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PRECIPITACIÓN
5.1. Introducción

La precipitación es un importante método tradicional para purificar las proteínas y los ácidos nucleicos. El
ejemplo más común de bioseparación basada en la precipitación es el método de fraccionamiento de
Cohn para purificar las proteínas plasmáticas. Con este método, que consiste en una serie de pasos de
precipitación, las diversas proteínas componentes del plasma humano se obtienen en formas puras. La
bioseparación basada en la precipitación consiste esencialmente en la conversión selectiva de un
componente específico disuelto de una mezcla compleja en una forma insoluble utilizando medios físicos
o físico-químicos adecuados. La forma insoluble que se obtiene como precipitado (típicamente un sólido
fácil de sedimentar) se separa posteriormente de los componentes disueltos mediante técnicas
apropiadas de separación sólido-líquido, como la centrifugación (véase la Fig. 5.1). La cristalización es un
tipo especial de proceso de precipitación en el que el sólido se obtiene en forma cristalina. La formación
de cristales tiene lugar muy lentamente en condiciones muy controladas y, por lo tanto, los procesos de
cristalización deben llevarse a cabo en condiciones muy optimizadas. Por el contrario, un proceso de
precipitación normal no necesita ser controlado con precisión y el material sólido obtenido es de
naturaleza amorfa.

5.2. FACTORES UTILIZADOS PARA LA PRECIPITACIÓN MACROMOLÉCULAS BIOLÓGICAS PUEDEN SER

PRECIPITADOS POR:

1. Refrigeración
2. Ajuste del pH
3. Adición de disolventes como la acetona y el etanol
4. Adición de sales antiestáticas como sulfato de amonio y sulfato de sodio
5. Adición de sales caótropas como la urea y el clorhidrato de guanidina
6. 6. Adición de reactivos bioespecíficos como en la inmunoprecipitación

La solubilidad de las proteínas en soluciones acuosas depende de la temperatura. La Fig. 5.2 muestra los
perfiles de solubilidad-temperatura de dos proteínas A y B. Es evidente que la solubilidad de A es más
sensible al descenso de la temperatura que la de B. Por lo tanto, la separación de A y B podría llevarse a
cabo reduciendo la temperatura de la solución hasta el punto en que A se precipita en gran medida
mientras que B sigue estando en gran medida en solución. El enfriamiento por sí solo rara vez se utiliza
para la precipitación. Sin embargo, el enfriamiento es parte integrante de la precipitación con disolventes
orgánicos y sales anticotrópicas, en parte debido al efecto sinérgico de reducción de la solubilidad y en
parte debido a la mayor estabilidad de las macromoléculas biológicas a temperaturas más bajas.
La precipitación mediante el uso de aditivos se rige por la ecuación termodinámica:

Whee

= potencial químico del soluto precipitado

= potencial químico del soluto disuelto

Cuando un soluto se precipita de su solución, el precipitado está compuesto principalmente por el

soluto. Así que su potencial químico a una temperatura dada es constante. Por otro lado, el potencial
químico del soluto disuelto depende de su concentración y viene dado por:

= potencial químico del soluto en el estado de referencia estándar

x = concentración de solutos (fracción molar)

El potencial químico del estado de referencia estándar puede aumentarse añadiendo sustancias como
sales y disolventes. En presencia de tales aditivos, la concentración de soluto en la fase de solución debe
disminuir para que el potencial químico del soluto en solución sea el mismo que el del precipitado. Esto es
evidente a partir de las ecuaciones (5.1) y (5.2). La disminución de la concentración tiene lugar por
precipitación. La solubilidad de una proteína depende del pH de la solución, observándose la solubilidad
mínima en su punto isoeléctrico. La Fig. 5.3 muestra las curvas de solubilidad del pH para dos proteínas A
y B. La separación de las dos proteínas podría llevarse a cabo manteniendo el pH de la solución a pHB (el
punto isoeléctrico de B). En esta condición, B se precipitaría en gran medida, mientras que A
permanecería en gran medida en la solución. La separación también sería factible en el pHA (el punto
isoeléctrico de A). En esta condición A se precipitaría en gran medida mientras que B permanecería en
gran medida en la solución. Al igual que con el enfriamiento, el ajuste del pH por sí solo rara vez se utiliza
para la separación de proteínas, ya que una vez más las diferencias de solubilidad no son lo
suficientemente grandes. Sin embargo, el efecto de solubilidad del pH puede utilizarse en los procesos de
precipitación de proteínas a base de sal para optimizar las condiciones de funcionamiento. Los disolventes
como el etanol y la acetona precipitan las proteínas al disminuir la constante dieléctrica de la solución. El
uso de disolventes orgánicos en la precipitación de proteínas está muy extendido, y un ejemplo
importante de ello es el fraccionamiento de proteínas en el plasma. Cabe señalar, sin embargo, que los
disolventes orgánicos desnaturalizan las proteínas a temperatura ambiente. Por lo tanto, los procesos de
precipitación de proteínas a base de disolventes orgánicos suelen llevarse a cabo a bajas temperaturas a
fin de reducir al mínimo la desnaturalización. Los disolventes orgánicos también se utilizan ampliamente
para la precipitación de ADN y ARN.

