Universidad San Francisco de Quito

Laboratorio de Ingeniería Genética

Integrantes: Fecha: 13 de febrero de 2023
 Karla Chávez
 Daniel Galarza
Práctica 1 y 2: Extracción de plásmido desde E. coli y elaboración del mapa de
restricción de un plásmido mediante digestión doble
Introducción
Un plásmido se define como una molécula de ADN extra cromosómico de tamaño
pequeño, con forma circular que puede ser hallado en bacterias y otros organismos
microscópicos. Estos están apartados físicamente del material genético cromosómico y a su
vez tienen la capacidad de replicarse autónomamente. Los plásmidos por lo general cuentan
con un número muy reducido de genes y se asocia muchos de estos genes propiedades
sumamente interesantes que les confieren a las bacterias, como la resistencia a antibióticos
(García, 2017). Esto se logra mediante un muestre de pool de elementos genéticos móviles, lo
que le permite a la bacteria portadora del plásmido buscar rasgos adaptativos que puedan ser
ventajosos para su supervivencia bajo la presión selectiva que pueden ejercer los antibióticos.

Los plásmidos poseen esta interesante propiedad de transferencia, lo que quiere decir
que pueden transmitirse de una célula a otra (conjugación). Al ser entidades acelulares, los
plásmidos de cierta forma son muy similares a los virus, ya que poseen el mismo
comportamiento replicativo y son capaces de ser vectores de genes. En la ingeniería genética,
se usan los plásmidos para emplear métodos de ADN recombinante e insertar genes que sean
de interés o que quieran transferir a otra bacteria. Al replicarse el plásmido, este también
realiza copias del gen insertado dentro del él, por lo que se usa mucho dentro de la rama de
ingeniería genética como herramienta de manipulación, clonación y transferencia de genes.
(Lara, 2004).

Hablando específicamente de E.coli, los plásmidos en esta bacteria son muy comunes.
Se han descrito cerca de 300 tipos de plásmidos en la especie. En estos plásmidos se puede
hallar todo tipo de información genética, que va desde resistencia a antibióticos, como la
producción de colicinas, asimilación de algunos azúcares, inmunidad contra fagos, genes que
codifican el intercambio genético y fimbrinas que están concomitadas con la producción de
toxinas y origen de patologías. (Zambrano, 2012).
 Nuevamente, se debe recalcar el uso de los plásmidos como herramientas dentro de la
biología molecular y biotecnología, para la clonación de ADN, ya que se debe saber porque
se está extrayendo dicho plásmido. Su tamaño reducido, permite su fácil extracción y
manipulación. Sus propiedades de replicación y conjugación tienen varias aplicaciones dentro
del campo genético. Existen diversos métodos para emplear una extracción de plásmido,
entre los cuales los más comunes son la extracción por lisis alcalina o lisado de bacteria
usando micro centrifugación. De una u otra forma lo que se busca durante el proceso de
extracción es desnaturalizar el ADN plasmídico y cromosómico, para posteriormente re
naturalizarlo, esto con el propósito de aislar el ADN plasmídico el cual se re naturalizará más
rápido y no se apareará con el ADN cromosómico. (Giménez, 2020).

Una enzima de restricción se define como una proteína asilada, partiendo de bacterias
que cortan pedazos de secuencias de ADN específicas en sitios en concreto. Esto produce
fragmentos de material genético con una secuencia conocida específica en cada extremo a
partir del corte. Su uso es aplicado a tecnología del ADN recombinante, biología molecular y
modificación/ ingeniería genética. (Guerrero, 2000)

Las enzimas de restricción son producidas por bacterias, como un mecanismo de

defensa contra virus e infecciones. Estas enzimas de origen bacteriano presentan actividad
endonucleasa, por lo que cortan enlaces fosfodiéster dentro del ADN en una secuencia muy
específica que se conoce como secuencia Diana.

