FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

EXPERIENCIA EDUCATIVA: MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

PRÁCTICA No.4 PREPARACIÓN DE EXTENSIONES. TINCIÓN

SIMPLE Y DIFERENCIAL (GRAM)

I Generalidades
En estudios microscópicos se utilizan las extensiones o preparaciones, las que se
pueden colorear. En el caso de preparaciones en fresco, es posible observar el
movimiento de los microorganismos.
La tinción es el proceso mediante el cual un colorante se adsorbe a una superficie,
en función del tipo de reacción existen dos tipos de tinciones: simples y
diferenciales.
● Tinción simple. Se utiliza un colorante generalmente básico (no se
diferencian estructuras ni los microorganismos). Si el colorante es fijado por
la célula en la tinción simple, se observa al microorganismo de color oscuro
o coloreado sobre un fondo luminoso, denominándose como positivas y
negativas cuando no se fija el colorante, observándose el microorganismo
brillante y el fondo oscuro (Castañeda-Briones, 2004).
● Tinción diferencial. Se utiliza más de un colorante, lo que se aplican en
secuencia a un frotis previamente fijado. El primer reactivo es llamado
colorante primario e imparte color a todas las células. Para establecer un
contraste de color, el segundo reactivo usado es un agente decolorante, el
cual puede decolorar la célula completa o solo parte de ella. Por último, un
colorante de contraste, que le da a las células decoloradas un color que
contrasta con el del colorante primario. Ejemplo es la tinción de Gram.

Tinción de Gram. Permite la clasificación de las bacterias en gram positivas (color

morado) y gram negativas (color rojo).

Los colorantes utilizados en las extensiones pueden ser ácidos, básicos o neutros:
● Ácidos. Tiñen el material citoplásmico, ejemplo de ellos son: eosina, rojo
congo y fucsina ácida.
● Básicos. Tiñen el material nuclear y otros componentes, se caracterizan por
el ión que lleva el color es catiónico; ejemplos de ellos son: azul de
metileno, fucsina básica y cristal violeta.
● Neutros. Resultan de la mezcla de colorantes ácidos y básicos, ejemplo
Giemsa.
II Competencia
Seleccionar la tinción simple adecuada para frotis húmedos y diferenciar bacterias
gram negativas de gram positivas en frotis.

III Materiales y reactivos

Material:
- Cultivo sólido - Papel para lentes

- Cultivo líquido - Agua destilada

Microscopio - Vaso de precipitado

- Mechero bunsen - Asa bacteriológica

- Marcador - Aceite de inmersión

- Puentes de coloración - Encendedor o cerrillos

- Hisopos - Papel filtro

- Cultivos en medio sólido - Cultivo en medio líquido

Reactivos

- Azul de metileno 1% - Cristal violeta 1%

- Safranina 1% - Verde de malaquita 1%

- Alcohol-cetona (1:1) - Lugol 0.1%

IV Procedimiento
IV a Preparación del frotis (extensión).

1.- Flamear el portaobjetos limpio para desengrasarlo.

2. Si el cultivo es sólido, colocar una gota de agua destilada estéril o de solución

salina en el centro del portaobjetos, y con el asa bacteriológica estéril, tomar una
pequeña cantidad de material, emulsionar y extender uniformemente formando
una capa delgada en una superficie aproximada de 1 cm 2.

3. Si la muestra es líquida, tomar directamente el material con el asa estéril y

extenderlo uniformemente sobre la superficie formando una capa uniforme.
4. Dejar secar la extensión al aire.

5. El frotis seco, se fija al calor suave, pasando rápidamente el portaobjetos en

forma horizontal (con el extendido hacia arriba) sobre la flama del mechero, sin
calentar demasiado, aproximadamente 10 veces.

6.- De cada cultivo prepare tres frotis.

Las extensiones deberán ser finas y uniformes para permitir el paso de la luz a
través de ellas y facilitar su observación.

IVb Tinción simple

1. Cubrir la extensión debidamente preparada con la solución colorante.

2. Dejar actuar el colorante por 1 minuto.

3. Lavar con agua corriente hasta eliminar exceso de colorante.

4. Dejar secar al aire o presionando el portaobjetos entre 2 capas de papel

absorbente como papel filtro o papel sanitario (Figura 4.1).

5. Una vez seca la extensión, colocar sobre ella una gota de aceite de inmersión y

observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

IVc Tinción de gram

1. Preparar 4 extensiones (frotis).

2. Cubrir la extensión con cristal violeta y dejar durante un minuto.

3. Lavar con agua destilada, cuidando que no se arrastre la preparación y sacudir

cuidadosamente para eliminar el exceso de agua.

