MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL PRACTICA 3 PREPARACION, FIJACION Y TINCION DE BACTERIAS I.

OBJETIVOS Que el alumno aprenda de forma prctica las tcnicas de preparacin de frotis, de fijacin y coloracin ms utilizadas en el estudio microscpico de cultivos bacterianos. Que identifique las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simple y diferencial en la caracterizacin e identificacin morfolgica de estos microorganismos. Que el estudiante clasifique algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tincin de Gram. Que observe estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y cpsulas con tinciones selectivas.

II. INTRODUCCION Debido al pequeo tamao de la mayora de los microorganismos, se requiere un microscopio ptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para hacer la descripcin morfolgica de stos. El microscopio de uso ms comn es de campo claro, en el que la observacin de clulas vivas es limitada debido a que las clulas son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz. La observacin de frotis teidos es ms recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensin de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y se tien los microorganismos. De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio, se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son: simple, diferencial, negativa y selectiva. Los frotis de cultivos lquidos se debern fijar con alcohol para evitar residuos del medio, que al quemarse darn interferencias en las observaciones y los de colonias de medios slidos se fijan generalmente con calor. Despus de la fijacin, los frotis son teidos con diferentes colorantes sintticos derivados de anilina. Los colorantes ms utilizados son sales formadas por los iones coloridos cargados conocidos como cromforos. Por ejemplo: Cloruro de Azul de Metileno Azul de metileno+ + Cl(Cromforo) Si el cromforo es un in positivo, el colorante es de tipo bsico, pero si la carga es negativa ser de tipo cido. La mayora de las bacterias son teidas por colorantes bsicos, que pernean la pared celular y se adhieren por enlaces inicos dbiles a molculas con cargas negativas de la clula bacteriana. La tincin de las bacterias con azul de metileno, es un ejemplo de tincin simple que facilita la observacin de forma, tamao y arreglo de las clulas. Tincin Gram: La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos en menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. El mtodo se fundamenta en el hecho de que el colorante primario 1

(cristal violeta) tie por igual a todas las bacterias, pero la combinacin con el colorante es ms permanente en los gram positivos. Para establecer la diferenciacin en estos dos grupos, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero los elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sera muy difcil su observacin por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica el color de los microorganismos que haban retenido el color primario, pero tie a los microorganismos decolorados. Estas diferencias de tincin de las bacterias se explican por cambios en la composicin qumica y estructura de las paredes celulares, que facilitan la retencin o eliminacin del colorante primario despus del proceso de decoloracin. Otras tinciones que permiten obtener mayor observacin son la negativa y la selectiva. La tincin negativa facilita las observaciones de la morfologa y tamao de las bacterias sin alteracin por efecto del calor as como de estructuras especiales, como la cpsula de algunas especies bacterianas. La cpsula tambin llamada glicocalix es una estructura externa a la clula, formada de polisacridos o polipptidos, que confiere proteccin a las bacterias contra la desecacin y la fagocitosis. La extensin sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cpsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la clula bacteriana en un fondo obscuro. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localizacin son importantes criterios de clasificacin taxonmica. Adems, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos patgenos de gran toxicidad, su detenccin en microbiologa alimentara y mdica adquiere gran inters. III. MATERIALES 1 Probeta de 100 mL 1 Vaso de precipitados de 100 mL 1 Hornilla 1 Mechero 1 Asa de siembra 10 Portaobjetos por grupo 1 Piceta con agua destilada Azul de metileno alcalino Alcohol etlico al 70% Cristal violeta Safranina Lugol Solucin de alcohol acetona Verde de malaquita 2

Tinta china Fenol al 2% Aceite de inmersin Microscopio ptico Material que debe traer el grupo de trabajo: 1 cubeta de tincin de fabricacin artesanal Asas bacteriolgicas Toallas de papel, o papel higinico Frascos goteros (Total 7 por grupo) 1 Frasco de Tinta china

IV: PROCEDIMIENTO El estudiante preparar frotis de cultivo slido y de cultivo lquido, con los cuales proceder a la fijacin y a las siguientes tinciones: a) Preparacin de frotis b) Fijacin de frotis c) Tinciones Simples d) Tincin de Gram e) Tincin Selectiva de endosporas en un frotis fijado al calor. f) Tincin de Cpsulas La profesora explicar los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminacin. 4.1. Preparacin de FROTIS (extensiones de la muestra sobre portaobjetos para teir) Las extensiones de bacterias procedentes de cultivos sobre medios slidos se hacen sobre portaobjetos de vidrio como sigue: 1) Lavar perfectamente los portaobjetos con deteregente, abundante agua y luego con alcohol etlico, secar. 2) Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. 3) Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Despus acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapn y flamear rpidamente la boca del mismo. Introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra. 4) Para el caso de cultivos lquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en un rea circular de 2 cm de dimetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2 3 veces ms. 5) Si el cultivo es de medio slido, con el asa de platino, previamente se colocar una gota de agua destilada en el centro del portaobjetos. Posteriormente se realiza los pasos 6, 7, 8 y 9. 6) Se esteriliza el alambre del asa ponindolo verticalmente a la llama del mechero hasta que en toda su longitud se ponga al rojo. 3

