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precipitacion de proteinas

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Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008. Trabajo Práctico Nro.

6: PROTEINAS Objetivos: • Demostrar el efecto de metales pesados, sales, ácidos fuertes, y calor sobre la estabilidad de las proteínas en solución acuosa y demostrar a través del uso de test estándares la detección de proteínas presentes en distintos materiales. • Determinar la concentración proteica de 4 muestras complejas utilizando el método de Bradford Introducción: Las proteínas son compuestos biológicos constituídos principalmente por αaminoácidos (aa) unidos linealmente por enlaces peptídicos. Las proteínas conocidas están formadas por una combinación de 20 aminoácidos unidos en una secuencia determinada, propia de cada proteína (estructura primaria). Una de las propiedades más características de los aminoácidos es su naturaleza anfótera. En soluciones acuosas pueden encontrarse como iones bipolares o zwiteriones, los cuales en presencia de ácidos se comportan como bases y toman protones mientras que en presencia de bases se comportan como ácidos cediendo protones.

El trabajo práctico contará de dos partes: 1.- Reacciones de precipitación y reconocimientos de proteínas. 2.- Cuantificación proteínas según el método de Bradford. 1.- REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS. Las moléculas proteicas pueden reaccionar unas con otras, también con iones de carga opuesta y con agua por ser ésta un dipolo, ya que una proteína tiene muchos grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente (dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto, interacción proteínaproteína, proteína-H2O, proteína-ión. Si la interacción proteína-proteína es grande y la interacción proteína- H2O es pequeña, la proteína será insoluble. Si la interacción proteína - H2O es alta, entonces la proteína tenderá a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condición que aumente la interacción proteína-proteína o disminuya la interacción proteína- H2O disminuye la solubilidad de las proteínas (le quita la capa de solvatación).

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uno conteniendo la muestra y el otro H2O. Observar y registrar el resultado.Efecto de sales: A 2 tubos. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. Mezclar bien y colocar en baño de hielo. Las sales comúnmente usadas son HgCl2 ó ZnCl2. 2 . los cuales forman con las proteínas sales insolubles.H2O porque le quita la capa de solvatación. agregar gota a gota solución de HgCl2 1%. pérdida de la actividad específica. predominará la interacción proteína-proteína y se producirá la precipitación.Efecto del calor: A 2 tubos.5 ml de la muestra en 4 tubos y igual volumen de H2O en los restantes. Conjunto de alteraciones que se las conoce como desnaturalización. disminuye la interacción proteína. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para cualquier proteina. colocar 1... entonces un exceso de agua. por combinación del ión metálico con la forma aniónica de la proteína. por encima del punto de precipitación. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. agregar el mismo volumen de la solución saturada de (NH4)2SO4. 4. PARTE PRÁCTICA: A) Reactivos: Solución de TCA al 5% (v/v en H2O) Solución saturada de (NH4)2SO4 (o la sal) Solución de HgCl2 (1% p/v en H2O) B) Técnica: 1.. clorhídrico.Precipitación por salado: grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a una solución de proteínas.. 2. • Efecto del calor: el calentamiento de las proteínas en soluciones neutras produce alteraciones en sus propiedades. calentar CUIDADOSAMENTE a la llama del mechero. perclórico. a causa de su gran solubilidad. Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin. tales como disminución de la solubilidad. • • Formación de sales: Efecto de metales pesados: las proteínas son precipitadas de sus soluciones por sales de metales pesados. Observar y registrar el resultado. Efecto de los ácidos: las proteínas pueden precipitarse de la solución acuosa por la adición de ciertos ácidos tales como tricloroacético (TCA). Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O. pérdida de sus características de cristalización. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Cómo explica lo ocurrido? 3.Efecto de metales pesados: A 2 tubos.En una serie de 8 tubos de ensayo. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas. las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas. permite solubilizar nuevamente las proteínas.

