Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008. Trabajo Práctico Nro.

6: PROTEINAS Objetivos: • Demostrar el efecto de metales pesados, sales, ácidos fuertes, y calor sobre la estabilidad de las proteínas en solución acuosa y demostrar a través del uso de test estándares la detección de proteínas presentes en distintos materiales. • Determinar la concentración proteica de 4 muestras complejas utilizando el método de Bradford Introducción: Las proteínas son compuestos biológicos constituídos principalmente por αaminoácidos (aa) unidos linealmente por enlaces peptídicos. Las proteínas conocidas están formadas por una combinación de 20 aminoácidos unidos en una secuencia determinada, propia de cada proteína (estructura primaria). Una de las propiedades más características de los aminoácidos es su naturaleza anfótera. En soluciones acuosas pueden encontrarse como iones bipolares o zwiteriones, los cuales en presencia de ácidos se comportan como bases y toman protones mientras que en presencia de bases se comportan como ácidos cediendo protones.

El trabajo práctico contará de dos partes: 1.- Reacciones de precipitación y reconocimientos de proteínas. 2.- Cuantificación proteínas según el método de Bradford. 1.- REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS. Las moléculas proteicas pueden reaccionar unas con otras, también con iones de carga opuesta y con agua por ser ésta un dipolo, ya que una proteína tiene muchos grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente (dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto, interacción proteínaproteína, proteína-H2O, proteína-ión. Si la interacción proteína-proteína es grande y la interacción proteína- H2O es pequeña, la proteína será insoluble. Si la interacción proteína - H2O es alta, entonces la proteína tenderá a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condición que aumente la interacción proteína-proteína o disminuya la interacción proteína- H2O disminuye la solubilidad de las proteínas (le quita la capa de solvatación).

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Cómo explica lo ocurrido? 3.5 ml de la muestra en 4 tubos y igual volumen de H2O en los restantes. Conjunto de alteraciones que se las conoce como desnaturalización. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. tales como disminución de la solubilidad.En una serie de 8 tubos de ensayo. 2. • • Formación de sales: Efecto de metales pesados: las proteínas son precipitadas de sus soluciones por sales de metales pesados. Mezclar bien y colocar en baño de hielo.H2O porque le quita la capa de solvatación.. PARTE PRÁCTICA: A) Reactivos: Solución de TCA al 5% (v/v en H2O) Solución saturada de (NH4)2SO4 (o la sal) Solución de HgCl2 (1% p/v en H2O) B) Técnica: 1.Precipitación por salado: grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a una solución de proteínas. disminuye la interacción proteína. permite solubilizar nuevamente las proteínas. Efecto de los ácidos: las proteínas pueden precipitarse de la solución acuosa por la adición de ciertos ácidos tales como tricloroacético (TCA). calentar CUIDADOSAMENTE a la llama del mechero. los cuales forman con las proteínas sales insolubles. perclórico. Observar y registrar el resultado. 4. colocar 1. agregar gota a gota solución de HgCl2 1%. Las sales comúnmente usadas son HgCl2 ó ZnCl2.Efecto de sales: A 2 tubos.Efecto de metales pesados: A 2 tubos. clorhídrico. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. Observar y registrar el resultado. • Efecto del calor: el calentamiento de las proteínas en soluciones neutras produce alteraciones en sus propiedades. predominará la interacción proteína-proteína y se producirá la precipitación. por combinación del ión metálico con la forma aniónica de la proteína. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas.. Luego agregar 5 ml de H2O. 2 . Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin. agregar el mismo volumen de la solución saturada de (NH4)2SO4. lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. Observar y registrar el resultado. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. a causa de su gran solubilidad.. pérdida de la actividad específica.Efecto del calor: A 2 tubos. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre.. por encima del punto de precipitación. entonces un exceso de agua. pérdida de sus características de cristalización. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para cualquier proteina. las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas.

