Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008. Trabajo Práctico Nro.

6: PROTEINAS Objetivos: • Demostrar el efecto de metales pesados, sales, ácidos fuertes, y calor sobre la estabilidad de las proteínas en solución acuosa y demostrar a través del uso de test estándares la detección de proteínas presentes en distintos materiales. • Determinar la concentración proteica de 4 muestras complejas utilizando el método de Bradford Introducción: Las proteínas son compuestos biológicos constituídos principalmente por αaminoácidos (aa) unidos linealmente por enlaces peptídicos. Las proteínas conocidas están formadas por una combinación de 20 aminoácidos unidos en una secuencia determinada, propia de cada proteína (estructura primaria). Una de las propiedades más características de los aminoácidos es su naturaleza anfótera. En soluciones acuosas pueden encontrarse como iones bipolares o zwiteriones, los cuales en presencia de ácidos se comportan como bases y toman protones mientras que en presencia de bases se comportan como ácidos cediendo protones.

El trabajo práctico contará de dos partes: 1.- Reacciones de precipitación y reconocimientos de proteínas. 2.- Cuantificación proteínas según el método de Bradford. 1.- REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS. Las moléculas proteicas pueden reaccionar unas con otras, también con iones de carga opuesta y con agua por ser ésta un dipolo, ya que una proteína tiene muchos grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente (dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto, interacción proteínaproteína, proteína-H2O, proteína-ión. Si la interacción proteína-proteína es grande y la interacción proteína- H2O es pequeña, la proteína será insoluble. Si la interacción proteína - H2O es alta, entonces la proteína tenderá a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condición que aumente la interacción proteína-proteína o disminuya la interacción proteína- H2O disminuye la solubilidad de las proteínas (le quita la capa de solvatación).

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clorhídrico. disminuye la interacción proteína. tales como disminución de la solubilidad. Cómo explica lo ocurrido? 3.H2O porque le quita la capa de solvatación. las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas. Observar y registrar el resultado. Conjunto de alteraciones que se las conoce como desnaturalización. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. colocar 1. PARTE PRÁCTICA: A) Reactivos: Solución de TCA al 5% (v/v en H2O) Solución saturada de (NH4)2SO4 (o la sal) Solución de HgCl2 (1% p/v en H2O) B) Técnica: 1.. agregar gota a gota solución de HgCl2 1%.Efecto de sales: A 2 tubos. entonces un exceso de agua. Observar y registrar el resultado.. los cuales forman con las proteínas sales insolubles. calentar CUIDADOSAMENTE a la llama del mechero. pérdida de sus características de cristalización. Efecto de los ácidos: las proteínas pueden precipitarse de la solución acuosa por la adición de ciertos ácidos tales como tricloroacético (TCA). perclórico. 2 . uno conteniendo la muestra y el otro H2O. 4. Las sales comúnmente usadas son HgCl2 ó ZnCl2. Mezclar bien y colocar en baño de hielo. permite solubilizar nuevamente las proteínas. pérdida de la actividad específica. Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin. agregar el mismo volumen de la solución saturada de (NH4)2SO4. Observar y registrar el resultado. • • Formación de sales: Efecto de metales pesados: las proteínas son precipitadas de sus soluciones por sales de metales pesados. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para cualquier proteina. predominará la interacción proteína-proteína y se producirá la precipitación. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. 2.Efecto de metales pesados: A 2 tubos. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. a causa de su gran solubilidad. • Efecto del calor: el calentamiento de las proteínas en soluciones neutras produce alteraciones en sus propiedades. por encima del punto de precipitación.. Luego agregar 5 ml de H2O.Precipitación por salado: grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a una solución de proteínas.5 ml de la muestra en 4 tubos y igual volumen de H2O en los restantes.. por combinación del ión metálico con la forma aniónica de la proteína.Efecto del calor: A 2 tubos. lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas.En una serie de 8 tubos de ensayo.

