MICROBIOLOGÍA

LABORATORIO N0 4

COLORACIÓN DE GRAM

INTRODUCCIÓN

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante
debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de
Microbiología. La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la
visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la
técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color
moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través
de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I 2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente
para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula
bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.La mezcla de alcohol-
acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I 2/cristal violeta. Los
organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.

Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color
rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las
Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de
contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas
y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).

OBJETIVOS:

Que el estudiante:

 Adquiera destreza en la técnica de la coloración de Gram.

 Aprenda a diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas
 Interprete los resultados obtenidos en la aplicación de esta técnica.
 Clasifique algunas especies bacterianas en Gram negativas o Gram positivas de acuerdo a la tinción de Gram.

MATERIALES Y REACTIVOS:

 Cultivos de bacterias Gram (+) y Gram (-).

 Portaobjetos
 Papel absorbente
 Puente de coloración
 Mecheros
 Aceite de inmersión
 Cristal violeta
 Lugol
 Safranina
 Alcohol acetona
 Asas
 Microscopio
 Agua destilada

METODOLOGÍA:

1. Extienda y fije la muestra.

2. Cubra el extendido con cristal violeta. Déjelo actuar durante 1 minuto.
 3. Lave el exceso de colorante con agua.
4. Cubra el extendido con solución yodada (lugol). Durante 1 minuto. Este actúa como un mordiente.
5. Lave con agua.
6. Decolore con alcohol acetona durante 10 a 15 segundos aproximadamente.
7. Lave con agua.
8. Cubra el extendido con safranina. Déjela actuar durante 1 minuto.
9. Lave con agua, seque al ambiente y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
10. Haga esquemas y describa lo observado.

Bacilos Gram negativas Cocos Gram positivos

MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO N0 5

TINCIONES SELECTIVAS: TINCIÓN DE CAPSULA

INTRODUCCIÓN

La cápsula bacteriana es la capa rígida con borde definido formada por una serie de polímeros orgánicos que en las bacterias se
deposita en el exterior de su pared celular. Generalmente contiene glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes,
incluyendo polialcoholes y aminoazúcares. []

La cápsula es una capa rígida organizada en matriz impermeable que excluye colorantes como la tinta china. En cambio, la capa de
material extracelular que se deforma con facilidad, es incapaz de excluir partículas y no tiene un límite definido, se denomina capa
mucosa o glucocalix. La cápsula les sirve a las bacterias de cubierta protectora resistiendo la fagocitosis. También se utiliza como
depósito de alimentos y como lugar de eliminación de sustancias de desecho. Protege de la desecación, ya que contiene una gran
cantidad de agua disponible en condiciones adversas. Además, evita el ataque de los bacteriófagos y permite la adhesión de la
bacteria a las células animales del hospedador.

Al utilizar las técnicas normales de coloración ya realizadas no es posible visualizar la cápsula, por lo tanto es necesario aplicar
técnicas especiales. Para la visualización de la cápsula se conocen varias técnicas, entre ellas tenemos la de Anthony y la de tinta
china que desarrollaremos en esta práctica.

OBJETIVOS

Que el estudiante:

 Aprenda algunas de las técnicas empleadas para la visualización de cápsulas bacterianas.

 Interprete correctamente los resultados obtenidos en la aplicación de esta técnica.
 Comprenda la importancia que tiene esta tinción para la caracterización e identificación de bacterias.
MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS

 Mecheros
 Portaobjetos
 Asa microbiológica
 Frasco lavador con agua destilada
 Cultivo de Klebsiella pneumoniae
 Tinta china
 Solución salina isotónica
 Aceite de inmersión
 Microscopio compuesto

METODOLOGIA

1. TINCIÓN NEGATIVA PARA OBSERVACIÓN DE CÁPSULAS

1. Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota del cultivo líquido de
Klebsiella pneumoniae. Si se trata de un medio de cultivo sólido, hacer una suspensión del microorganismo en una gota de agua
destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china.
2. Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjetos perpendicular en ángulo de 45 0 sobre la muestra.
3. Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.
4. Dejar secar al aire
5. Observar con objetivo de inmersión.(100x)

Tinción de Anthony para cápsula bacteriana

PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN (tinción de Gram)

Explique:

 ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram?

 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de Gram
 Porque las bacterias Gram negativas se tiñen de rosado a diferencia de las Gram positivas (morado) siendo el
procedimiento de tinción el mismo?
 ¿Cuál es la función del lugol en la técnica anterior?

PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN

1. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica.

2. Qué tipo de información se obtiene?
3. Que otra técnica de tinción selectiva permite observar estas estructuras bacterianas.
4. Realiza una lista de bacterias que sinteticen cápsulas.

DESARROLLAR EN GRUPOS DE LABORATORIO Y ENTREGAR EL VIERNES 22 DE MAYO