Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Químicas

Ingeniería Química

U. A. Microbiología y laboratorio
Semestre Enero-junio 2020
Sexto semestre Grupo 2

Profesor: Dr. Carlos Enrique Escárcega González

Practica 1
Técnicas de tinción simple, diferencial y selectiva

Cesar Alejandro Garza Hernández 1885683

Carlos Arturo Cerón Linares 1939904

San Nicolas de los Garza, Nuevo León a 18 de marzo de 2020

Objetivo

Llevar a cabo la preparación de frotis, técnicas de fijación y tinción simple para

estudiar las características de S. cerevisiae y tinción de Gram para Micrococcus
sp., Escherichia coli, Bacillus sp.

Fundamento

Es cierto que pueden observarse microorganismos directamente al microscopio,

pero debido al poco contraste entre los microorganismos y el medio generalmente
se usan técnicas de tinción para mejorar la definición en las observaciones.

Las tinciones se realizan normalmente a partir de suspensiones de

microorganismos fijados a un portaobjetos por diferentes tratamientos, fijación por
calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada, pero tiene la
desventaja de que sólo preserva la forma de los microorganismos, pero destruye
sus estructuras internas. Cuando se requiere conservar las estructuras se utiliza la
fijación con agentes químicos como etanol, metanaldehído, entre otros.

La tinción simple se da cuando se aplica al microorganismo un tinte que tiene

afinidad con la pared celular, permitiendo al tinte pintar la estructura del
microorganismo. Las tinciones diferenciales ocurres cuando se aplican en
intervalos diferentes colorantes de mucho contraste entre sí y entre dichas
aplicaciones se provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos
permitiendo que se pinten de colores diferentes. Las más utilizadas son la tinción
de Gram y la tinción de ácido-alcohol.

Sin embargo, mientras se consideran como las técnicas más comunes e

importantes para la clasificación de bacterias, existen diferentes tinturas para la
identificación de endosporas o para ciertos patógenos como los que provocan
tuberculosis, además para microorganismos dentro del cuerpo humano como para
muestras de sangre o medula ósea.
Procedimiento

Materiales y equipo

Por equipo: Por grupo:

- 4 portaobjetos medios y reactivos

- 2 asas de inoculación
- Etanol absoluto
- 1 pizeta con agua destilada
- 4 juegos de colorantes
- 1 microscopio óptico
Gram
- 1 mechero
- 2 frascos gotero con verde
de malaquita 5% en agua
- 1 frasco gotero con aceite
de inmersión

Metodología

Se proporcionaron cultivos líquidos. Se prepararon frotis y se hizo tinción simple

de S. cerevisiae y tinción de Gram de Micrococcus sp., Escherichia coli, Bacillus
sp.

Preparación de frotis

1. Se lavaron los portaobjetos y fueron secados con papel.

2. Con ayuda del mechero, se esterilizaron las asas en la flama hasta ponerse
al rojo vivo. Se dejó enfriar para evitar la quema y destrucción de
microorganismos.
3. Se abrió el tubo de ensayo y se pasó por la flama; se introdujo el asa para
tomar la muestra. Se colocó la muestra en el centro del portaobjetos, se
extendió más o menos 2 cm de diámetro y se volvió a esterilizar el asa.

Fijación del frotis

Los frotis de medios líquidos se fijaron colocando dos gotas de etanol absoluto,
el cual se dejo secar.

Tinción simple
1. Se cubrió el frotis de S. cerevisiae con una gota de azul de metileno durante
60 segundos.
2. Cualquier exceso se eliminó con agua destilada.

Tinción de Gram

1. Se cubrieron los frotis de Micrococcus sp., Escherichia coli, Bacillus sp. Con
dos gotas de cristal violeta durante 60 segundos. Se eliminó cualquier
exceso con agua destilada.
2. Se cubrió el frotis con 2 gotas de Lugol por 30 segundos.
3. Se inclinó el portaobjetos y se aplicó gota a gota el decolorante de tal
manera que ya no se observara color. Se lavó con agua.
4. Se aplicó 2 gotas de safranina durante 30 segundos. Se lavó con agua.

