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Tinciones y colorantes principales en

microbiología
Tras ver la teoría sobre colorantes y tinciones vamos a analizar las principales tinciones
usadas en microbiología y los colorantes que las forman.

En este caso, las diferentes técnicas de tinción analizadas se usan para el microscopio
óptico. La mayoría de las muestras se podrán ver en el microscopio con aumentos de
20x y 50x, aunque habrán casos donde será necesario usar el aumento 100x (donde se
añade también el aceite de inmersión a la muestra).

Las tinciones principales son la de Gram y de Ziehl-Neelsen, ambas diferenciales;

aunque también hay otras tinciones diferenciales y selectivas de interés para la
microbiología.

Recordatorio: antes de leer este artículo sería bueno que conozcas un poco de teoría
sobre las fases, mecanismos y tipos de tinciones que hay (además de las partes que
tienen los colorantes). Si conoces todo esto podrás entender mejor ciertas expresiones
que son más del gremio 😄.
Índice de contenidos
1. Tinción de Gram
1.1. Colorantes

1.2. Preparación
1.3. Utilidades
1.3.1. Gram positivas
1.3.2. Gram negativas

2 Tinción Ziehl-Neelsen
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2. Tinción Ziehl Neelsen
2.1. Colorantes
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2.2. Preparación
2.3. Utilidades

3. Tinción de Wirtz-Conklin
3.1. Colorantes
3.2. Preparación
3.3. Utilidades

4. Tinción de Leifson
4.1. Colorantes
4.2. Preparación
4.3. Utilidades

5. Tinción de Giemsa
5.1. Colorantes
5.2. Preparación
5.3. Utilidades

6. Tinción negativa
6.1. Colorantes
6.2. Preparación
6.3. Utilidades

Tinción de Gram
La tinción de Gram es probablemente la más conocida; es de tipo diferencial y sirve para
distinguir a los microorganismos por morfología y composición.

Hay que tener en cuenta que se debe hacer la tinción cuando el cultivo esta en fase
exponencial, ya que en fase estacionaria (“vejez”) se pueden confundir las gram

positivas con las negativas. Esto ocurre debido a la perdida de capas de peptidoglicano
por parte de bacterias gram positivas.

Colorantes
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Cristal violeta. Da color azul o violáceo a las bacterias gram positivas.

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Safranina. Da color rojizo o anaranajado a las bacterias gram negativas.

Aparte de estos colorantes, en la tinción de Gram se usará el lugol como mordiente, y

alcohol 96% para decolorar. Todas las células (sean Gram positivas o negativas) se
teñirán con el cristal violeta.

Así lucen los compuestos de las tinciones: en

este caso, este es el kit de los compuestos
necesarios para la tinción de Gram. Fuente:
Fisher Scientific

Ahora bien, el alcohol quita fosfolípidos y cierra los poros de la pared celular, por lo que
el cristal violeta queda atrapado. Las bacterias gram positivas podrán soportar este
proceso gracias a su gran capa de peptidoglicano. No obstante, las bacterias Gram
negativas no aguantarán este tratamiento con alcohol, por lo que se quitará el cristal
violeta de ellas.

Preparación 
El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se

extienden por el portaobjetos. No se añade agua destilada.

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2. El proceso de fijación se realiza por calor a la llama.

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3. Se añade cristal violeta, recubriendo con este colorante el portaobjetos durante 2 o
3 minutos.

4. Ahora se añade lugol (yoduro potásico 2% + yodo) durante 1 minuto. El lugol no es

un colorante en sí, sino que hace de mordiente. El mordiente se acopla con el
colorante y facilita su absorción por parte del microorganismo.

5. Se lava el portaobjetos con agua destilada. El agua no debe tocar directamente la

muestra.

6. Decolorado con alcohol 96%. Se añade el alcohol gota a gota, y de la muestra

saldrán gotas violáceas. Paramos de añadir alcohol cuando salga la primera gota
transparente de la muestra.

7. Se añade el colorante de contraste, la safranina, durante 5 minutos.

8. Por último se lava el portaobjetos y se seca.

Utilidades
La principal utilidad de la tinción de Gram es la de distinguir entre bacterias gram
positivas y negativas. Las gram negativas que perdieron coloración por el tratamiento
con alcohol ahora se verán de color rojo, naranja o rosáceo por acción de la safranina.
Por otra parte, las bacterias gram positivas teñidas con cristal violeta tendrán un color
azulado o violáceo.