Las sales anticotrópicas como el sulfato de amonio y el sulfato de sodio exponen parches hidrofóbicos en
las proteínas al eliminar la capa de agua altamente estructurada que suele cubrir estos parches en
solución. Como resultado, los residuos hidrofóbicos en una molécula de proteína pueden interactuar con
los de otra y esto eventualmente lleva a la agregación y formación de precipitados. Las sales también
pueden reducir la solubilidad de las proteínas al apantallar los grupos cargados que normalmente
mantienen a las proteínas separadas en la solución. Cuando la carga electrostática de las moléculas de
proteína está protegida, las moléculas pueden interactuar fácilmente, formar agregados y eventualmente
precipitarse. La solubilidad de las diferentes proteínas se reduce en diferentes grados por la adición de sal.
Sobre la base de este comportamiento diferencial, la separación de las proteínas es factible, siendo un
ejemplo importante la purificación parcial del anticuerpo monoclonal del sobrenadante del cultivo celular.
La Fig. 5.4 muestra el efecto de la concentración de sulfato de amonio en la solubilidad de dos proteínas A
y B. A bajas concentraciones de sulfato de amonio, el aumento de la concentración de sal da lugar a un
aumento de la solubilidad de las proteínas. Esto se denomina efecto de salado. A concentraciones más
altas de sulfato de amonio, la solubilidad de las proteínas disminuye muy significativamente con el
aumento de la concentración de sal. Esto se conoce como el efecto de salado. La Fig. 5.4 sugiere que sería
posible separar A de B ajustando la concentración de sulfato de amonio de tal manera que B se precipitara
en gran medida mientras que A permaneciera en gran medida en la solución. El uso de sales
anticotrópicas para la purificación de las proteínas está muy extendido. Las tres sales más utilizadas son el
sulfato de amonio, el sulfato de sodio y el cloruro de sodio. Las sales anticotrópicas ejercen una influencia
estabilizadora en las proteínas, es decir, su desnaturalización es insignificante. Las sales anticotrópicas
también podrían utilizarse junto con otros agentes para la precipitación del ADN y el ARN. Las sales
caótropas o caóticas, como la urea y el clorhidrato de guanidina, precipitan las proteínas al
desnaturalizarlas. Estas sales actúan interrumpiendo los enlaces intramoleculares de hidrógeno y las
interacciones hidrofóbicas en las proteínas. No se utilizan para el fraccionamiento de las proteínas, sino
que se emplean principalmente para el redoblamiento de las proteínas, en particular en la elaboración de
los cuerpos de inclusión. Las sales caótropas se utilizan en la purificación del ADN y el ARN, ya que
precipitan las proteínas pero dejan las moléculas de ácido nucleico en gran medida inalteradas. La
inmunoprecipitación se basa en el reconocimiento y la unión antígeno-anticuerpo. Esto, en su forma más
simple, puede llevarse a cabo tratando una solución que contenga antígenos con un anticuerpo o
viceversa. Cuando los antígenos multivalentes reaccionan con anticuerpos en solución, forman grandes
redes moleculares mediante enlaces cruzados. Estos grandes complejos que finalmente se precipitan se
denominan precipitinas y pueden eliminarse fácilmente de las soluciones mediante técnicas estándar de
separación sólido-líquido. Otra forma de llevar a cabo la inmunoprecipitación es tratando un antígeno con
una forma insoluble de su anticuerpo o tratando un anticuerpo con una forma insoluble de su antígeno.
5.3. 5.3. Precipitación con disolventes orgánicos Los disolventes orgánicos precipitan las proteínas y otras
macromoléculas reduciendo la constante dieléctrica del medio en el que están presentes. La ecuación
rectora de la precipitación de proteínas con base en disolventes es :

