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Prctica 2: extraccin de ADN plasmdico

Los plsmidos son molculas de ADN extracromosomal los cuales estn


presentes en algunas clulas bacterianas, levaduras y hongos. Los mismos
poseen ADN de doble hebra, mayormente son circulares pero tambin se han
encontrado plsmidos lineales. La replicacin de los plsmidos es independiente
de la replicacin del cromosoma del husped ya que los plsmidos poseen su
propio origen de replicacin. El nmero de copias de un plsmido en la clula es
variable, todo depende del origen de replicacin del que posea el mismo y su
regulacin. En aos recientes se han identificado en una gran variedad de
bacterias un gran nmero de plsmidos inusuales o raros. Por ejemplo, se han
encontrado plsmidos lineales de doble cadena en Borrelia y Streptomyces;
estos plsmidos tienen estructuras moleculares muy parecidas a las de virus
animales. En bacterias tan diversas como E. coli y myxobacterias se ha
encontrado ADN de hebra sencilla multicopia (msDNA) con ARN unido al extremo
5; dado que las tcnicas que se han utilizado para detectar este tipo de plsmidos
no son muy comunes (por ejemplo electroforesis de campo pulsante) su
frecuencia y distribucin an no se conoce. Los plsmidos generalmente no son
esenciales para el desarrollo o supervivencia de la clula pero le proveen una
ventaja competitiva a las clulas que los poseen, dado a que los plsmidos
poseen genes que le confieren caractersticas selectivas a su husped tales como
resistencia a antibiticos, nuevas habilidades metablicas como degradacin de
carbohidratos, factores de virulencia y produccin de toxinas entre otros. Aquellos
plsmidos de los que an no se ha encontrado un beneficio fenotpico son
denominados crpticos.
Los plsmidos poseen un inters singular en Ingeniera Gentica por ser
uno de los sistemas vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un
sistema que permite introducir en una clula hospedadora un fragmento de ADN
que se pretende clonar; en esta clula hospedadora el vector se replica y expresa,
en su caso. La molcula que resulta de la unin de un ADN vector con el ADN de
inters (denominado entonces "inserto") se denomina molcula de vector
recombinante. Existen unos requerimientos bsicos que un plsmido debe poseer
para que sea un buen vector al aplicar su uso en la biologa molecular. Debe
poseer un origen de replicacin, un gen para un marcador de seleccin (ya sea
resistencia a algn antibitico) y un lugar de clonaje mltiple (MCS). El MCS es
una regin donde pueden digerir varias enzimas de restriccin pero solamente una
Un requisito obvio para la clonacin o experimentacin en plsmidos es la
purificacin del ADN plasmdico (ADNp). Uno de los parmetros importantes
durante la purificacin es la lisis de las bacterias. Una lisis incompleta o la
disolucin total de la clula, trae como resultado muy bajos rendimientos en la
recuperacin de ADNp. La situacin ideal ocurre cuando cada clula est lo

suficientemente rota para que salga el ADNp pero no permita la contaminacin con
ADN genmico (ADNg).
El mtodo ms comn y popular para preparar ADNp es el que
desarrollaron Birnboim y Doly en 1979. Este mtodo se basa en el hecho de que a
pH 12.0 - 12.5 el ADN lineal se desnaturaliza y no as el ADN circular, los cuales
son los plsmidos que se purifican. Las clulas que contienen plsmidos son
tratadas con lisozima para romper la pared celular; posteriormente son lisadas con
hidrxido de sodio y SDS. El ADNg permanece como molculas de alto peso
molecular pero desnaturalizado. Despus de la desnaturalizacin el ADNg se
renaturaliza y se agrega en una red insoluble al agregar acetato de sodio cido. Al
mismo tiempo, la alta concentracin de acetato de sodio causa la precipitacin de
los complejos protena-SDS y ARN de alto peso molecular. Debido a que el pH del
paso de desnaturalizacin alcalina ha sido controlado cuidadosamente, el ADNp
permanecen en estado nativo y en solucin mientras que las molculas
contaminantes co-precipitan. El precipitado puede eliminarse mediante
centrifugacin y el plsmido puede concentrarse por precipitacin con etanol o
isopropanol.
Objetivo.
Extraer el ADN plasmdico de un cultivo de E. coli DH5.

Protocolo para la purificacin de ADNp


Obtencin de clulas.
1. Crecer 5 mL de cultivo de E. coli en medio LB con 100 ug/mL de ampicilina la
noche anterior (la cepa de E. coli se proporcionar en caja para su cultivo)
2. Centrifugar 3 mL de cultivo a 10000 rpm durante 3 min.
Lisis.
3. Decantar el sobrenadante y resuspender el botn celular en la gota que queda.
4. Aadir 100 uL de solucin I (glucosa 50mM/EDTA 10mM/Tris 25mM pH 8.0) y
dejar 5 min a temperatura ambiente.
5. Aadir 200 uL de solucin II e invertir el tubo 5 veces. Inmediatamente despus
poner en hielo 5 min. NO VORTEXEAR. PRECAUCIN: el tiempo no debe ser
mayor ya que se degradar el ADNp.
6. Aadir 150 uL de solucin III enfriada en hielo (acetato de sodio 3M pH 5.2) y
mezclar por inversin varias veces hasta que se forme un precipitado blanco.
7. Incubar en hielo 4 min.
Purificacin.

8. Centrifugar 3 min a 10000 rpm y colectar los 350L superiores del


sobrenadante.
9. Aadir 5 uL de 1mg/mL RNAsa A e incubar 15 min a 37C (si hay).
10. Hacer 1 extraccin con 1 vol de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1).
Centrifugar y colectar la fraccin superior en otro tubo.
11. Hacer una extraccin con 1 vol cloroformo:isoamlico 24:1 (SEVAG).
Centrifugar y colectar la fraccin superior en otro tubo.
12. Aadir 0.6 vol. de isopropanol, mezclar suavemente y centrifugar a 10000 rpm
5 min.
13. Descartar el sobrenadante y lavar con 1 mL de etanol al 70%. Centrifugar a
10000 rpm 5 min.
14. Descartar sobrenadante, secar el pellet y resuspenderlo en 30 L de buffer TE.
15. Verificar en un gel de agarosa al 1% (cargar 5 uL de muestra).

Soluciones:
-Solucin I Buffer de resuspensin: 25 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM glucosa, 10
mM EDTA. Almacenar a 4C
-Solucin II Desnaturalizacin: 0.2 N NaOH, 1.0% SDS. Almacenar a
temperatura ambiente.
-Solucin III Renaturalizacin: acetato de sodio 3 M pH 5.2.

Cuestionario.
1. Para qu se adiciona ampicilina en el medio de cultivo de las bacterias?
2. Qu finalidad tiene la neutralizacin en el mtodo de lisis alcalina?
3. Por qu la alcalinizacin en presencia de SDS afecta menos a los plsmidos
que al DNA cromosmico?
4. Cules son las 3 diferentes conformaciones que pueden adquirir los
plsmidos?
5. Qu diferencias existen entre un protocolo de extraccin de DNA plasmdico
bacteriano y uno genmico bacteriano?
6. Qu funcin cumple la RNAsa A en el protocolo?
7. Fuera del mtodo de extraccin por desnaturacin alcalina, qu otros mtodos
existen para la extraccin de ADN plasmdico?

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