Métodos

Extracción del plásmido desde E.coli

Previo a la práctica, se seleccionó colonias de E. coli DH10-β y se incubó por 18

horas a 37° C en dos tubos Falcon de 50ml que contenían medio LB líquido. Se transfirió 1.5
ml de cultivo bacteriano a tubos Eppendorf. Previo a esto, se centrifugó durante 5 minutos a
9,700 RPM. Se descartó el sobrenadante y se secó el exceso de medio virando el tubo y
poniendolo en toalla de papel.

Se añadió 250 𝜇L de la solución para resuspensión celular y se resuspendió por

completo el pellet por medio de pipeteo/ vórtex. Tras este paso no se volvió a usar vórtex,
pues este puede causar la fragmentación del ADN cromosómico, por lo que se invirtió los
tubos en su lugar. Se añadió 250 𝜇L de la solución para lisis celular y se mezcló invirtiendo
el tubo un total de cuatro veces. Se incubó por 5 minutos hasta que la suspensión de células
se haya aclarado. Se añadió 10 𝜇L de solución de proteasa alcalina y se mezcló nuevamente
invirtiendo el tubo cuatro veces. Se incubó otros 5 minutos, esta vez a temperatura ambiente.
Se añadió 350 𝜇L de solución neutralizadora e inmediatamente se mezcló invirtiendo el tubo
cuatro veces sin realizar vórtex. Se centrifugó el lisado de bacterias a una revolución de
11,500 RPM por 10 minutos.

Se lavó el pellet con 1mL de etanol al 70% y se centrifugó a 13200 RPM durante 5
minutos un total de 3 veces. Se removió todo el etanol al 70% sin el uso de la micropipeta
para luego dejar secar el pellet 15 minutos. Se resuspendió el pellet en 30-50 𝜇L de agua
ultrapura y se almacenó el plásmido que se extrajo a -20 °C. Se cuantificó dicho producto de
la extracción con Nanodrop.

Se preparó un gel de agarosa al 1% para realizar la electroforesis del plásmido

extraído. Para la preparación del gel se colocó 50 mL de TBE 1X en un Erlenmeyer- Luego.
Se pesó y añadió 0,5 g de agarosa y se calentó en un microondas hasta que la agarosa se haya
disuelto por completo. Se dejó enfriar hasta 40 ºC y se añadió 1.5 𝜇l de SYBR Safe y se
mezcló todo. Se vertió en el molde del gel usando el peine y se solidificó

Para el cargado de las muestras en gel de agarosa y la electroforesis, se colocó 3 μL de

buffer de carga en un trozo de Parafilm. Se agregó después, 5 μL del producto de la
extracción del plásmido. Se colocó las muestras en las ranuras del gel y 2 μL de marcador en
una ranura vacía. Se aplicó voltaje de 80 V durante 40 minutos. Por último, se transfirió el gel
a la lámpara UV y se observó bajo luz ultravioleta.

Elaboración del mapa de restricción de un plásmido mediante digestión doble in silico

Se ingresó a la página benchling.com y se creó una carpeta llamada práctica 1. Una

vez ahí se importaron los plásmidos 1 y 2 en forma circular. Se visualizó el gráfico del
plásmido 1, y a su vez se exoró sus diferentes regiones y etiquetas. Posteriormente, se digirió
el plásmido 1 con EcorI yendo al buscador de enzimas y buscando propiamente esta. Se
repite el mismo paso, pero esta vez únicamente usando la enzima AcuI. Tras realizar la
digestión con ambas enzimas por separado, se digirió nuevamente el plásmido con las dos
(EcoRI y AcuI). En los puntos de la esquina superior derecha, se seleccionó “virtual digest” y
se visualizó el gel resultante de tanto las digestiones simples como la doble. A partir de este
gel, se dibujó un mapa de restricción del plásmido 1 con sus respectivos sitios de corte.
 Así mismo, para la determinación de mapas de restricción a partir de geles, se midió
las concentraciones del plásmido extraído, para así hacer cálculos correspondientes a la
digestión simple y a la doble con las enzimas Rsal y FspBI. Se dejo incubar por 15 minutos a
37ºC. Se sacaron los tubos del baño maría y se pusieron en congelación. Se realizó una
electroforesis en gel de agarosa al 1% por 1 hora a 80V. Por último, se analizó el gel y se
anotaron los resultados.

