NOMBRES QUISPE ORTIZ JHON ALFREDO

PRECIPITATION
5.1. Introduction
La precipitación es un método tradicional importante para purificar proteínas y ácidos
nucleicos. El ejemplo más común de bioseparación basada en precipitación es el método de
fraccionamiento de Cohn para purificar proteínas plasmáticas. Usando este método, que
consiste en una serie de etapas de precipitación, las diversas proteínas componentes del
plasma humano se obtienen en formas puras. La bioseparación basada en la precipitación
implica esencialmente la conversión selectiva de un componente disuelto específico de una
mezcla compleja a una forma insoluble usando medios físicos o fisicoquímicos apropiados.
La forma insoluble que se obtiene como un precipitado (típicamente un sólido fácil de
sedimentar) se separa posteriormente de los componentes disueltos mediante técnicas
apropiadas de separación sólido-líquido como la centrifugación (ver Fig. 5.1). La
cristalización es un tipo especial de proceso de precipitación en el que el sólido se obtiene
en forma cristalina. La formación de cristales tiene lugar muy lentamente en condiciones
altamente controladas y, por lo tanto, los procesos de cristalización deben llevarse a cabo en
condiciones altamente optimizadas. En contraste, un proceso de precipitación normal no
necesita ser controlado con precisión y el material sólido obtenido es de naturaleza amorfa.

5.2. FACTORES UTILIZADOS PARA LA PRECIPITACIÓN LAS

MACROMOLÉCULAS BIOLÓGICAS SE PUEDEN PRECIPITAR POR:
1. Enfriamiento
2. ajuste de pH
3. Adición de disolventes como acetona y etanol.
4. Adición de sales anticaotrópicas como sulfato de amonio y sulfato de sodio.
5. Adición de sales caotrópicas como la urea y el clorhidrato de guanidina
6. Adición de reactivos bioespecíficos como en inmunoprecipitación.
La solubilidad de las proteínas en soluciones acuosas depende de la temperatura. La figura
5.2 muestra los perfiles de solubilidad-temperatura de dos proteínas A y B. Es evidente que
la solubilidad de A es más sensible a la disminución de la temperatura que B. Por lo tanto,
la separación de A y B podría llevarse a cabo disminuyendo la temperatura de la solución
hasta el punto en que A precipita en gran medida mientras B todavía está en gran medida en
solución. El enfriamiento por sí solo rara vez se usa para la precipitación. Sin embargo, el
enfriamiento es una parte integral de la precipitación que involucra solventes orgánicos y
sales antichaotrópicas, en parte debido al efecto sinérgico de disminución de la solubilidad
y en parte debido a la mayor estabilidad de las macromoléculas biológicas a temperaturas
más bajas.

Precipitation by using additives is governed by the thermodynamic equation:

Whee
= chemical potential of the precipitated solute
= chemical potential of the dissolved solute
When a solute is being precipitated from its solution, the precipitate is mainly
composed of the solute. So its chemical potential at a given temperature is constant. On the
other hand the chemical potential of the dissolved solute depends on its concentration and is
given by:

= chemical potential of solute at standard reference state

x = solute concentration (mole-fraction)
El potencial químico del estado de referencia estándar puede aumentarse agregando
sustancias como sales y solventes. En presencia de tales aditivos, la concentración de soluto
en la fase de solución debe disminuir para que el potencial químico del soluto en solución
sea el mismo que el del precipitado. Esto es evidente a partir de las ecuaciones (5.1) y (5.2).
La disminución de la concentración tiene lugar por precipitación. La solubilidad de una
proteína depende del pH de la solución, observándose la solubilidad mínima en su punto
isoeléctrico. La figura 5.3 muestra las curvas de solubilidad del pH para dos proteínas A y
B. La separación de las dos proteínas podría llevarse a cabo manteniendo el pH de la
solución a pHB (el punto isoeléctrico de B). En esta condición, B se precipitaría en gran
medida mientras que A permanecería en solución. La separación también sería factible en
pHA (el punto isoeléctrico de A). En esta condición, A se precipitaría en gran medida
mientras que B permanecería en solución. Al igual que con el enfriamiento, el ajuste del pH
por sí solo rara vez se usa para la separación de proteínas, ya que una vez más las
diferencias de solubilidad no son lo suficientemente grandes. Sin embargo, el efecto de
solubilidad del pH se puede utilizar en procesos de precipitación de proteínas a base de sal
para la optimización de las condiciones de operación. Los disolventes como el etanol y la
acetona precipitan proteínas al disminuir la constante dieléctrica de la solución. El uso de
solventes orgánicos en la precipitación de proteínas es generalizado, un ejemplo importante
de esto es el fraccionamiento de proteínas plasmáticas. Sin embargo, debe tenerse en cuenta
que los disolventes orgánicos desnaturalizan las proteínas a temperatura ambiente. Por lo
tanto, los procesos de precipitación de proteínas a base de solventes orgánicos
generalmente se llevan a cabo a bajas temperaturas para minimizar la desnaturalización.
Los solventes orgánicos también se usan ampliamente para la precipitación de ADN y
ARN.

