Introduccion

La extracción es un proceso en el que dos fases entran en contacto con el objetivo de transferir
un soluto o partícula de una fase a la otra. Para la separación y purificación de productos
biológicos, las fases son líquidos comúnmente inmiscibles, y el soluto está en forma soluble. En
ciertos casos, sin embargo, una fase es líquida y la otra fase es sólida; la extracción de cafeína
de los granos de café es un ejemplo. Aunque la mayoría de las extracciones en biotecnología
implican la transferencia de bioproductos solubles, los orgánulos y las células se han
transferido a veces entre fases. A menudo se usa un disolvente orgánico como líquido de
extracción cuando el soluto a extraer es estable en el disolvente orgánico, siendo ejemplos
típicos los antibióticos de bajo peso molecular. Generalmente no es factible extraer proteínas
con solventes orgánicos, ya que las proteínas a menudo se desnaturalizan o degradan como
resultado del contacto con el solvente orgánico. Las proteínas a menudo se pueden extraer
con éxito por medio de dos fases líquidas inmiscibles que consisten en soluciones de dos
polímeros solubles en agua, pero incompatibles, o un polímero más una alta concentración de
ciertas sales.
La extracción usualmente llega temprano en el proceso de purificación para un bioproducto y
generalmente precedería a un paso de alta resolución como la cromatografía. La extracción a
menudo es ventajosa porque puede provocar una reducción significativa en el volumen y / o
puede separar el producto deseado de las células o desechos celulares. Es deseable reducir el
volumen tan pronto como sea posible en el proceso, ya que los grandes volúmenes
normalmente generan grandes costos.
Las extracciones de interés en la purificación de productos biotecnológicos y farmacéuticos son
principalmente líquidas a líquidas, y este es el énfasis en este capítulo.
Primero se desarrollan las definiciones básicas y los principios de extracción, seguidos de una
explicación de los procedimientos de escalado y diseño para los extractores más comúnmente
usados para bioproductos.

Objetivos instrumentales

Después de completar este capítulo, el lector debería poder hacer lo siguiente:

• Definir y usar constantes clave como el coeficiente de partición, la relación solvente-a-

alimentación y el factor de extracción.

• Explicar los factores que afectan la partición de biomoléculas.

• Construya un diagrama de fases para sistemas acuosos de dos fases y comprenda

sus aplicaciones a la extracción de proteínas.

• Calcular las concentraciones de solutos en la extracción en contracorriente en etapas

múltiples

cascadas.

• Dibuje líneas de equilibrio y operación, y úselas para calcular el equilibrio

etapas en la extracción a contracorriente.

• Realizar cálculos de escala para extractores centrífugos y de placa reciprocante

Principios de extracción

La separación de biomoléculas en la extracción líquido-líquido depende de la partición de las

biomoléculas entre las fases líquidas. El diseño del proceso de extracción depende de la
miscibilidad de las dos fases líquidas entre sí, y de la velocidad de equilibrio de las
biomoléculas entre las dos fases. La extracción acuosa en dos fases es una técnica no
desnaturalizante y no degradante que puede usarse para una serie de biomoléculas tales como
proteínas, virus, células y orgánulos celulares; por lo tanto, se enfatiza el análisis de la partición
en la extracción acuosa en dos fases. Se discuten los enfoques gráficos y analíticos para los
cálculos de la etapa de extracción.

Equilibrio de separación de fases y particionamiento

En un proceso de extracción de una sola etapa, una corriente de alimentación entra en

contacto con una corriente de disolvente de extracción, y la mezcla se divide en fases de
extracto de equilibrio y de refinado, como se muestra esquemáticamente en la figura 6.1. La
distribución de un soluto en equilibrio entre dos fases líquidas se define mediante la partición
o el coeficiente de distribución,

donde y y x son las concentraciones del soluto en las fases de extracto y refinado,
respectivamente. Por lo tanto, para el menor volumen de disolvente de extracción, es
deseable tener K lo más grande posible. Los coeficientes de partición cercanos a la unidad
requerirían grandes volúmenes y muchas extracciones en serie para una recuperación
completa. Los coeficientes de partición cercanos a cero indicar ninguna extracción en absoluto.