Objetivos

 Extraer plásmidos desde E.coli DH10-B e identificar su presencia por medio de

electroforesis en gel de agarosa.
 Comprender y entender la importancia del estudio de plásmidos dentro del campo de
la ingeniería genética.
 Establecer las posiciones de las dianas de corte de las enzimas de restricción en un
plásmido no conocido.

Resultados

Imagen 1: Cuantificación de la extracción de ADN.

Descripción: En esta imagen se observa la concentración de las muestras de ADN

plasmídico de E. coli DH10β en la misma concentración y diferentes relaciones. Se trabajó
con los grupos 1 y 5 (G1.P-G5.P).

Imagen 2: Electroforesis en gel agarosa del plásmido PBI121

Descripción: En la imagen se observa la electroforesis de ADN plasmídico de E. coli
DH10B en el segundo carril (G1P) y tercer carril (G5P).

Imagen 3: Plásmido 2 con su gel.

Descripción: En esta imagen se observa el gel de la digestión del plásmido 2 con las enzimas
de restricción Drdl y Pscl.

Imagen 4: Mapas de restricción del plásmido 2.

Descripción: En esta imagen se observan los mapas de restricción del plásmido 2. (A):
digerido con la enzima Drdl, (B): digerido con la enzima Pscl y (C): digerido con las enzimas
Pscl+Drdl.
Tabla 1: Tamaño de los fragmentos de las dianas de restricción del plásmido 2.
 Tamaño de los fragmentos Suma de pb del
Enzimas
(pb) plásmido
Drdl 7250, 1651 8901
Pscl. 5901,3000 8901
Drdl+Pscl. 4150,3000,1651,100 8901
Descripción: En la columna 1 se observan las enzimas utilizadas para la digestión del
plásmido 2. En la columna 2 se observan el tamaño de cada uno de los fragmentos generados
por el corte con las enzimas de restricción y en la columna 3 se observa el tamaño del
plásmido el cual, es generado por la suma de los fragmentos.

Imagen 5: Gel del plásmido pUC18.

Descripción: En esta imagen se observa el gel de la digestión del plásmido 2 con las enzimas
de restricción FspBl y Rsal.
 Imagen 6: Mapas de restricción del plásmido pUC18.

Descripción: En esta imagen se observan los mapas de restricción del plásmido pUC18. (A):
digerido con la enzima FspBl, (B): digerido con la enzima Rsal y (C): digerido con las
enzimas FspBl + Rsal.
Tabla 2: Tamaño de los fragmentos de las dianas de restricción del plásmido pUC18.
Tamaño de los fragmentos Suma de pb del
Enzimas
(pb) plásmido
FspBl 1126,250,250,630,340 2686
Rsal 1476,690,280,240 2686
FspBl+Rsal 690,286,240,250,250,630,340 2686
Descripción: En la columna 1 se observan las enzimas utilizadas para la digestión del
plásmido pUC18. En la columna 2 se observan el tamaño de cada uno de los fragmentos
generados por el corte con las enzimas de restricción y en la columna 3 se observa el tamaño
del plásmido el cual, es generado por la suma de los fragmentos.
Discusión
Según el banco nacional de ADN, se considera que el ADN puro en la relación
260/280, está en un rango de 1.8-2.0. Cuando esta relación es mayor a 1.6 no está totalmente
puro, pero se lo considera un ADN aceptable y cuando esta relación es menor a 1.6 puede
indicar contaminación. Para la relación 260/230, se considera que el ADN es puro cuando
está en un rango de 1.8-2.2, un rango menor podría significar contaminación en la muestra.
Un rango menor a 1.5 indica que la muestra está muy contaminada y esta no podría ser
funcional (2020).

