Practica 4.

OBSERVACIN MICROSCOPICA DE BACTERIAS Docente catedrtico: Marcela Quintero Ruiz, Microbiologa Industrial

4.1. Introduccin.

En la identificacin de los microorganismos, la determinacin de su morfologa, juega un papel fundamental. Sus estructuras pueden ser lo suficientemente caractersticas como para permitir el reconocimiento mediante un examen microscpico, teniendo como gua, la descripcin del microorganismo, lograda con base en una adecuada consulta bibliogrfica. Diferencias en cuanto a tamao y coloracin de los microorganismos, entre otros, hacen que se presenten variaciones en las tcnicas de montajes de tal manera que se logren buenas observacionesEn esta prctica se hace nfasis en algunas tcnicas de montajes de uso frecuente y las tinciones para la observacin de bacterias. TIPOS DE TINCIONES Tincin simple: Se usa solo colorante, se emplea cuando simplemente se desea observar forma de bacterias, su disposicin y tamao relativo, sin mayores detalles de la estructura interna. Tinciones diferenciales: Permite distinguir diversas estructuras celulares y un tipo de bacterias de otro. Supone el uso de colorantes y en la preparacin final algunas estructuras o tipos de clulas toman un color y el resto otro, se aplica un colorante primario, luego se hace la diferenciacin utilizando una solucin que renueve este colorante de algunas estructuras o tipos de clulas y a continuacin se hace el contraste, aplicando un segundo colorante que e3s tomado por las estructuras decoloradas. Una tincin diferencial muy importante para el microbilogo es la tincin de Gram. La cual constituye un criterio taxonmico en la diferenciacin bacterial. Estas se dividen en dos grupos las Gram positivas y las Gram negativas, el distinto comportamiento en la tincin se aplica en base a 25

diferencias en la pared celular. En trminos generales estos dos grupos difieren en su reaccin frente a muchos agentes fsico-qumicos. Tincin de endosporas: Las especies pertenecientes a los gneros Bacillus y Clostyridium producen ms estructuras muy resistentes reconocidas como endosporas, las cuales pueden sobrevivir largos periodos en condiciones desfavorables. Pueden ser teidas por un procedimiento enrgico, en el que colorantes fuertes se ponen en contacto con las clulas durante cierto tiempo, permeabilizando las paredes de las endosporas, mediante la aplicacin de vapor.

4.2. Objetivos: Realizar montajes para observacin microscpica bacteria Aplicar las diferentes tcnicas de tincin.

4.3. Materiales. Cajas petri con cultivos puro de Bacillus. Placas de King B con Pseudomonas fluorecens. Cubeta para coloracin de Gram. Papel absorbente Asas redondas Mecheros Laminas porta objetos. Laminas cubre objetos. Toallas de papel cocina. Colorantes de Gram. Verde malaquita Tinta china. Bao mara Tubos con agua estril.

3.4. Procedimiento. 3.4.1. Montaje en fresco, Observacin de movilidad.

Sobre un portaobjetos limpio y flameado, agregue una gota de agua destilada estril. Con un asa previamente flameada, tome una pequea porcin del microorganismo que se encuentra en la caja de petri y extindalo sobre la gota del portaobjetos. Coloque un cubreobjetos, agregue aceite de inmersin y observe en 100X.

3.4.2. Tincin de endosporas. En un portaobjetos realice un frotis del microorganismo Bacillus sp. Y fije la muestra con calor. Cubra la lamina con trozos de papel y adicione le colorante verde malaquita. De tal manera que el papel quede impregnado con el colorante. Caliente la lamina durante 5 minutos evitando que se seque. Lavar con abundante agua el colorante Dejar que se que la lamina y agregar una gota de aceite de inmersin para observar al microscopio con el objetivo 100X.

3.4.3. Tincin negativa o Tinta china para capsula. Coloque una gota de tinta china sobre un portaobjetos. Con el asa previamente flameada, tome una muestra del microorganismo y distribyalo sobre el portaobjetos con la tinta china. Deje secar al ambiente, adicione aceite de inmersin y observe en 100X.

3.4.4. Tincin de Gram Realice un frotis y fjelo con calor. Adicione el cristal violeta durante 1min, descarte el colorante y adicione abundante agua sobre el portaobjeto. Aada el Lugol y deje actuar durante 1 min, descarte lave la lamina con abundante agua. Posteriormente adicione el Alcohol acetona deje actuar durante 20 seg y lave. Por ltimo adicione el colorante fucsina djelo durante 20 seg, lave la lamina y djela secar. Coloque una gota de aceite de inmersin y observe en 100X.