El coeficiente de partición puede depender de muchos parámetros, como el tamaño de la

molécula que se extrae, el pH, los tipos de disolvente, la temperatura y la concentración y
peso molecular de los polímeros (o sal) en las fases. La literatura contiene coeficientes de
partición para muchas moléculas biológicas, especialmente aminoácidos y antibióticos, pero se
debe tener precaución si se usan condiciones distintas a las informadas. Un ejemplo del efecto
del pH en el coeficiente de partición se muestra en la Figura 6.2 para el antibiótico penicilina G
y una impureza ácida. Se puede observar que por debajo de pH 4 la extracción de penicilina G
en la fase de disolvente se ve favorecida por la de la impureza ácida CX-1.

Los modelos desarrollados para describir la partición de biomoléculas son útiles, no solo al
extender los datos de partición existentes a nuevas condiciones, sino también al obtener
primeras estimaciones razonables de los coeficientes de partición. Uno de los modelos más
simples para describir la partición entre fases es el desarrollado por Bronsted [1]:

donde M es el peso molecular de la molécula que se divide, k es la constante de Boltzmann, T

es la temperatura absoluta, y λ es una constante (parámetro agrupado) que incluye
características tanto del sistema de fase como de la sustancia de división. Se puede observar
que para la partición de penicilina G (figura 6.2), el modelo de Bronsted corresponde a una
disminución constante de λ a partir de pH 2 a 5.

Los sistemas de extracción acuosa de dos fases se obtienen mediante la combinación de dos
polímeros solubles en agua o un polímero y un sal en agua, por encima de una "concentración
crítica". Estos sistemas se separan en dos fases líquidas inmiscibles, una de ellas enriquecida en
un polímero y la otra enriquecida en el otro polímero o sal. Las separaciones solubles o
particuladas, agregadas al sistema, se dividen entre las dos fases. La extracción acuosa en dos
fases se ha reconocido como una técnica no desnaturalizante y no degradante para la
separación de una serie de entidades biológicas tales como proteínas, enzimas, virus, células y
orgánulos celulares. Este método también ha sido útil para la eliminación de subproductos
contaminantes indeseables tales como ácidos nucleicos y polisacáridos.
Cada sistema acuoso bifásico se puede caracterizar por un diagrama de fase, un ejemplo del
cual se muestra en la Figura 6.3. En concentraciones de poli (etilenglicol) (PEG) y dextrano por
debajo de la curva en la figura 6.3, solo hay una fase líquida. En la curva, hay dos fases líquidas,
y las líneas de unión conectan las composiciones de las fases que están en equilibrio. Como se
observa en la Figura 6.3, la fase enriquecida en PEG puede contener casi ningún dextrano. Los
sistemas más comunes usan dextrano y PEG, o PEG y fosfato de potasio, aunque el dextrano
purificado es costoso y se han utilizado alternativas a él [2]. La fase rica en PEG es menos densa
que la fase rica en dextrano o rica en sal y, por lo tanto, es la fase más ligera o superior. Las
concentraciones típicas de los sistemas de PEG-dextrano son 10% (p / p) de PEG y 15% de
dextrano, o con fases inferiores ricas en sal, 15% de PEG y 15% de sal [3].

En general, para la extracción acuosa en dos fases, los contaminantes tales como las células y
los desechos celulares se dividen en la fase inferior o la interfaz. Para las proteínas, la partición
se ve afectada por muchos parámetros, que se dan en la Tabla 6.1. Estos parámetros son
difíciles de separar y analizar individualmente, lo que significa que una predicción a priori de
los coeficientes de partición es muy difícil.

Se han desarrollado modelos para explicar varios mecanismos de nivel molecular que influyen
en la partición de proteínas en la extracción acuosa en dos fases. Estos modelos se pueden
categorizar en tres tipos: modelos de celosía, expansiones viriales y enfoques termodinámicos
de escalado. Estos modelos tienden a ser complicados, requiriendo la medición independiente
de varios parámetros. Un ejemplo de estos modelos es el modelo virial de expansión
desarrollado por King et al. [4]. Para una solución con dos polímeros que es muy diluida en
proteínas, de manera que la concentración de cualquiera de los polímeros es mucho mayor
que la concentración de proteína, el coeficiente de partición de proteína Kp está dado por

Los coeficientes de virial se pueden medir para cada tipo de polímero y sal por osmometría de
membrana o por dispersión de luz láser de ángulo bajo. Los potenciales eléctricos se pueden
determinar como una función del tipo de sal y la longitud de la línea de unión. Los datos
también son necesarios para la carga superficial de la proteína en función del pH. El uso de
estos métodos dio una buena concordancia entre los coeficientes de partición pronosticados y
medidos experimentalmente para la albúmina, la α-quimotripsina y la lisozima en los sistemas
de PEG-dextrano [4].