Las sales anticaotrópicas como el sulfato de amonio y el sulfato de sodio exponen parches
hidrófobos en las proteínas al eliminar la capa de agua altamente estructurada que
generalmente cubre estos parches en solución. Como resultado, los residuos hidrofóbicos
en una molécula de proteína pueden interactuar con los de otra y esto eventualmente
conduce a la agregación y a la formación de precipitados. Las sales también pueden reducir
la solubilidad de las proteínas al proteger los grupos cargados que normalmente mantienen
las proteínas separadas en solución. Cuando la carga electrostática en las moléculas de
proteína está protegida, las moléculas pueden interactuar fácilmente, formar agregados y
eventualmente precipitar. La solubilidad de diferentes proteínas se reduce en diferentes
grados mediante la adición de sal. En base a este comportamiento diferencial, la separación
de proteínas es factible, un ejemplo importante es la purificación parcial del anticuerpo
monoclonal del sobrenadante del cultivo celular. La figura 5.4 muestra el efecto de la
concentración de sulfato de amonio en la solubilidad de dos proteínas A y B. A bajas
concentraciones de sulfato de amonio, el aumento en la concentración de sal da como
resultado un aumento en la solubilidad de la proteína. Esto se conoce como el efecto de
salazón. A concentraciones más altas de sulfato de amonio, la solubilidad de las proteínas
disminuye muy significativamente con el aumento de la concentración de sal. Esto se
conoce como el efecto de salado. La figura 5.4 sugeriría que podría ser posible separar A de
B ajustando la concentración de sulfato de amonio de modo que B se precipitara en gran
medida mientras A permaneciera en solución. El uso de sales anti-caotrópicas para la
purificación de proteínas está muy extendido. Las tres sales más comúnmente utilizadas son
sulfato de amonio, sulfato de sodio y cloruro de sodio. Las sales anticaotrópicas ejercen una
influencia estabilizadora sobre las proteínas, es decir, hay una desnaturalización
insignificante. Las sales anti-caotrópicas también podrían usarse junto con otros agentes
para la precipitación de ADN y ARN. Las sales caotrópicas o formadoras de caos como la
urea y el clorhidrato de guanidina precipitan las proteínas desnaturalizándolas. Estas sales
actúan interrumpiendo los enlaces de hidrógeno intramoleculares e interacciones hidrófobas
en las proteínas. No se usan para el fraccionamiento de proteínas, pero se usan
principalmente para el replegamiento de proteínas, particularmente en el procesamiento de
cuerpos de inclusión. Las sales caotrópicas se usan en la purificación de ADN y ARN, ya
que precipitan proteínas pero no afectan en gran medida a las moléculas de ácido nucleico.
La inmunoprecipitación se basa en el reconocimiento y unión antígeno-anticuerpo. Esto en
su forma más simple puede llevarse a cabo tratando una solución que contiene antígeno con
un anticuerpo o viceversa. Cuando los antígenos multivalentes reaccionan con los
anticuerpos en solución, forman grandes redes moleculares por reticulación. Estos grandes
complejos que eventualmente precipitan se denominan precipitinas y se pueden eliminar
fácilmente de las soluciones mediante técnicas estándar de separación sólido-líquido.

