Manual de biología de procariotas

PRACTICA 2 y 3
Tinción diferencial y tinciones selectivas

Objetivos
1. Comprender la importancia que tiene estas tinciones para la caracterización e
identificación de las bacterias.
2. Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo
a esta tinción.
3. Observar estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y cápsula con
tinciones selectivas.

Introducción
Las bacterias son incoloras y se observan con dificultad al microscopio óptico. Los cocos
y los bacilos se pueden identificar por su forma, agrupación y por la afinidad a los colorantes
utilizados en la tinción de Gram. Las bacterias Gram positivas retienen el color azul violeta y las
bacterias Gram negativas el color rojo pálido. En general la tinción de Gram no es aplicable a
otros microorganismos como protozoos y hongos, exceptuando a las levaduras que se tiñen
como Gram positivas.
Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,
producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando
las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma
vegetativa. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre,
por lo que su estudio y observación son de enorme interés.

Materiales de laboratorio por equipo

1 Asa bacteriológica de aro Fucsina diluida
1 Microscopio Colorantes de Gram.
2 Mecheros Pinzas para tubo de ensaye
6 Portaobjetos y Cronómetro
cubreobjetos
Cultivos bacterianos Papel filtro
Papel para lente Vaso precipitado de 50 ó 100 ml
Aceite de inmersión Tela de alambre
Tinta china Soporte universal
Azul de metileno Aro para soporte universal
Material del equipo
Colores
Marcador indeleble o lápiz graso

Actividad de la práctica
Preparación del frotis
Se realizará el mismo procedimiento de la práctica 3

Fijación del frotis

Se realizará el mismo procedimiento de la práctica 3

Tinción diferencial de Gram.

1. Cubrir el frotis con dos gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto.
2. Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso
de colorante.
3. Sacudir un poco y dejar secar, cubrir el frotis con dos gotas de lugol por 30 segundos.
4. Repetir el paso 2

Nota: cuida la presentación del trabajo, la ortografía y la redacción, recuerda que es un entrenamiento para tu carrera
profesional y/o científica.

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5. Inclinar el portaobjeto y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta
que no fluya más tintura.
6. inmediatamente repetir el paso 2.
7. aplicar dos gotas de safranina durante 30 segundos.
8. repetir el paso 2, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y
dejar secar al aire.
9. observar al microscopio.

Tinción selectiva de endosporas.

1. Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre el frotis
2. Agregar azul de metileno sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la
preparación.
3. Colocar el portaobjeto sobre el vaso precipitado con agua en ebullición
4. Dejar durante 5 min. Evitando que se seque el colorante (agregar mas si es necesario)
y eliminar el colorante con agua destilada.
5. Cubrir con safranina durante 30 seg.
6. Lavar nuevamente y dejar secar al aire
7. Observar al microscopio.

Tinción negativa para observación de cápsulas.

1. Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjeto, colocar junto
una gota del cultivo y mezclar cuidadosamente con la tinta china.
2. Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjeto, colocando otro portaobjeto
perpendicular en ángulo de 45 grados sobre la muestra.
3. desplazar poco a poco el segundo portaobjeto a lo largo del primero para hacer una
capa fina de la mezcla.
4. dejar secar al aire.
5. Observar al microscopio.

Resultados.
 Reportar las observaciones de forma, agrupación color y tamaño relativo tal como se
indica en el cuadro de resultados. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los
microorganismos y colorearlos.
 Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.
Tinción de Gram
Descripción del cultivo:

Forma:

Agrupamiento de células:

Aumento:

Reacción Gram

Nota: cuida la presentación del trabajo, la ortografía y la redacción, recuerda que es un entrenamiento para tu carrera
profesional y/o científica.

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Tinción de endospora
Descripción del cultivo:

Forma:

Agrupamiento de células:

Aumento:

Tinción de cápsula
Descripción del cultivo:

Forma:

Agrupamiento de células:

Aumento:

Nota: cuida la presentación del trabajo, la ortografía y la redacción, recuerda que es un entrenamiento para tu carrera
profesional y/o científica.

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Cuestionario
1. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros
dos ejemplos de tinción diferencial.

2. ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram?

3. Explique el fundamento de la tinción de la endosporas. ¿Por qué se debe calentar la

preparación? ¿qué dificultades se tendría si no se adiciona la safranina al final de la
tinción?

4. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica. ¿qué tipo de

información se obtiene? Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita
observar estas estructuras bacterianas.

Nota: cuida la presentación del trabajo, la ortografía y la redacción, recuerda que es un entrenamiento para tu carrera
profesional y/o científica.

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