La influencia del tamaño de la proteína en la partición de la fase se ha demostrado al

correlacionar el coeficiente de partición con el peso molecular de varias proteínas. Como se
indica en la Figura 6.4, la partición de la proteína en la fase superior se favorece débilmente a
pesos moleculares más bajos, mientras que la partición en la fase inferior se favorece
fuertemente para las proteínas más grandes. Para todos estos datos, el pH de la solución
estaba en el punto isoeléctrico de la proteína (pI) para minimizar cualquier efecto de la carga
de proteína.

Otros factores que pueden tener un gran efecto en la partición de proteínas son el tipo y la
concentración de la sal en el sistema y la carga sobre la proteína. Por ejemplo, la Figura 6.5
muestra que el coeficiente de partición para la ovoalbúmina puede variar ampliamente según
el pH, lo que significa que se trata de un efecto electrostático. Esto se ve respaldado por la
observación de que todas las curvas en la Figura 6.5 se cruzan al pH isoeléctrico de la proteína,
donde hay una carga neta cero en la molécula. También se ve que
el coeficiente de partición se ve muy afectado por la utilización de sales de cloruro o sulfato.
Por lo tanto, el efecto de cualquier cambio en el tipo de sal en un sistema acuoso de dos fases
debe verificarse experimentalmente.

La selectividad de la extracción para la proteína de interés puede potenciarse mediante el

acoplamiento de un ligando bioespecífico a uno de los polímeros. El PEG es un polímero que a
menudo se selecciona para la conjugación porque las técnicas químicas para modificar el PEG
son simples, altamente eficientes y bien conocidas. Al acoplar un ligando bioespecífico a PEG y
usar condiciones que favorezcan la partición de contaminantes en la fase inferior, el
coeficiente de partición de una proteína deseada puede aumentar enormemente. La estrategia
más común es unir el ligando al polímero de PEG por derivatización de los hidroxilos libres en
cada extremo de la cadena del polímero. Los intermedios reactivos se han formado mediante
la conversión del hidroxilo terminal de PEG en haluros, ésteres de sulfonato o derivados de
epóxido, que se acoplan a un ligando para formar un polímero con un sitio de unión a
proteínas en cada extremo [5]. Los ligandos de los colorantes reactivos, incluidos Cibacron
azul, Procion rojo y Procion amarillo, se han utilizado para la separación por afinidad de
muchas proteínas. El tinte funciona como un inhibidor competitivo para el sustrato, la
coenzima o el efector de una variedad de proteínas, a menudo con una afinidad mayor que la
que muestra el competidor.
molécula [6]. La mejora en el coeficiente de partición para tres enzimas cuando el amarillo de
Procion se unió a PEG en el sistema de extracción de dos fases acuosa de PEG-dextrano se
muestra en la Figura 6.6. Después de la unión de la proteína al polímero ligando, es necesario
recuperar la proteína en forma libre. Esto se ha llevado a cabo mediante la adición de sal a la
fase superior, rica en polímero ligando, produciendo dos fases y la consiguiente división de la
proteína en la fase inferior resultante [7]. En otro enfoque, se añadió un efector soluble a un
nuevo sistema de dos fases para competir con el ligando unido por el sitio de unión de la
proteína, lo que provoca que la proteína se libere del polímero ligando y cambie a la fase
inferior [8].