En la imagen 1, se observa que el rango de la relación 260/280 de la muestra 1 (G1.P)

es de 1,21 y de la muestra 2 (G5.P) es de 1,13 por lo que, se puede afirmar que ambas
muestras están contaminadas ya que, sus valores son menores a 1,6. Esta contaminación,
puede deberse a proteínas o compuestos aromáticos que quedaron presentes en las muestras.
Esto se puede corroborar ya que, en la relación 260/230 de la muestra 1 y 2 sus valores son de
0,61 y 0,75. Esto indica un ADN altamente contaminado con sustancias como fenoles,
hidratos de carbono, entre otros (Banco Nacional de ADN, 2020).

Por otro lado, en la imagen 2 se observa una banda suspendida en la parte superior del
gel. Esto indica una integridad alta del ADN (Genomic DNA Sample). Además, que, al ser
un plásmido circular, este no se desliza con facilidad por el agar y por ello, se visualiza una
banda en la parte superior del gel de ambas muestras (Rojas, 2020). También al tratarse de un
ADN con una cantidad alta de pares de bases, este migra en el gel de agarosa de una manera
más lenta por lo que es un ADN circular relajado, es por ello que, cuanto mayor sea la
cantidad de ADN plasmídico va a haber menor pureza del ADN (Rojas, et al., 2017). Esto se
corrobora con los datos de la imagen 1 que nos indica que el ADN está contaminado y no es
puro.

La imagen 3 muestra la digestión del plásmido 2 con 8901pb, aquí se puede inferir el
tamaño de las moléculas, pero no su sitio de corte. Es por ello, la importancia de los mapas de
restricción ya que, gracias a estos se puede determinar los sitios de corte de cada una de las
enzimas (Pillacela, 2018). Esto se ve representado en la imagen 4 en donde se encuentran los
cortes con las enzimas de restricción Drdl y Pscl. Gracias a los mapas de restricción se puede
determinar si es que es necesario realizar otra digestión para así, evitar la presencia de
moléculas que no nos interesan para el estudio (Bakkali, et al., 2011).

Por otro lado, la imagen 5 muestra la digestión del plásmido pUC18 con las enzimas
RsaI y FspBI. El tamaño de este plásmido es de 2686pb aproximadamente (Addgene, 2023).
Es por ello, que la suma de los fragmentos de las digestiones de este plásmido será de este
mismo tamaño. Esto se puede corroborar en la imagen 6 ya que, aquí se visualizan los mapas
de restricción y el de tamaño y sitio corte de cada una de las enzimas. De igual manera, es
importante recalcar que el número de bandas observadas en el gel de electroforesis no
siempre va a representar el tamaño total de cada fragmento ya que, como se observa en la
tabla 2, existen fragmentos de igual tamaño que migran juntos y estos se ven representados
con una banda más ancha en la mayoría de los casos (Bakkali, et al., 2011).

Conclusiones
Mediante todos los análisis en el informe presente, se concluye entonces que se logró
el objetivo de comprender la importancia del estudio de plásmidos dentro de la ingeniería
genética. Sin embargo aunque se realizó la extracción del plásmido DH10-B, este presentó
contaminación en ambos grupos, por lo que la extracción y purfiicación del plásmido no fue
del todo exitosa. Sin embargo, se comprendió la metodología empleada y la teoría detrás. La
contaminación como se topa en la discusión, pudo deberse a otras proteínas o compuestos
aromáticos que quedaron presentes en las muestras.

Por otro lado se logró exitosamente la identificación del plásmido en la electroforésis

en gel de agarosa, aunque esta muestra esta contaminada, esto se corrobora en la
electroforésis ya que se ve una molécula más pesada, posiblemente debido a restos de
proteínas u otros compuestos que prevalecieron durante el proceso de extracción.
 Se logró establecer con éxito las posiciones de las dianas de corte de las enzimas de
restricción para los plásmidos desconocidos in silico. Se determinó entonces los tamaños de
los cortes para cada enzima de restricción y se corroboró mediante el uso de mapas de
restricción. Se detalla y presentara con exactitud los tamaños y cortes realizados en el
plásmido.


Referencias
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