7) Se deja enfriar el asa. 8) Cogiendo el asa, se toma una pequea porcin de la colonia bacteriana que se vaya a examinar. 9) Se pone sobre la gota del portaobjetos y con el asa se hace una emulsin y se extiende. Se debe tratar de conseguir extensiones finas, inclusive tan delgadas que no se vean cuando secan. 10) Esterilizar el asa. 11) Dejar que la preparacin se seque al aire 4.2. Fijacin del FROTIS 1) Fijar los frotis de cultivos lquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas del mechero) 2) Los frotis de cultivo slido, completamente secos se fijarn con calor. Para esto se pasar el frotis rpidamente 2 3 veces (en posicin horizontal) sobre la llama del mechero, cuidando de que la muestra se encuentre en la parte superior del portaobjeto que se calienta. Evitar sobre calentamiento del portaobjetos durante esta operacin, palpando la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento. 3) Se repite la ltima operacin hasta sequedad total, cuidando de impedir la combustin del extendido. 4.3. Tinciones simples.Las preparaciones fijadas por el calor cubrir con el colorante que se expone a continuacin. Despus del tiempo indicado, eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua coirriente o con la ayuda de la piceta con agua destilada. Dejar secar al aire. Examinar al microscopio. Cristal violeta (Se tie durante 1 minuto) Azul de metileno (Se tie al menos 3 minutos) Fucsina (Se tie solo durante 30 segundos)

4.4. Tincin diferencial de Gram.1) Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta (violeta de genciana) durante 30 segundos a 1 minuto. 2) Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante, durante 5 segundos.. 3) Sacudir un poco y sin dejar secar, cubrir el frotis con dos gotas de lugol durante 30 segundos a un minuto 4) Lavar cuidadosamente el frotis con agua, escurrir y secar al aire. 5) Decolorar con alcohol mediante suave agitacin hasta liberar el color (30 segundos) o inclinando el portaobjetos, se aplica gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya ms tintura. 6) Inmediatamente lavar con agua, escurrir y secar al aire. 7) Teir durante 30 segundos con fucsina 8) Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire. 9) Observar al microscopio.

10) Es preciso insistir en que esta prueba debe realizarse con cultivos jvenes ya que algunas bacterias cambian la reaccin de Gram a medida que el cultivo envejece. 4.5. Tincin selectiva de endosporas.Las esporas pueden distinguirse en las preparaciones microscpicas sin previa coloracin debido a la refringencias que poseen y que los diferencia del resto del microorganismos. En las preparaciones teidas con los mtodos comunes, la espora no se colorea debido a la resistencia que ofrece a la impregnacin con los colorantes; la espora y la gruesa membrana que lo recubre permanecen incoloros, destacandose netamente el cuerpo microbiano fuertemente coloreado. No obstante, esta resistencia a la tincin, la membrana de la espora puede ser teida y las esporas colorearse por distintos mtodos. Tcnica de Wirtz: Una vez fijada la preparacin se cubre con solucin acuosa al 5% de verde de malaquita. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullicin. Se deja actuar de 3 a 5 minutos [o calentando suavemente, por medio de vapor], evitando que se seque el colorante (agregar un poco ms si es necesario). Eliminar el colorante con agua destilada. Aplicar una coloracin de contraste durante 10 minutos con solucin al 0,5% de safranina. Lavar nuevamente con agua y dejar secar al aire. Observar en el microscopio ptico. Las esporas aparecen coloreadas de verde y las bacterias de rojo. 4.6. Tincin negativa para observacin de cpsulas.a) Colocar una pequea gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos. Colocar junto a una gota del cultivo lquido. Si se trata de un cultivo slido, hacer una suspensin del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china. b) Distribuir la mezcla a los ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ngulo de 45 sobre la muestra. c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla. d) Dejar secar al aire. 4.7. Observaciones al microscopio.Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda o algodn. Colocar el portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequea gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que daan a estos sistemas. V. RESULTADOS Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo tal como se indica en los Cuadros de Resultados. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos.

TINCIONES SIMPLES

Cristal Violeta

Azul de Metileno

Fucsina 5

Descripcin del cultivo: lquido o slido, medio de cultivo. Aumento total:

Forma: Cocos, bacilos Agrupamiento clulas: de las

TINCION GRAM Descripcin del cultivo: lquido o slido, medio de cultivo. Aumento total:

Muestra N 1

Muestra N 2

Muestra N 3

Muestra N 4

Forma: bacilos

Cocos, de

Agrupamiento las clulas: Reaccin Gram:

TINCION DE ENDOSPORAS Descripcin del cultivo: lquido o slido, medio de cultivo. Aumento total:

Muestra N 1

Muestra N 2

Muestra N 3

Muestra N 4

Morfologa: 6

TINCION DE CAPSULA Descripcin del cultivo: lquido o slido, medio de cultivo. Aumento total:

Muestra N 1

Muestra N 2

Muestra N 3

Muestra N 4

VI. CUESTIONARIO 1. Por que se usa cubreobjetos?. Se utiliza siempre? 2. Cules son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qu se debe utilizar el aceite de inmersin al hacer el estudio microscpico de bacterias?. 3. Que ventajas se obtiene utilizando el objetivo de inmersin? 4. Investigue cules son las estructuras celulares o molculas responsables de la tincin simple realizada. 5. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple? 6. Por qu se recomienda fijar los frotis de cultivos lquidos con alcohol y no con calor? Por qu se deben poner varias veces muestras del cultivo lquido y solo una muestra de cultivos slidos al preparar los frotis? 7. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin de frotis? 8. Explique en forma completa la teora que explica la tincin de Gram. 9. Por qu antes de La tincin se debe fijar el material que se observar? 10. Cules son las fuentes de error ms comunes en la tincin de Gram? 11. Cul es la influencia del pH en la tincin Gram? 12. Explique el fundamento de la tincin de endosporas. Por qu se debe calentar la preparacin? Qu dificultades se tendran si no se adiciona la safranina al final de la tincin?.