Gram positivas
Las siguientes especies son las gram positivas más representativas:

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Visión de Staphylococus aureus con la tinción de Gram. Podemos

observar que forman racimos, pero su forma es irregular, y los
grupos pueden ser de diversa morfología. Fuente: Dr. Richard
Facklam (CDC)

Visión de Listeria monocytogenes con la tinción de Gram.

Se puede observar que es un cocobacilo alargado que
suele agruparse formando cadenas. Fuente: Zúñiga et.
al., 2011 (Elsevier)


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Visión de Streptococcus pneumoniae con la tinción de

Gram.Se pueden observar cocos agrupados en cadenas
o en parejas. Fuente: Arnold Kaufman (CDC)

Visión de Corynebacterium striatum con la tinción de Gram. Se

apreciar bacilos alargados o ligeramente curvados, característicos del
género Corynebacterium. Fuente: Dr. W.A. Clark (CDC) 

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Visión de Bacillus anthracis con la tinción de Gram. Podemos ver como

está organizada en largas hebras filamentosas. Para ver las
endosporas que forman es necesaria otra tinción que veremos más
adelante. Fuente: Dr. Brodsky (CDC)

Quizá eches de menos a Mycobacterium tuberculosis. Es cierto, que es una bacteria

gram positiva. No obstante, no se detecta bien con la tinción de gram. Hace falta otra
tinción diferencial (tinción de Ziehl-Neelsen) que veremos más adelante.

Gram negativas
A continuación veremos algunas de las bacterias gram negativas más comunes:

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Escherichia coli y Staphylococcus aureus con la tinción

de Gram. Podemos Búsqueda...
ver los cocos azules gram
positivos (S. aureus) y los bacilos gram negativos que
representan a E. coli. Fuente: Y tambe, CC BY-SA 3.0
https://creativecommons.org/licenses/by-
sa/3.0, via Wikimedia Commons

Neisseria gonorrhoeae con la tinción de Gram. Podemos ver

que su morfolofía es de coco, y que suelen agruparse en
diplococos. Fuente: Renelle Woodall (CDC)


Legionella pneumophila con la tinción de Gram. Fuente: CDC

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Pseudomonas aeruginosa con la tinción de Gram. Aparecen como

bacilos alargados. Fuente: Dr. W.A. Clark (CDC)

Acinetobacter baumannii con la tinción de Gram. A primera vista

puede parecer más azulado, aunque si nos fijamos más,

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podemos ver como las bacterias aparecen de color rosado.

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Fuente: @mICROBIOsh (Twitter)

Recordatorio: las bacterias gram positivas se tiñen de azul (azul oscuro o violeta), mientras que las bacterias gram
negativas se tiñen de rojo (rojo, anaranjado o rosado). A lo mejor lo tienes claro; pero en mi caso personal casi siempre las
confundía. Por eso he puesto el color respectivo en cada frase, para que lo recuerdes mejor si te pasa igual que me pasaba
a mí. 😉

Tinción Ziehl-Neelsen
La tinción de Ziehl-Neelsen es de tipo diferencial, y sirve para detectar bacterias ácido-
alcohol resistentes (BAAR), siendo la más destacada Mycobacterium tuberculosis. Esto
es muy útil, sobre todo teniendo en cuenta que M. tuberculosis no puede ser detectada
correctamente con la tinción de Gram.

Lo que hace diferentes a estas bacterias es la presencia de un polímero (ácidos

micólicos) que se une a azúcares, lo que provoca que el conjunto de la pared sea muy
impermeable.

Colorantes
Fucsina fenicada. Da un color rojizo a las bacterias AAR.

Azul de metileno. Da un color azulado al resto de bacterias que no son AAR.

En la tinción de Ziehl-Neelsen, el alcohol-ácido cumple la una función parecida a la del

alcohol 96% en la tinción de Gram. En este caso, el contraste aparece por los ácidos
micólicos, que hacen que sus bacterias sean impermeables al alcohol-ácido. Las
bacterias que no cuenten con estos ácidos micólicos se decolorarán por acción del
alcohol, y la fucsina saldrá de éstos.

Preparación 
El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se

extienden por el portaobjetos. No se añade agua destilada.

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2. Se fija la muestra con calor.

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3. Se añade fucsina fenicada, cubriendo totalmente el portaobjetos durante 3
minutos.

