GUÍA DE PRÁCTICA N° 06

Reconocimiento de características de
microorganismos de interés ambiental
I. INTRODUCCIÓN:

La célula es considerada como la unidad estructural y fisiológica, básica de todos los seres vivos. Por lo
tanto, es la unidad viva más pequeña que se conoce y tiene la capacidad de autoduplicarse, reproducirse
y desarrollarse de modo organizado desde una estructura simple hasta una estructura muy
especializada. Existen células muy material nuclear está disperso por todo el citoplasma, es decir que
carecen de núcleo, estas son las células procariotas, consideradas evolutivamente inferiores, tal es el
caso de las Bacterias y las cianofitas, enmarcadas en el reino de las Moneras.

Los microorganismos vivos o activos son por lo general incoloros (excepto algas y cianobacterias),
por los que no se observarán con facilidad en un microscopio óptico de campo claro por la falta de contraste
entre las células y el medio circundante, por lo que es necesario fijarlos, teñirlos en un frotis y el empleo
de colorantes.

Un frotis se prepara distribuyendo una pequeña suspensión de los microorganismos sobre una superficie
transparente que, posteriormente, se fija a la superficie con calor o solventes orgánicos; lo que causará
la inactivación o muerte celular y algunas modificaciones de sus características. Existen diferentes tipos
de tinciones: simple, diferencial y selectiva, de acuerdo con el número y tipo de colorantes utilizados y de
los objetivos de estudio.

● La tinción que hace uso de un solo colorante es la simple, sirve para determinar forma, tamaño y
agrupación de las bacterias.
● Las tinciones diferenciales permiten diferenciar microorganismos con características superficiales
distintas, por lo que requieren más de un colorante. La más utilizada en bacteriología es la propuesta
por el médico danés Christian Gram en 1884, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de
24 horas en Gram positivas y Gram negativas.
● Las tinciones especiales, permiten observar estructuras especializadas que son útiles para la
clasificación taxonómica de bacterias. Por ejemplo, la tinción de endosporas permite identificar
bacterias de tipo Bacillus y Clostridium.

Los colorantes son sustancias que tienen la propiedad de teñir o ceder color, es una sustancia o
compuesto orgánico que tiene cromóforos y auxocromos ligados a un núcleo bencénico, el grupo
cromóforo comunica al cuerpo la propiedad de color y el grupo auxocromo les comunica la propiedad de
disociación electrolítica necesaria para unirse al cuerpo formando sales.
Los colorantes pueden clasificarse de diversas formas, atendiendo su origen pueden ser naturales o
artificiales y por sus propiedades pueden señalarse: ácidos, básicos, neutros e indiferentes.

OBJETIVO: En la presente práctica observaremos células procarióticas, Describir los tipos de colorantes
y aprender las técnicas más utilizadas de Tinción de microorganismo e identificar bacterias mediante
observación microscópica.
II. MATERIAL:

● Agua verde estancada ● Mecheros ● Cristal Violeta

● Nódulos bacterianos de ● Asas de Kolle ● Lugol
leguminosas ● Microscopio óptico ● Alcohol - acetona
● Yogurt pequeño ● Láminas portaobjeto ● Aceite de inmersión
● Medio de cultivo

III. PROCEDIMIENTO:

1) PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DE UN FROTIS

● Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.
● Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar
el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. Si los frotis son de cultivos
sólidos, se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.
● Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, quitar el tapón del tubo, flamear la boca e introducir
el asa para tomar la muestra. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla
suavemente en área circular de más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el asa. Dejar secar el
frotis al aire.
● En el caso de cultivos líquidos, se toma la muestra del tubo de manera directa y se realiza el
mismo procedimiento antes descrito.
● Los frotis de cultivos sólidos se fijarán con calor, pasando el portaobjetos rápidamente 2-3 veces
por la flama del mechero.
● Los frotis de medios líquidos se fijarán colocando dos gotas de etanol absoluto, que se dejarán
secar al aire (precaución: hacer esto en zona alejada del mechero).