Como se puede deducir. A) Reactivos: 3 . Esta técnica se basa en la absorción intrínseca de los residuos aromáticos que forman parte de la proteína y por ello para cada proteína se debe conocer su coeficiente de extinción molar (ε) ya que éste varía de acuerdo a la composición de aminoácidos. y se debe disponer de cubetas de cuarzo. la relación entre la aparición de color y concentración de proteínas dependerá también de la composición aminoacídica de la proteína en estudio. y los compuestos coloreados resultantes son bastante inestables. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. Todos ellos se mantienen vigentes. solo puede ser empleado para proteínas puras de (ε) conocido. La interacción proteína-colorante es estabilizada por interacciones iónicas y sobre todo por interacciones hidrofóbicas. y se usan de acuerdo a la necesidad del experimentador. Por esto. no existe un método ideal o de referencia. Este ensayo se basa en el corrimiento del máximo de absorción del colorante Azul de Coomasie G-250 desde 465 nm a 595 nm cuando esta unido a proteínas. Se han desarrollado varios métodos espectroscópicos para la cuantificación de proteínas. La desventaja que presenta es que la relación color/concentración en lineal en un pequeño rango (1 – 25 µg/mL). en soluciones libres de sustancias interferentes en la absorción en UV. Aunque este método es muy exacto y muy simple. Por último. Bajo condiciones fuertemente ácidas. agregar gota a gota solución de ácido TCA al 5%. Esto conlleva a la preparación de numerosos blancos de reacción para descartar dichas interferencias.CUANTIFICACIÓN PROTEÍNAS SEGÚN EL MÉTODO DE BRADFORD. Mientras que al unirse a proteínas la forma estable es la desprotonada. Además existen 2 métodos basados en la formación de complejos con cobre: i) método de Lowry y ii) método de Ácido Bicinconínico.5. 2. de color azul que absorbe a 595 nm.. Ambos métodos se basan en la reducción del Cu2+ a Cu1+ por parte de las amidas. Ambos ensayos además presentan interferencias con diversas sustancias que suelen estar presentes en muestras biológicas como lípidos. el método de Bradford es el más empleado para la determinación de proteínas en una muestra compleja. Esto se debe a que la mayor parte de los datos experimentales son normalizados por la cantidad de proteínas presentes en la muestra analizada. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. Esto los hace métodos bastante precisos pero requieren de la preparación de varios reactivos que deben ser cuidadosamente mezclados durante el ensayo. la forma estable del colorante es la doblemente protonada que absorbe a 465 nm. agentes reductores y detergentes. El más simple de estos métodos es la medición de la absorbancia intrínseca de una proteína en solución en la región UV (280 nm)..Efecto de ácidos: A 2 tubos. confiable y reproducible es una de las cuestiones experimentales mas frecuente en un laboratorio bioquímico. incubaciones muy precisas a temperaturas elevadas. La cuantificación de proteínas de manera exacta. Observar y registrar el resultado. pero de los métodos mencionados el más empleado es el de Bradford por su rapidez y simplicidad y es el que se desarrollará en el TP. buffers.

Agregar 1 mL del reactivo de Bradford y agitar en vortex.Leer absorbancia a 595 nm. P3. 5. 3. P1. 2. Los datos de estas muestras serán empleados en el TP siguiente. y tendrá una solución problema a la cual determinar la concentración a partir de la curva de calibrado construída. • Reactivo de Bradford: Disolver 20 mg de Coomasie G en 10 ml de etanol. T10. T8. 6-Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrón en función de la concentración de los mismos.Rotular 10 tubos eppendorf como B. agregar 20 ml de Acido fosfórico y diluir a 200 ml con H2O.Incubar 5 minutos (y no más de 15) a temperatura ambiente. Filtrar y conservar a 4 °C a resguardo de la luz en frasco color caramelo. T4. 4.Colocar en cada tubo la cantidad de H2O y solución Standard de albúmina según se indica en la tabla. 1. 7. Tubo B T2 (2 µg) T4 (4 µg) T6 (6 µg) T8 (8 µg) T10 (10 µg) P1 (Problema) P2 (Problema) P3 (Problema) P4 (Problema) Standard BSA 0 µL 20 µL 40 µL 60 µL 80 µL 100 µL 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL H2O 100 µL 80 µL 60 µL 40 µL 20 µL 0 µL 90 µL 90 µL 90 µL 90 µL Muestra 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL DO DO corregida 4 . T2. P2. B) Técnica: • Cada grupo realizará una curva de calibrado de albúmina en las concentraciones finales indicadas en la tabla.Determinar la concentración de proteínas en la muestra problema utilizando la curva elaborada anteriormente. P4.Solucion estándar de albúmina sérica bovina: Se utilizará una solución madre de 100 µg/mL con la cual se realizará la curva de calibrado del método. T6.