4. Más tarde, se pasa el mechero varias veces, durante 5 minutos, pero sin permitir
que hierva el colorante, ni que se seque, ya que sino el colorante se consume.

5. El exceso de colorante se quita con agua destilada.

6. Se añade alcohol-ácido para la decoloración durante 10 minutos a intervalos de 1

minuto y medio.

7. Ahora se añade el colorante de contraste, el azul de metileno, durante 3 minutos.

8. Por último, se lava el portaobjetos y se seca al aire.

Utilidades
La principal función de la tinción de Ziehl-Neelsen es la detección de micobacterias,
tales como las provocadoras de tuberculosis (M. tuberculosis) o la lepra (M. leprae).
También hay otras micobacterias que, si bien no son patógenas, sí que pueden ser
patógenos oportunistas en determinadas circunstancias.

Visión de Mycobacterium tuberculosis (bacilos rojizos) con

la tinción de Ziehl-Neelsen en un nódulo linfático. Fuente:
Dr. Edwin P. Ewing, Jr. (CDC)

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Además, se pueden detectar corinebacterias de gran interés para la biotecnología por su

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producción de aditivos, o a Streptomyces, formadora de diversos antibióticos. Nocardia y
Actinomices también pueden aparecen como bacterias ácido-alcohol resistentes.

Las células bacterianas teñidas con fucsina aparecerán con un color rojo fuego,
mientras que las teñidas con azul de metileno tendrán un color azulado.

Tinción de Wirtz-Conklin
La tinción de Wirtz-Conklin se usa para observar bien las endosporas bacterianas. La
muestra debe ser obtenida de un cultivo en fase estacionaria. En este caso, para su
observación al microscopio hay que usar la lente x100, usando aceite de inmersión.

Entra en el grupo de las tinciones selectivas, aunque al añadir un colorante de contraste

es tecnicamente una tinción diferencial.

Colorantes
Verde malaquita. Tiñe las endosporas de verde.

Safranina. Es opcional, y sirve para colorear el resto de la célula con un color

anaranjado.

Preparación
El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se

extienden por el portaobjetos. No se añade agua destilada.

2. Se fija la muestra con calor.


3. Se añade verde malaquita, cubriendo totalmente el portaobjetos durante 9 minutos.

4. Ahora se aplica calor de 3 a 6 minutos para que el colorante entre en las paredes de
la endospora. El calor es aplicado hasta que aparezcan emisión de vapores.

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5. Se lava con agua el portaobjetos para retirar el colorante de la célula (a excepción

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de las endosporas).

6. Ahora se añade el colorante de contraste, la safranina, durante 5 minutos.

7. Por último, se lava con agua y se seca el portaobjetos.

Utilidades
Se usa para observan las endosporas bacterianas, estructuras de resistencia que forman
algunas bacterias para sobrevivir en condicione ambientales extremas donde no pueden
hacer su ciclo de vida normal. Así, se pueden ver las endosporas que forman Bacillus
anthracis y Clostridium perfringens, entre otros.

Las endosporas no absorben la mayoría de los colorantes debido a sus cubiertas

gruesas e impermeables. No obstante, el verde malaquita puede hacerlo, por lo que las
endosporas bacterianas quedarán teñidas de verde mientras que el resto de las células
bacterianas tendrán un color rosáceo.

Endosporas de Bacillus subtilis coloreadas en verde, 

mientras que el resto de las células bacterianas son de
color rosáceo. Fuente: De Y tambe (original uploader) -
Trabajo propio, CC BY-SA 3.0,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?
curid=49530

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Tinción de Leifson
La tinción de Leifson usa para la observación de flagelos bacterianos; entra dentro de
las tinciones selectivas. Tienen un espesor de 0.01 micrones, por lo que son invisibles al
microscopio óptico; por ello hace falta esta técnica especial. Para su observación en el
microscopio óptico, se debe usar aceite de inmersión y el aumento 100x.

Recalcamos el hecho de esta tinción se usa para ver flagelos bacterianos; los flagelos de
organismos eucariotas son más gruesos y pueden verse con tinciones simples o incluso
con preparaciones al fresco.

Colorantes
Se usa el colorante de Leifson que está formado por:

Fucsina básica 95%. Es el colorante en sí mismo.

Etanol 1.2%.

Ácido tánico 3%. Tiene función de mordiente.

Cloruro sódico 1.5%.

Agua destilada. Aparece en unión a ácido tánico y cloruro sódico, formando parte
de sus soluciones.