2) TÉCNICAS DE TINCIÓN:

A) Tinción Simple: Con Cristal violeta

● Preparar y fijar una muestra sobre una lámina limpia y desengrasada
● Cubrir el preparado con el colorante (Cristal violeta) por 1 minuto.
● Lavar con agua corriente
● Secar al calor suave con el mechero
● Observar a mayor aumento y luego con lente de inmersión

B) Tinción de Gram: Con esta tinción podemos apreciar la morfología de las baterías y también su
comportamiento frente a esta técnica específica, es decir reconocer a las bacterias Gram positivas y
Gram negativas. La tinción debe su nombre a su descubridor Christian Gram, los colorantes es esta
tinción se fijan a nivel de pared celular existiendo varias teorías que explicarían el comportamiento
de las bacterias como gram positivas y gram negativas.
● Hacer una extensión sobre una lámina portaobjeto
● Fijar la muestra a temperatura ambiente o calor suave
● Cubrir el preparado con Cristal Violeta o Violeta de Genciana por 2 minutos
● Eliminar el exceso de colorante con agua corriente
● Cubrir el preparado con lugol (Lugol de Gram) por 2 minutos
● Decolorar con alcohol acetona
● Contrastar con Safranina por 30 segundos o 1 minuto
● Lavar y Secar
● Observar con Objetivo de mayor aumento y de inmersión
3)OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS:

A) Cyanofitas (algas verde azuladas)

- En una lámina portaobjeto colocar una gota de agua que contengan filamentos verdosos.
- Colocar una la lámina cubreobjetos y observe a mediano y mayor aumento
- Esquematice lo observado.

B) Bacterias Rhizobium sp. en nódulos bacterianos

- Localice los nódulos bacterianos en las raíces de las plantas

- Corte longitudinalmente el nódulo, luego realice una extensión en su lámina portaobjeto
- Deje que seque al medio ambiente y coloque una gota de Sudan III.
- Después de 05 minutos, lave con agua a chorro lento, y deje secar.
- Observar a mayor y a inmersión (coloque previamente una gota de aceite de Cedro)
- Esquematice lo observado

C)Bacterias Medio de Cultivo:

- Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.
- Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar
el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. Si los frotis son de cultivos
sólidos, se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.
- Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, quitar el tapón del tubo, flamear la boca e
introducir el asa para tomar la muestra. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos,
extenderla suavemente en área circular de más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el asa.
Dejar secar el frotis al aire.
- Cubrir el preparado con el colorante (Cristal violeta) por 1 minuto.
- Lavar con agua corriente
- Secar al calor suave con el mechero
- Observar a mayor aumento y luego con lente de inmersión

D)Bacterias en Yogurt:
- Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.
- Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo.
- Dejar enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos.
- Se toma la muestra del tubo de ensayo que contiene yogurt de manera directa
- Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en área circular de más
o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el asa.
- Dejar secar el frotis al aire.
- Cubrir el preparado con Cristal Violeta o Violeta de Genciana por 2 minutos
- Eliminar el exceso de colorante con agua corriente
- Cubrir el preparado con lugol (Lugol de Gram) por 2 minutos
- Decolorar con alcohol acetona
- Contrastar con Safranina por 30 segundos o 1 minuto
- Lavar y Secar
- Observar con Objetivo de mayor aumento y de inmersión
IV. RESULTADOS:

A) Cyanofitas (algas verde azuladas)

Fig 01: Observación de algas azul verdosas (Nostoc sp.)

4x 10x

Fig 04: Observación de bacteri

100x 100x
V. DISCUSIÓN: Se hará en base a las siguientes preguntas:

1) Dar ejemplos de Colorantes según las clasificaciones dadas:

Colorantes ácidos Fucsina ácida, verde rápido, naranja G y la eosina.

Colorantes Básicos Tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la

hematoxilina.

Colorantes Neutros Eosinatos como el de azul de metileno, azul de toluidina y violeta de

metilo 18.

2) Explique en forma completa la teoría que explica la tinción Gram. Investigue otros dos ejemplos
de Tinción diferencial.
La tinción requiere cuatro soluciones un colorante o tinte básico, un mordiente
(sustancia que incrementa la afinidad entre la célula y el tinte), un decolorante
(elimina el tinte de una célula teñida) y un segundo tinte o colorante de contraste
(tinte de color diferente a la inicial). Tras la tinción con el primer colorante (Cristal
violeta) se efectúa una decoloración con etanol que arrastrará al colorante sólo en
las Gram negativas, mientras que en las Gram positivas el colorante queda
retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram negativas se teñirán
después con el colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.
Por ejemplo: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen.
3) ¿Cuáles son las formas bacterianas?
Esferas (cocos), bastones (bacilos) y espirales o hélices (espiroquetas).

4) Indique la importancia que tiene el Rhizobium en los cultivos.

Las bacterias del género Rhizobium poseen la capacidad de establecer simbiosis

fijadoras de nitrógeno con plantas leguminosas. Además de los genes específicos
implicados en el establecimiento de simbiosis efectivas, existen otros genes
bacterianos necesarios tanto en vida saprofitica como en simbiosis.

5) Indique la importancia de los coliformes totales y coliformes fecales para la determinación de la

calidad del agua.