4. Cubrir la extensión con solución de lugol y dejar actuar uno a dos minutos.

5. Lavar con agua destilada.

6. Decolorar con alcohol-cetona, aproximadamente 10 a 20 segundos o hasta

observar el alcohol transparente.

7. Lavar con agua destilada.

8. Cubrir la extensión con safranina y dejar actuar por uno a dos minutos
9. Lavar con agua corriente (Figura 4.2).

10. Secar la preparación al aire o colocar entre papel absorbente

Observación de la tinción de gram

El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo
por sí solo tiene poca afinidad con las células.

EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del

tiempo para evitar que pierdan la tinción las células gram positivas.

En cultivos viejos, las células pueden manifestar diferentes características

tintoriales, por lo que la tinción debe realizarse con cultivos recientes.

Interpretación de la tinción de gram

Las bacterias gram positivas retienen el cristal violeta y se tiñen de azul o morado.
Las bacterias gram negativas se tiñen de color rojo o rosa.

Figura 4.1 Elaboración de frotis y tinción simple

 1a) 1b)

2b) 2b)

Figura 4.2 1 a) y 2 a) Tinción de gram. 1b) Bacterias gram negativas color rosa, 2b
Bacterias gram positivas de color morado. Cuevas-Díaz 2007.

V Resultados
Dibuje o tome fotos de lo observado en el microscopio durante la tinción simple
para el cultivo en medio líquido y en medio sólido.
Dibuje o tome fotos de los cultivos en medio sólido a los que se les aplicó la tinción
de gram. Clasífiquelos.
VI Cuestionario
1.- Desarrolle la estructura para dos colorantes básicos y ácidos.
2.- ¿Por qué teñimos las extensiones?
Esto porque provee una información muy importante sobre la caracterización
morfológica e identificación de la muestra. Es de vital importancia diferenciar las
Gram positivas de las Gram negativas así se puede saber qué tipo de bacteria es.

3.- ¿Para qué sirve el aceite de inmersión?

Puede agrandar los objetos que no son visibles a simple vista. Es necesario para
las observaciones microscópicas, este que brinda la propiedad de concentrar la
luz cuando esta pasa a través del objetivo de 100X del microscopio, aumentando
su poder de resolución.

4.- ¿A qué se debe la diferencia en la tinción entre las bacterias gram positivas y
gram negativas?
Las Gran positivas son de color azul o violeta y las Gram Negativas de color rosa
o rojizo.

5.- ¿Cuál es la función del lugol en la tinción de gram?

Este sirve para fijar el colorante cristal violeta a las bacterias.

6.- ¿Cómo actúa el alcohol-cetona en la decoloración durante la tinción de gram?

Hace se podría decir un lavado del teñido se observa una decoloración y solo
queda una coloración superficial del tinte añadido anteriormente.

Conclusiones.
En la muestra se pudo apreciar que el tipo de bacterias son Gram-Negativas, siendo
bacilos teñidos de rosa los que se logran observar en el microscopio, primeramente se
tomo la muestra de agar y se siguieron los pasos posteriores para la tinción y su
respectivo lavado cada que se le adhería una nueva sustancia, Se estuvo observando
durante un largo periodo ya que al principio solo encontrábamos burbujas de aire,
haciendo el movimiento en el microscopio hasta lograr la imagen precisa donde
claramente podemos apreciar bacilos teñidos de rosa.
Disposición de residuos
1.-Depositar los desechos de colorantes se depositarán en los frascos dispuestos
en el laboratorio
2. Al término de la sesión, sumergir los portaobjetos en una solución de cloro al
5%, durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un
frasco con alcohol al 95%.
3. En el caso de ruptura de las extensiones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor para
vidrios rotos.
4. Los cultivos, una vez utilizados, deben ser esterilizados en autoclave, antes de
ser desechados.

Bibliografía
Castañeda-Briones, M.T. 2004. Microbiología Aplicada. Manual de Laboratorio.
Univerrsidad Autónoma Metropolitana Azcapotzalco. Accesado en octubre 2008.
http://zaloamati.azc.uam.mx/bitstream/handle/11191/1746/Microbiologia_aplicada_
manual_de_laboratorio.pdf?sequence=3
Madigan M.T, Martingo J. M. y Jack Parker. 2004. Décima Edición. Brock Biología
de los Microorganismos. Prentice Hall.