Las estructuras teñidas aparecen con color rojizo.

Preparación
El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se


extienden por el portaobjetos. No se añade agua destilada. (Previamente se debe
haber hecho un círculo en el portaobjetos).

2. El proceso de fijación se realiza sin llama durante 5 minutos. No se usa el mechero

ya que demasiado calor puede destruir los flagelos.
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3. Se añaden unas gotas del colorante de Leifson y se espera 15 minutos.

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4. Ahora se lava el portaobjetos con agua destilada y se seca

Utilidades
Esta tinción se usa para ver a los flagelos, algo esencial para identificar muchas
especies. Y es que los flagelos pueden aparecen en número y disposición diferente en
las bacterias, de ahí que sean una forma de clasificación de estas (para ver los tipos de
bacterias según el número y disposición de flagelos puedes entrar en el artículo de la
célula procariota, en la sección “flagelo”).

Flagelos de diversas especies de Bacillus con la tinción de Leifson.

Usando la tinción de Gram no se podrían ver dichos flagelos, de ahí
la necesidad de usar esta alternativa. Fuente: Dr. W.A. Clark
(CDC)

Tinción de Giemsa 
Esta tinción es más usada en citología, ya que puede discriminar entre zonas con altos
contenidos de ADN, por lo que puede diferenciar diversos orgánulos de la célula; es una
tinción diferencial. No obstante, también se usa en microbiología para la detección de
ciertas bacterias, destacando Rickettsia.

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Colorantes Búsqueda...

Colorante de Giemsa. Da un color azul oscuro o violáceo al microorganismo objetivo.

Preparación
El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se

extienden por el portaobjetos.

2. El proceso de fijación se realiza con metanol durante 3 o 5 minutos.

3. Se añaden unas el colorante de Giemsa y se espera 8 minutos.

4. Ahora se lava el portaobjetos con agua destilada y se seca

Utilidades
En microbiología, la tinción de Giemsa detecta a bacterias como Rickettsia y Chlamydia,
a protistas como Plasmodium y Pneumocystis, y ciertos hongos, como Histoplasma.
Dichos microorganismos se detectan en posibles células infectadas.

Visión de Plasmodium malariae con la tinción de Giemsa (azul oscuro).

Se pueden ver hasta 8 merozoitos dentro de la célula infectada. Fuente:
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Dr. Mae Melvin (CDC)

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Otro patógeno importante que detecta la tinción de Giemsa es Helicobacter pylori,
causante de gastritis y úlceras.

Presencia de Helicobacter pylori (bacterias con forma de

espirilo) con tinción de Giemsa en una bioscopia gástrica.
Fuente: Ed Uthman from Houston, TX, USA, CC BY 2.0
https://creativecommons.org/licenses/by/2.0, via
Wikimedia Commons

No obstante, esta tinción es más usada en citología.

Tinción negativa

Se usa para detectar las cápsulas que aparecen en algunas bacterias, así que entra en el
grupo de las tinciones selectivas. La tinción negativa se puede usar para el microscopio
óptico o para el microscopio electrónico.

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Esta técnica se basa en contrastar las muestras mediante una sustancia opaca en
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ambos microscopios. Ahora bien, para el microscopio óptico se contrasta la muestra a
los fotones, mientras que en el microscopio electrónico se constrasta la muestra a los
electrones.

Colorantes
Para el microscopio óptico, principalmente pueden ser dos:

Tinta china.

Nigrosina.

Tiñen el fondo de negro.

Preparación
El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

1. Se hace una preparación en fresco de la muestra.

2. Ahora se añade tinta china.

3. Ya se puede observar

Si, de todas las tinciones, es el proceso más corto que hemos visto.

Utilidades
La principal función de la tinción negativa es observar las cápsulas bacterianas. Esto
ocurre porque las cápsulas no absorben la tinta china, por lo que estas estructuras
aparecen como zonas claras en un fondo negro, oscuro.
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Visión de las cápsulas de Cryptococcus neoformans en el microscopio

óptico con tinción negativa (tinta china). Fuente: Dr. Leanor Haley
(CDC)

Ahora bien, se pueden añadir algún colorante de contraste para que las células
bacterianas sean más visibles. Y, como ya hemos dicho, se puede usar nigrosina en vez
de tinta china.

colorantes gram gram negativo gram positivo microscopía

microscopios tinciones

Qué sabemos sobre el hongo negro

Protistas
(mucormicosis)


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