Donde

S = solubilidad de la proteína (kg-moles/m3 )

Sw = solubilidad de la proteína en el agua (kg-moles/m3 )
A = una constante
e = constante dieléctrica del medio (-)
ew - constante dieléctrica del agua (-)

La constante dieléctrica del agua a 25 grados centígrados es de 78,3 mientras que la del etanol a la misma
temperatura es de 24,3. Así pues, la ecuación (5,3) sugeriría que una proteína tendría una solubilidad
menor en una mezcla de etanol y agua que en el agua misma. Concentraciones más altas de disolventes
orgánicos pueden desnaturalizar las proteínas. Los disolventes orgánicos suelen unirse a lugares
específicos de las moléculas de la proteína y, por lo tanto, perturban las interacciones hidrofóbicas que
mantienen la estructura de la proteína en su lugar. De ahí que se utilicen cantidades muy pequeñas de
disolvente orgánico en los procesos de precipitación y que éstos se lleven a cabo a bajas temperaturas
para reducir al mínimo la desnaturalización. La acetona y los alcoholes alifáticos como el metanol, el
etanol, el propanol y el butanol se utilizan principalmente para la precipitación de proteínas. El grado de
desnaturalización de las proteínas por los alcoholes alifáticos aumenta con el incremento de la longitud de
la cadena, por ejemplo, el butanol causa más desnaturalización que el etanol.

Fig. 5.4 Precipitación de proteínas con sal anticotrópica

Los ácidos nucleicos como el ADN y el ARN también pueden precipitarse utilizando disolventes orgánicos
como el etanol. Los procesos de precipitación de los ácidos nucleicos se llevan a cabo a temperaturas muy
bajas, típicamente -20 grados centígrados.
La precipitación de los ácidos nucleicos por los disolventes orgánicos también puede describirse mediante la
ecuación (5.3).

Una aplicación importante de la precipitación basada en disolventes orgánicos en la bioseparación es el

método de fraccionamiento de Cohn para la purificación de las proteínas del plasma humano. En este
método se llevan a cabo una serie de pasos de precipitación de alcohol etílico utilizando diferentes
concentraciones de alcohol, valores de pH de la solución y temperaturas de precipitación. Con este método
se pueden obtener una serie de productos como la albúmina sérica, la inmunoglobulina G, el plasminógeno,
las lipoproteínas y la protrombina.

PREGUNTAS

1) La precipitación es un método para __________________________________

2) Una mezcla compleja a una forma insoluble usando medios físicos o fisicoquímicos apropiados se
obtiene un __________________________________________
3) Un proceso de precipitación normal no necesita ser controlado con precisión y el material sólido
obtenido es de naturaleza __________________
4) Las macromoléculas biológicas pueden precipitarse por(Enumerar):

5) La figura 5.2 muestra los perfiles de:

6) La solubilidad de una proteína depende de la solución_______ que la solubilidad mínima que se

observa en su ___________________________
7) Los disolventes como __________y __________se precipitan __________al disminuir la
______________________________de la solución.
8) Los disolventes orgánicos también se utilizan ampliamente para _______la _______precipitación.
9) Las sales anticotrópicas como ___________________y ____________________exponen parches
hidrofóbicos en las proteínas
10) PROBLEMA

La solubilidad de la ovoalbúmina en el agua es de 390 kg/m3 . Cuando se añadieron 30 ml de etanol

a 100 ml de una solución de ovoalbúmina de 50 mg/ml en agua, se encontró que el 33 % de la
proteína se precipitaba. ¿Cuánta proteína se precipitaría si se añadieran 100 ml de etanol a 100 ml
de una solución de proteína similar a la misma temperatura? Supongamos que la constante
dieléctrica del medio varía linealmente con la composición volumétrica de los dos disolventes

La constante dieléctrica del agua es 78,3 y la del etanol puro es 24,3

S = 33.5
Entonces = 390 kg/m3
ew = 78.3
e = 65.8

La constante dieléctrica de la solución obtenida al mezclar 100 ml de etanol con 100 ml de solución
acuosa es 51,3.

S=
Entonces = 390 kg/m3
ew = 78.3
e = 51.3