Cálculos de etapas contracorriente

Para lograr una recuperación de alto bioproducto en la extracción, con frecuencia es necesario
utilizar más de una etapa de extracción. Los procesos de extracción generalmente se
establecen cuando el solvente de extracción y la alimentación corren en contracorriente. El
flujo de corriente alterna es preferible al flujo en paralelo porque la concentración de soluto la
diferencia entre las fases de refinado y extracción, la fuerza motriz del proceso, es mayor en el
caso de contracorriente. La extracción de corriente alterna se analiza gráfica y analíticamente
para el equilibrio en cada etapa de contacto. Este análisis es útil para determinar el equilibrio
entre el número de etapas y la relación del caudal de disolvente de extracción con el caudal de
alimentación. Este análisis también se puede usar para determinar la eficiencia de extracción
de plantas piloto y extractores de básculas vegetales.
Una cascada de extracción en contracorriente se muestra esquemáticamente en la Figura 6.7
para n etapas, cada una como la que se muestra en la Figura 6.1. Las corrientes que salen de
cada etapa están en equilibrio y se numeran según la etapa que están dejando.
La alimentación entra en la etapa 1 y se va en la etapa n, mientras que el solvente de
extracción fluye en la dirección opuesta. Una vez que la alimentación ha ingresado en la
cascada, se denomina "refinado". Para estos cálculos, hacemos tres suposiciones clave:
1. Los dos solventes son inmiscibles o ya están en equilibrio de fase (es decir, no
disolvente o polímero se intercambia entre las fases).
2. Las concentraciones de soluto son lo suficientemente bajas como para que las velocidades
de flujo del refinado
y extracto son constantes.
3. El equilibrio se logra en cada etapa.
La primera suposición depende de los solventes que se elijan. Habitualmente, el disolvente de
extracción se selecciona para minimizar su solubilidad en el refinado; de lo contrario, la
pérdida de disolvente de extracción en el refinado puede ser tan grande que debe recuperarse
para que el proceso sea económicamente viable. La segunda suposición generalmente es
válida para la extracción de bioproductos. Las concentraciones de bioproductos en caldos de
fermentación son típicamente menores a 10 g / litro (o 1%) y a menudo son menores a 1 g /
litro (0.1%), lo que significa que el error causado por la segunda suposición es generalmente
menor que el error en el ensayo del bioproducto Si las desviaciones de la segunda suposición
llegan a ser significativas, entonces F y S deberían ser las velocidades de flujo del disolvente
puro y las concentraciones deberían ser proporciones de soluto a disolvente puro. Un balance
de material en el soluto alrededor del extremo de alimentación de la cascada hasta la etapa n -
1 es

donde F es la velocidad de flujo de la alimentación o la fase de refinado, S es la velocidad de

flujo de la fase de extracción, y las concentraciones se definen como en la Figura 6.7. Esta

ecuación se puede escribir en términos de yn como:

De la ecuación (6.2.5) se ve que yn y xn-1 son concentraciones de corrientes de paso en una
línea de pendiente F / S, que se denomina línea de operación. El cálculo del número de etapas
requeridas para reducir la concentración de soluto en la corriente de alimentación a xn se
puede llevar a cabo gráficamente en un diagrama tipo McCabe-Thiele con trazado contra x
como se muestra en la figura 6.8. La línea operativa en cascada de la pendiente F / S corta el
eje x en el punto (xn, ys). En el punto de dibujo (xn, ys), se supone aquí que ys = 0 (dado que el
disolvente de extracción generalmente no contiene soluto). La curva de equilibrio, no
necesariamente una línea recta [es decir, el coeficiente de partición, definido por la ecuación
(6.2.1), puede no ser constante para el rango de concentraciones que se aplican], se origina en
x = y = 0. El paso de las etapas de equilibrio comienza en la línea operativa donde entra la
alimentación y el extracto sale de la cascada (xf, y1). Las concentraciones x1 e y1 están en
equilibrio y, por lo tanto, están en la curva de equilibrio. Una etapa de equilibrio se representa
gráficamente como la línea horizontal tomada desde (xf, y1) que interseca la curva de
equilibrio en (x1, y1); se dibuja una línea vertical desde (x1, y1) que interseca la línea de
operación en (x1, y2). Este procedimiento continúa hasta que se alcanza ys.
Para las soluciones isotérmicas diluidas, el coeficiente de partición K es a menudo constante.
Para esta situación, se puede desarrollar una solución analítica para la concentración de soluto
en el refinado en función de la concentración en la alimentación y otras variables del proceso.
Es conveniente definir un factor de extracción E como la pendiente de la línea de equilibrio
dividida por la pendiente de la línea de operación:

Un balance de material en el soluto para la enésima etapa, suponiendo que no hay soluto en el
disolvente de extracción entrante (ys = 0), da

Usar las definiciones de K y E lleva a

Un balance de material en el soluto para la (n - 1) etapa resulta en

Continuando con este procedimiento hasta la etapa 1 da

que es matemáticamente equivalente a

Esta ecuación se puede reorganizar para dar la forma más comúnmente utilizada
A medida que el número de etapas se vuelve grande (n → ∞), vemos a partir de la ecuación
(6.2.11) que

que sabemos por intuición: podemos extraer casi todo el soluto con un gran número de
etapas.
Para el caso especial del factor de extracción E = 1.0, podemos ver a partir de la ecuación
(6.2.10) que

Para valores de E <1.0 y un gran número de etapas de extracción (n → ∞), de la Ecuación

(6.2.12) se desprende que