Dónde S = solubilidad de la proteína (kg-moles / m3) Sw = solubilidad de la proteína en

agua (kg-moles / m3) A = una constante e = constante dieléctrica del medio (-) ew -
constante dieléctrica del agua (-) La constante dieléctrica del agua a 25 grados centígrados
es 78.3 mientras que la del etanol a la misma temperatura es 24.3. Por lo tanto, la ecuación
(5.3) sugeriría que una proteína tendría una solubilidad más baja en una mezcla de agua de
etanol que en el agua misma. Las concentraciones más altas de solventes orgánicos pueden
desnaturalizar las proteínas. Los solventes orgánicos generalmente se unen a ubicaciones
específicas en las moléculas de proteína y, por lo tanto, interrumpen las interacciones
hidrofóbicas que mantienen la estructura de la proteína en su lugar. Por lo tanto, se usan
cantidades muy pequeñas de solvente orgánico en los procesos de precipitación y se llevan
a cabo a bajas temperaturas para minimizar la desnaturalización. La acetona y los alcoholes
alifáticos como metanol, etanol, propanol y butanol se utilizan principalmente para la
precipitación de proteínas. El grado de desnaturalización de proteínas por alcoholes
alifáticos aumenta con el aumento de la longitud de la cadena, p. el butanol causa más
desnaturalización que el etanol.

Fig. 5.4 Protein precipitation using anti-chaotropic salt

Los ácidos nucleicos como el ADN y el ARN también pueden precipitarse usando
solventes orgánicos como el etanol. Los procesos de precipitación de ácido nucleico se
llevan a cabo a temperaturas muy bajas, típicamente -20 grados centígrados. La
precipitación de ácidos nucleicos por solventes orgánicos también se puede describir
usando la ecuación (5.3). Una aplicación importante de la precipitación basada en solventes
orgánicos en la bioseparación es el método de fraccionamiento de Cohn para la purificación
de proteínas plasmáticas humanas. En este método, se llevan a cabo una serie de etapas de
precipitación de alcohol etílico utilizando diferentes concentraciones de alcohol, valores de
pH de la solución y temperaturas de precipitación. Usando este método, se puede obtener
una serie de productos tales como albúmina sérica, inmunoglobulina G, plasminógeno,
lipoproteínas y protrombina.

PREGUNTAS

1) La precipitación es un método para purifying proteins and nucleic acids

2) Una mezcla compleja a una forma insoluble usando medios físicos o fisicoquímicos apropiados se
obtiene un a precipitate (typically an easy to sediment solid)
1) Un proceso de precipitación normal no necesita ser controlado con precisión y el material sólido
obtenido es de naturaleza Amorfa
 2) Las macromoléculas biológicas pueden precipitarse por(Enumerar):

1. Cooling
2. pH adjustment
3. Addition of solvents such as acetone and ethanol
4. Addition of anti-chaotropic salts such as ammonium sulphate and sodium
sulfate
5. Addition of chaotropic salts such as urea and guanidine hydrochloride
6. Addition of biospecific reagents as in immunoprecipitation
3) La figura 5.2 muestra los perfiles de:

Solubilidad y temperatura, el efecto de la solubilidad de la proteína con la temperatura

4) The solubility of a protein depends on the solution pH the minimum solubility being observed at its
isoelectric point
5) Solvents such as ethanol and acetone precipitate proteins by decreasing the dielectric
constant of the solution.
6) Organic solvents are also widely used for DNA and RNAprecipitation.
7) Anti-chaotropic salts such as Ammonium Sulphate and Sodium sulphate expose
hydrophobic patches on proteins

8) PROBLEMA

The solubility of ovalbumin in water is 390 kg/m 3 . When 30 ml of ethanol was added to 100 ml of a
50 mg/ml ovalbumin solution in water, 33 % of the protein was found to precipitate. How much
protein would precipitate if 100 ml of ethanol were added to 100 ml of a similar protein solution at
the same temperature? Assume that the dielectric constant of the medium varies linearly with
volumetric composition of the two solvents

The dielectric constant of water is 78.3 and that of pure ethanol is 24.3

S = 33.5
So = 390 kg/m3
ew = 78.3
e = 65.8

The dielectric constant of the solution obtained by mixing 100 ml of ethanol with 100 ml of aqueous
solution is 51.3.

S=
So = 390 kg/m3
ew = 78.3
e = 51.3

The dielectric constant of water is e w =78.3∧the of pure ethanol is24,3

ln ( 33.5
390 )=(
A 1 1
RT 78.3 65.8 )
)( −

ln ( 390S )=( RTA )( 78.31 − 51.31 )

ln ( 33.5 A 1 1
390 ) ( RT )( 78.3 65.8 )
= −

S A 1 1
ln ( ) =(
RT 78.3 51.3 )
)( −
390

Resolviendo la ecuación logarítmica, se calculan en una calculadora y se obtiene

los siguientes resultados.

S=0.204 mg /ml