la forma estable del colorante es la doblemente protonada que absorbe a 465 nm. y se usan de acuerdo a la necesidad del experimentador. A) Reactivos: 3 . Esto conlleva a la preparación de numerosos blancos de reacción para descartar dichas interferencias. la relación entre la aparición de color y concentración de proteínas dependerá también de la composición aminoacídica de la proteína en estudio. Esta técnica se basa en la absorción intrínseca de los residuos aromáticos que forman parte de la proteína y por ello para cada proteína se debe conocer su coeficiente de extinción molar (ε) ya que éste varía de acuerdo a la composición de aminoácidos.. Además existen 2 métodos basados en la formación de complejos con cobre: i) método de Lowry y ii) método de Ácido Bicinconínico.CUANTIFICACIÓN PROTEÍNAS SEGÚN EL MÉTODO DE BRADFORD. La desventaja que presenta es que la relación color/concentración en lineal en un pequeño rango (1 – 25 µg/mL). La cuantificación de proteínas de manera exacta. Esto se debe a que la mayor parte de los datos experimentales son normalizados por la cantidad de proteínas presentes en la muestra analizada. agentes reductores y detergentes. pero de los métodos mencionados el más empleado es el de Bradford por su rapidez y simplicidad y es el que se desarrollará en el TP. Todos ellos se mantienen vigentes. agregar gota a gota solución de ácido TCA al 5%. buffers.5. Ambos ensayos además presentan interferencias con diversas sustancias que suelen estar presentes en muestras biológicas como lípidos. y los compuestos coloreados resultantes son bastante inestables. y se debe disponer de cubetas de cuarzo. Se han desarrollado varios métodos espectroscópicos para la cuantificación de proteínas. Por esto. Bajo condiciones fuertemente ácidas. incubaciones muy precisas a temperaturas elevadas. Por último. el método de Bradford es el más empleado para la determinación de proteínas en una muestra compleja. La interacción proteína-colorante es estabilizada por interacciones iónicas y sobre todo por interacciones hidrofóbicas. Aunque este método es muy exacto y muy simple. Ambos métodos se basan en la reducción del Cu2+ a Cu1+ por parte de las amidas.Efecto de ácidos: A 2 tubos. solo puede ser empleado para proteínas puras de (ε) conocido. Como se puede deducir. de color azul que absorbe a 595 nm. 2. Este ensayo se basa en el corrimiento del máximo de absorción del colorante Azul de Coomasie G-250 desde 465 nm a 595 nm cuando esta unido a proteínas. confiable y reproducible es una de las cuestiones experimentales mas frecuente en un laboratorio bioquímico. Mientras que al unirse a proteínas la forma estable es la desprotonada. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. en soluciones libres de sustancias interferentes en la absorción en UV.. El más simple de estos métodos es la medición de la absorbancia intrínseca de una proteína en solución en la región UV (280 nm). Esto los hace métodos bastante precisos pero requieren de la preparación de varios reactivos que deben ser cuidadosamente mezclados durante el ensayo. no existe un método ideal o de referencia.

Determinar la concentración de proteínas en la muestra problema utilizando la curva elaborada anteriormente. B) Técnica: • Cada grupo realizará una curva de calibrado de albúmina en las concentraciones finales indicadas en la tabla.Agregar 1 mL del reactivo de Bradford y agitar en vortex. agregar 20 ml de Acido fosfórico y diluir a 200 ml con H2O. T10.Rotular 10 tubos eppendorf como B. 7.Leer absorbancia a 595 nm.Colocar en cada tubo la cantidad de H2O y solución Standard de albúmina según se indica en la tabla. P4.Solucion estándar de albúmina sérica bovina: Se utilizará una solución madre de 100 µg/mL con la cual se realizará la curva de calibrado del método. 3. P1. T6. • Reactivo de Bradford: Disolver 20 mg de Coomasie G en 10 ml de etanol. 6-Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrón en función de la concentración de los mismos. T8. 4. P2. Filtrar y conservar a 4 °C a resguardo de la luz en frasco color caramelo. P3. T2. y tendrá una solución problema a la cual determinar la concentración a partir de la curva de calibrado construída. Los datos de estas muestras serán empleados en el TP siguiente.Incubar 5 minutos (y no más de 15) a temperatura ambiente. 5. 2. T4. 1. Tubo B T2 (2 µg) T4 (4 µg) T6 (6 µg) T8 (8 µg) T10 (10 µg) P1 (Problema) P2 (Problema) P3 (Problema) P4 (Problema) Standard BSA 0 µL 20 µL 40 µL 60 µL 80 µL 100 µL 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL H2O 100 µL 80 µL 60 µL 40 µL 20 µL 0 µL 90 µL 90 µL 90 µL 90 µL Muestra 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL DO DO corregida 4 .

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