Esto conlleva a la preparación de numerosos blancos de reacción para descartar dichas interferencias. Ambos ensayos además presentan interferencias con diversas sustancias que suelen estar presentes en muestras biológicas como lípidos. y los compuestos coloreados resultantes son bastante inestables. Esto los hace métodos bastante precisos pero requieren de la preparación de varios reactivos que deben ser cuidadosamente mezclados durante el ensayo. y se usan de acuerdo a la necesidad del experimentador. no existe un método ideal o de referencia. Observar y registrar el resultado. La cuantificación de proteínas de manera exacta. confiable y reproducible es una de las cuestiones experimentales mas frecuente en un laboratorio bioquímico. Esta técnica se basa en la absorción intrínseca de los residuos aromáticos que forman parte de la proteína y por ello para cada proteína se debe conocer su coeficiente de extinción molar (ε) ya que éste varía de acuerdo a la composición de aminoácidos. de color azul que absorbe a 595 nm. buffers. El más simple de estos métodos es la medición de la absorbancia intrínseca de una proteína en solución en la región UV (280 nm). Aunque este método es muy exacto y muy simple. Bajo condiciones fuertemente ácidas. A) Reactivos: 3 .. en soluciones libres de sustancias interferentes en la absorción en UV. Mientras que al unirse a proteínas la forma estable es la desprotonada. Se han desarrollado varios métodos espectroscópicos para la cuantificación de proteínas. pero de los métodos mencionados el más empleado es el de Bradford por su rapidez y simplicidad y es el que se desarrollará en el TP.Efecto de ácidos: A 2 tubos. Por último. La desventaja que presenta es que la relación color/concentración en lineal en un pequeño rango (1 – 25 µg/mL). Por esto. incubaciones muy precisas a temperaturas elevadas. Todos ellos se mantienen vigentes. solo puede ser empleado para proteínas puras de (ε) conocido. Además existen 2 métodos basados en la formación de complejos con cobre: i) método de Lowry y ii) método de Ácido Bicinconínico. Esto se debe a que la mayor parte de los datos experimentales son normalizados por la cantidad de proteínas presentes en la muestra analizada. agentes reductores y detergentes.. y se debe disponer de cubetas de cuarzo.CUANTIFICACIÓN PROTEÍNAS SEGÚN EL MÉTODO DE BRADFORD. Ambos métodos se basan en la reducción del Cu2+ a Cu1+ por parte de las amidas. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. 2. el método de Bradford es el más empleado para la determinación de proteínas en una muestra compleja. La interacción proteína-colorante es estabilizada por interacciones iónicas y sobre todo por interacciones hidrofóbicas. uno conteniendo la muestra y el otro H2O. la forma estable del colorante es la doblemente protonada que absorbe a 465 nm. Como se puede deducir. Este ensayo se basa en el corrimiento del máximo de absorción del colorante Azul de Coomasie G-250 desde 465 nm a 595 nm cuando esta unido a proteínas. la relación entre la aparición de color y concentración de proteínas dependerá también de la composición aminoacídica de la proteína en estudio. agregar gota a gota solución de ácido TCA al 5%.5.

y tendrá una solución problema a la cual determinar la concentración a partir de la curva de calibrado construída. T4. P3. 5. T2. P2. 6-Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrón en función de la concentración de los mismos. Los datos de estas muestras serán empleados en el TP siguiente. T10.Leer absorbancia a 595 nm. 2. 7. T6. agregar 20 ml de Acido fosfórico y diluir a 200 ml con H2O. T8. P1. B) Técnica: • Cada grupo realizará una curva de calibrado de albúmina en las concentraciones finales indicadas en la tabla. 1. Tubo B T2 (2 µg) T4 (4 µg) T6 (6 µg) T8 (8 µg) T10 (10 µg) P1 (Problema) P2 (Problema) P3 (Problema) P4 (Problema) Standard BSA 0 µL 20 µL 40 µL 60 µL 80 µL 100 µL 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL H2O 100 µL 80 µL 60 µL 40 µL 20 µL 0 µL 90 µL 90 µL 90 µL 90 µL Muestra 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL 0 µL 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL DO DO corregida 4 .Determinar la concentración de proteínas en la muestra problema utilizando la curva elaborada anteriormente.Agregar 1 mL del reactivo de Bradford y agitar en vortex.Incubar 5 minutos (y no más de 15) a temperatura ambiente.Rotular 10 tubos eppendorf como B. Filtrar y conservar a 4 °C a resguardo de la luz en frasco color caramelo.Colocar en cada tubo la cantidad de H2O y solución Standard de albúmina según se indica en la tabla. 4.Solucion estándar de albúmina sérica bovina: Se utilizará una solución madre de 100 µg/mL con la cual se realizará la curva de calibrado del método. P4. • Reactivo de Bradford: Disolver 20 mg de Coomasie G en 10 ml de etanol. 3.

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