Muestra de algún vegetal fresco (tomate, fresa, plátano, calabaza, etc.)
- Licuadora, puede ser la convencional o portátil
- 2 fracos o botellas de plástico pequeñas (aprox 150-200 ml) con tapa.
- Vaso de plástico o vidrio transparente
- Cuchillo
- Recipiente hondo o bandeja que funcionará como una cuba hidroneumática
- Cuchara
- Palillo o picadiente

Pueden ver el video https://youtu.be/PkjtFM_UVxk para tener una idea de lo que van a hacer en
la práctica.

PROCEDIMIENTO

Preparación de solución amortiguadora:

- También es llamada solución buffer o tampón. Se debe preparar con anterioridad para dejarla
enfriar.
- 240 ml agua mineral (1 taza) + 3 g de sal (1/2 cucharada sopera) + 10 g de bicarbonato de sodio
(2 cucharadas soperas) + 10 ml de champú o jabón líquido para platos (2 cucharada soperas).
- Mezclar muy bien los ingredientes y almacenar en una botella de plástico tapada.
- Enfriar a 3° C (temperatura del refrigerador).
- La solución tampón contiene una concentración muy alta de iones que permite romper las
membranas de las células y del núcleo.

Preparación del material biológico:

- La trituración del material biológico, debe hacerse en frío.
- Con el cuchillo se trocea el vegetal, se les añade un poco de agua fría y a continuación se trituran
utilizando una licuadora portátil. *
- Para triturarlo se dan tres pulsos de 5 segundos cada uno. Si es posible hacerlo en frío,
sumergiendo en agua con hielo el vaso donde se va a licuar.
- * OJO: si el vegetal seleccionado es muy blando, se puede omitir el paso de licuar con agua y
solo se trocea o aplasta manualmente para obtener el puré.
- Al triturar las verduras lo que hacemos es romper las membranas de muchas células con lo que
liberamos su contenido (orgánulos, núcleos, proteínas, ADN, ARN).

Mezcla del “puré” con el tampón frío:

- Se toman aproximadamente 10 ml del triturado (2 cucharadas soperas) y se depositan en un
vaso o botella con tapa. A continuación, se le añaden aprox 20 ml de la solución tampón fría (el
doble del volumen del triturado).
- Se tapa la botella y se agita VIGOROSAMENTE durante 2 minutos.
- Al mezclar el “puré” con la solución tampón conseguimos que se rompan las membranas de las
células y de los núcleos sin que se estropee el ADN que queremos obtener. Además, el
detergente que lleva el tampón ayuda a terminar de romper las membranas de los núcleos

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Estos pasos se
sustituirán por
una filtración celulares en los que se encuentra el ADN y además elimina proteínas que se encuentran
con el colador protegiendo el ADN.

Centrifugación:
- El contenido de la botella con tapa se separa en dos tubos de ensayo para centrífuga, de manera
que los dos tengan la misma masa. A continuación, estos tubos se ponen en la centrífuga
durante 5 min a 1000 rpm. Con la centrifugación se separan los materiales más grandes, como
células enteras, membranas, grandes orgánulos (se quedan en el fondo del tubo) de los
materiales más pequeños como proteínas, pequeños orgánulos, ADN y ARN (que quedan en el
líquido sobrenadante).

Recoger el sobrenadante. Tras la centrifugación se recoge el sobrenadante (con cuidado de no

coger el precipitado) de cada uno de los tubos de ensayo; para ello nos ayudamos de una pipeta
Pasteur o verter con mucho cuidado el sobrenadante a un vaso. Este sobrenadante lo pondremos
en el vaso pequeño para recoger la porción en la que se encuentra el ADN (además de otras
sustancias como ARN, proteínas y pequeños orgánulos).

- Filtración con colador:

- La mezcla de la fruta triturada con la solución amortiguadora se hace pasar por un colador y el
filtrado se recoge en un vaso de plástico o vidrio transparente.

-Añadir 10 ml de alcohol frío:

Al líquido filtrado con el colador se le añaden el alcohol en el vaso sobre nuestra muestra con mucho
cuidado: para ello se va dejando caer el alcohol lentamente sobre las paredes del vaso. Esto hace
que el ADN precipite en la interfase propanol-agua.
-Recoger el ADN con un palillo o a varilla de vidrio:
Tras añadir el alcohol en nuestra muestra han quedado dos fases, una superior (contiene el alcohol)
y otra inferior (buffer/agua). Se introduce un palillo, cuchara o varilla de vidrio en la interfase entre
el isopropanol y el resto de la muestra y girando con cuidado de uno a otro lado durante 1 min.
Entonces se saca el palillo y en ella tenemos pegado el ADN. Al recoger el ADN (también nos llevamos
el ARN).

En los laboratorios de biología molecular se añadiría una enzima que destruye el ARN de modo que
sólo obtuviésemos ADN. Añadir una gota de azul de metileno al tubo de ensayo. El método que
hemos utilizado para extraer al ADN no es todo lo eficiente que quisiéramos, con lo que en la
muestra todavía queda ADN sin extraer. Al añadir el azul de metileno, en la interfase, se teñirán las
fibras de ADN que no hemos conseguido extraer.

NOTA: A pesar de que no es mucha la eficiencia del método que hemos usado es posible utilizar el
ADN obtenido para realizar otros experimentos.
Fuente: CARLSON, S. (1998). Deshilando el tejido de la vida. Investigación y Ciencia. 266, 84-85. Para más
información: http://www.edvotek.com/web2.thesphere.com/SAS/WebX.cgi

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No la podrá
VER EL VIDEO: https://youtu.be/cYmzyRlbw0s realizar, pero
observará el video
Reacción de Dische

1. Coloque en su gradilla 2 tubos de ensaye de 13 x 100 e identifíquelos de alguna manera.

2. Pipetee 2.0 ml. de la ‘fracción de ADN’ al tubo número uno.
3. Pipetee 2.0 ml. de agua destilada al tubo número dos.
4. Pipetee 5.0 ml. del Reactivo de Dische, ya preparado, a cada uno de los tubos. Mezcle bien el
contenido de los tubos y déjelos en el baño de agua hirviendo por 15 minutos.
5. Observe el color azul violáceo que aparece en la reacción positiva.
6. Anote sus observaciones y resultados.
Lo que acaba de practicar es la:
Reacción de DISCHE o de la difenilamina

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FUNDAMENTOS:

Escriba brevemente el fundamento científico de los procedimientos y reacciones aquí practicadas.

Si es necesario consulte su libro de texto.

-Fundamento del aislamiento de ADN

-Fundamento de la reacción de Dische

RESULTADOS EXPERIMENTALES

- Aislamiento de ADN
Observación de extracto de ADN: ____________________________________________

- Reacción de Dische
Tubo Color Tiempo
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CUESTIONARIO

1. ¿Qué diferencia hay entre la estructura y función del DNA y la estructura y función del RNA?
2. ¿Cuál de los ácidos nucleicos tiene mayor peso molecular y cual menor y por qué?
3. ¿Porqué los primeros pasos que se siguen para aislar ácidos nucleicos hay que hacerlos entre cero
y cuatro grados de temperatura?
4. Le conviene tener clara y precisa la estructura molecular de la Doble Hélice del DNA con todas sus
características. Así mismo la estructura de los Ribosomas y de los RNA de transferencia. Anótelas.