Observación al microscopio

1. Se ajustó el haz de luz en el centro de campo de observación.

2. Los portaobjetos fueron colocados en la platina; se localizó la preparación
con el objetivo de 10X, después se pasó al de 40X. Para la observación de
100X se añadió una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la
preparación.
3. Se limpió el objetivo con papel seda. Esto una vez finalizada la observación.
Resultados y discusión

Tabla 1. Observación de cultivo con tinción simple

Característica Cepa 1:
S. cerevisiae
Cultivo liquido
Aumento total 100X
Forma (esféricas, ovales) Ovales
Agrupación (sola, par, cadena, Sola
racimo)

Tabla 2. Observaciones de cultivos con tinción de Gram

Característica Cepa 1: Cepa 2: Cepa 3:

Escherichia coli Micrococcus sp. Bacillus sp.
Cultivo liquido
Aumento total 100X 100X 100X
Forma (coco, Bacilo Coco Bacilo
bacilo, etc.)
Agrupación (par, Cadena Racimo Cadena
cadena,
racimos)

Fig. 1 Vista en el microscopio de

S. cerevisiae
 Fig. 2 Vista en el microscopio de
E. coli

Fig. 3 Vista en el microscopio de

Micrococcus sp.

Fig. 4 Vista en el microscopio de

Bacillus sp.

La tinción simple nos proporciona

exclusivamente información acerca de la forma,
tamaño y tipo de agrupación de los
microorganismos. Sin embargo, tiene la ventaja
de ser un método muy sencillo y rápido.
La tinción de Gram proporciona una información esencial, además de sobre la
forma, tamaño y agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que
presentan las bacterias.

Cuestionario

1. ¿Cuáles son las fuentes de error mas frecuentes en la preparación y

fijación de frotis?
 Tomar la muestra con el asa, y volver a tomar otra muestra con la
misma asa sin haberla esterilizado.
 Preparar el frotis muy cerca del mechero de tal manera que destruya
los microorganismos.
 No haber dejado enfriar el asa completamente, lo cual pudo haber
provocado la muerte de microorganismos.
 No fijar la muestra con el etanol.
 No esterilizar correctamente el asa de inoculación

2. ¿Cuál es la descripción general de un microorganismo que puede

reportar en un estudio microscópico aplicando las técnicas de la
práctica?

Consiste en la descripción de su forma, agrupación y dependiendo de la tintura

aplicada, el grupo.

3. ¿Cuáles son las fuentes de error mas frecuentes en la tinción de

Gram?

Los errores técnicos.

 No usar las cantidades requeridas de tintura.

 Tardarse mucho al dejar la tintura.
  Saltarse algún reactivo (colorante).
 No agregar safranina.
 Lavar de más con agua.

4. Si se aplica la tinción de Gram en Bacillus sp. Con endosporas ¿Cómo

se observarían la célula vegetativa y la endospora? ¿Por qué?

No se observarían cambios de color en las endosporas dado a que su cubierta es

resistente a condiciones extremas y eso implica que dicha es impermeable a la
tinción. Por lo cual se recomienda usar una tinción diferente para las endosporas.

Conclusión

Alejando Garza: Durante el desarrollo de practica se pudo realizar la tinción simple

S. Cerevisiae de forma exitosa, mostrando su forma, mientras que en el caso de
las tinciones de Gram se no se presentaron en el color indicado dado a errores en
el procedimiento. No obstante, se pudieron observar las formas correspondientes
de Bacillus sp., E. Coli y Micrococcus sp. No se presentaron problemas con el
microscopio y se cercioro el uso de aceite a la hora de utilizar el aumento de 100x.

Carlos Cerón: se cumplió con el objetivo de observar las estructuras de los

microorganismos y conocer las técnicas de tinción tradicionales y la tinción
diferencial. Estas técnicas son poderosas y se han utilizado durante muchos
cientos de años para el estudio y caracterización de microorganismos.

Referencias

1. Tortora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. 2007. Introducción a la Microbiología,

9ª Ed. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
2. Técnicas de tinción. Recuperado el 07 de marzo de:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/7fTinciones_27340.pdf
3. Prescott L.M, Harley J.P, Klein D.A. microbiología. McGraw-Hill
Interamericana. 1999. ISBN:84-486-0261-7
4. Pelczar, Reid, Chan, Microbiología, McGraw-Hill, ISBN:968-6046-65-8
5. Cao-Hoang, L.; Marechal, P.-A.; Le-Thanh, M.; Gervais, P.y Waché, I. 2008.
Fluorescent probes to evaluate the physiological state and activity of microbial
biocatalysts: A guide for prokaryotic and eukaryotic investigation. Biotecnology
Journal, 3: 890- 903.
6. Brock. Madigan, Martinko, Parker. Biología de los microorganismos, Prentice-
Hall, ISBN:848-96-6036-0