Los coliformes totales se definen como bacterias Gram negativas en forma bacilar que
fermentan la lactosa a temperatura de 35 a 37 ºC y producen ácido y gas (CO2) en
24 h, aerobias o anaerobias facultativas, son oxidasa negativa, no forman esporas
y presentan actividad enzimática ß-galactosidasa. Entre ellas se encuentran
Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. La prueba más relevante
utilizada para la determinación de coliformes, es la hidrólisis de la lactosa. El
 rompimiento de este disacárido es catalizado por la enzima ß-D-galactosidasa.
Para la determinación de la ß-Dgalactosidasa se utilizan medios cromogénicos
tales como el Agar Chromocult para coliformes. Actualmente, no se recomienda
para la evaluación de la calidad de las aguas debido a que muchos de sus
miembros pueden encontrarse de forma natural en aguas, suelos o vegetación.

Los indicadores de contaminación fecal más utilizados son los coliformes totales y
termotolerantes, Escherichiacoli y enterococos. De acuerdo con González et al., y
Méndez et al., existen numerosas limitaciones asociadas con la aplicación de estas
bacterias como indicadores, como es su escasa supervivencia en cuerpos de agua
y fuentes no fecales, su habilidad para multiplicarse después de su liberación en
una columna de agua y debilidad frente a los procesos de desinfección, entre otras.
Por esta razón, se han utilizado como indicadores alternativos las bacterias
anaerobias fecales (Bacteroides spp., Bifidobacterum spp., Clostridium
perfringens), virus (colifagos) y componentes orgánicos fecales (coprostanol). Los
microorganismos indicadores son aquellos que tienen un comportamiento similar a
los patógenos en cuanto a concentración en las aguas y reacción frente a factores
ambientales, pero son más fáciles, rápidos y económicos de identificar. Una vez
que se ha demostrado la presencia de estos grupos indicadores, se puede inferir
qué microorganismos patógenos se encuentran presentes y su comportamiento
frente a diferentes factores como pH, temperatura, presencia de nutrientes y tiempo
de retención hídrica.

VI. CONCLUSIONES: De acuerdo a sus resultados, expresa tus conclusiones

 Al observar el cushuro a través de diferentes medidas del microscopio, se

puede obtener más detalle y resolución de sus características. A mayores
aumentos, se pueden identificar estructuras más pequeñas y detalles que
no eran visibles a bajos aumentos. Sin embargo, es importante encontrar
un equilibrio para evitar distorsiones y limitaciones en el campo de visión.

 A altos aumentos, se podría obtener un nivel de detalle más fino y una

resolución más alta. Esto permitiría examinar las gotitas de cristal de
violeta con mayor precisión, analizando su estructura interna, posibles
defectos o irregularidades en los cristales y cualquier interacción
microscópica adicional con el yogurt.
 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Coloque en orden alfabético la bibliografía, consultas en
internet, que ha utilizado para el desarrollo de la discusión

Sanjuán Pinilla, J.M (2009) Importancia de la biosíntesis bacteriana de leucina para el

establecimiento de la simbiosis rhizobium-leguminosa. [Tesis de titulación, Universidad De
Granada]. http://hdl.handle.net/10481/2416

Larrea Murrell, J. A, Rojas Badía, M.M, Romeu Álvarez, B., Rojas Hernández, N.M, & Heydrich
Pérez, M. (2013). Bacterias indicadoras de contaminación fecal en la evaluación de la calidad de
las aguas. Revista CENIC. Ciencias Biológicas, 44 (3), 24-34.
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181229302004

Rodríguez P.A, Arenas R. (2018). Hans Christian Gram and His Staining. Revista Dermatología
Cosmética, Medica y Quirúrgica. 16(2), 166-167.
https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumen.cgi?IDARTICULO=80715

Jiménez Tabón G.A, Vélez Hoyos A. (2012). Tinción de Gram de tejido: alcances y limitaciones.
Revista de Microbiología. 18(11), 557-573. https://www.google.com/url?
sa=t&source=web&rct=j&url=https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/
8741702.pdf&ved=2ahUKEwiy_uDokf3-
AhXjuJUCHUqaDgw4ChAWegQIChAB&usg=AOvVaw2sLOkg5iybIBtZp979_iuh

Corrales Ramirez, L.C., & Caycedo Lozano, L. (2020). Principios físicoquimicos de los colorantes
utilizados en microbiología Principios fisicoquímicos de los colorantes. Nova, 18(33).
https://doi.org/10.22490/24629448.3701
 ANEXO 01
PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DE
FROTIS

CULTIVO SÓLIDO
B

CULTIVO LÍQUIDO (Yogurt)