Lab2 Precipitación Final

TABAJO PRÁCTICO N°2:
PRECIPITACIÓN
Integrantes: Francisco Fernández V

Darío González V.
Josefa Villablanca L.
Paulo Yévenes M.
Profesor: Víctor Zambrano Ibarra
Fecha experiencia: 23 de Octubre, 2023
Fecha entrega: 13 de Noviembre, 2023
Ayudantes: Bárbara González
Fernanda Méndez
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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
Av. Libertador Bernardo O´Higgins nº3363 - Estación Central - Santiago –
Chile
RESUMEN
En el presente se investigó y analizo la precipitación de la proteína BSA mediante la
utilización de sulfato de amonio. En este documento se incluyen además los gramos de
sulfato amónico necesarios para conseguir diferentes porcentajes de saturación y las
correspondientes medidas de absorbancia a 595 nm a diferentes cortes. Se utilizó una
ecuación de curva de calibración para determinar la concentración de BSA. Con el cual se
concluye que la precipitación de proteínas con sulfato de amonio se produce debido a una
disminución en la solubilidad de las proteínas provocada por la interacción con la sal. Estos
hallazgos proporcionan información valiosa sobre la eficacia de la precipitación de proteínas
y el impacto que la concentración de sulfato de amonio tiene en la solubilidad de las
proteínas.
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INDICE
1. OBJETIVOS.................................................................................................................... 4
2. INTRODUCCIÓN........................................................................................................... 5
3. METODOLOGÍA............................................................................................................ 8
4. DATOS............................................................................................................................ 9
5. RESULTADO Y DISCUSIONES ................................................................................ 10
6. CONCLUSIONES......................................................................................................... 12
7. REFERENCIAS ............................................................................................................ 13
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1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general:
Comprender el proceso precipitación mediante el uso de sales cosmotrópicas.
1.2 Objetivos específicos:
Determinar el porcentaje de saturación de sal para la precipitación de la albúmina de suero
bovino.
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2. INTRODUCCIÓN
La precipitación es un método tradicionalmente usado para la separación de proteínas y
ácidos nucleicos, este método utiliza la existencia de diferentes solubilidades que presentan
las macromoléculas en una solución
Los procesos de precipitación incorporan una conversión selectiva de uno o más solutos
específicos u objetivos presentes en la solución a una forma insoluble o “precipitado”, esto
es debido a la adición de algún “agente precipitante” o a los cambios fisicoquímicos que se
le apliquen a la solución de interés (Tejada, A. 2011).
El precipitado de la solución después puede ser separad aplicando un método de separación
sólido-líquido adecuado al proceso, como por ejemplo centrifugación.
La solubilidad de una proteína en una solución depende de las interacciones proteína-solvente
que existan, donde estas permiten a la proteína mantenerse en la solución, y también de las
interacciones que se generen entre proteína-proteína, donde estas últimas producen la
precipitación (Tejada, A. 2011).
En general las proteínas son solubles en medio acuoso debido a que en su estructura contienen
aminoácidos hidrofílicos que están expuestos hacia la superficie de la proteína, interactuando
con las moléculas de agua presentes en el entorno, formando una capa de solvatación.
La solubilidad de las proteínas se ve afectada ante una interacción de cualquier compuesto
sobre las interacciones proteína-solvente, donde a medida que estas decrecen, aumentan las
interacciones proteína-proteína, haciéndose mucho más importantes estas últimas, ya que la
proteína se agrega y precipita en la solución (Tejada, A. 2011).
Una proteína será insoluble, si es que las interacciones proteína-proteína son mayores a las
que se generen entre proteína-solvente.
Entre las estrategias que existen para precipitar macromoléculas se encuentran los cambios
de pH, la disminución de temperatura, la adición de solventes orgánicos como etanol o
acetona, la adición de sales cosmotrópicas (como el sulfato de amonio) o caotrópicas (como
la urea). Por último, se encuentra la adición de reactivos bio-específicos
(inmunoprecipitación).
La precipitación con sales cosmotrópicas es un método de precipitación, regida por la
ecuación (1).
𝜇𝑝𝑝𝑡 = 𝜇𝑙𝑖𝑞 (1)
Donde 𝜇𝑝𝑝𝑡 corresponde al potencial químico del soluto precipitado y 𝜇𝑙𝑖𝑞 al potencial
químico del soluto disuelto.
Por otra parte, el potencial químico del soluto disuelto depende de su concentración, y está
dado por la ecuación (2):
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𝜇𝑙𝑖𝑞 = 𝜇0𝑙𝑖𝑞 + 𝑅 ∙ 𝑇 ∙ ln⁡(𝑥) (2)
Donde 𝜇0𝑙𝑖𝑞 corresponde al potencial químico del soluto en el estado de referencia estándar y
x es la concentración del soluto en fracción molar.
Las sales cosmotrópicas como el sulfato de amonio, realizan una exposición de los parches
hidrofóbicos de las proteínas, haciendo una remoción de la capa estructurada de la molécula
de agua que cubren usualmente estos parches en una solución, donde como consecuencia se
obtiene que los residuos hidrofóbicos de muchas proteínas interactúen, llevando a la
agregación y formación de precipitado.
Las sales son capaces de reducir la solubilidad de las proteínas enmascarando grupos
cargados, que hacen que las proteínas se mantengan separadas en una solución, es decir,
cuando estas son enmascaradas las moléculas pueden interactuar fácilmente, formando
agregados y eventualmente precipitado. Pero la solubilidad de diferentes proteínas es
reducida en diferente medida a medida que se adiciona sal, donde a partir de este
comportamiento, la separación de proteína es posible.
Para la precipitación con sulfato de amonio en específico se pueden abordar dos enfoques
operacionales distintos:
1. Adición directa de cristales de sulfato de amonio sólido a la solución de proteínas.
2. Adición de una solución saturada de sulfato de amonio a la solución de proteínas.
El primer enfoque es el más utilizado a pequeña escala, pero una de sus desventajas es que
se produce una distribución heterogénea de concentración de sal en la solución proteica,
debido al proceso de disolución que ocurre por parte del sulfato de amonio, llevando a zonas
con mayor concentración de sal, desencadenando una precipitación desigual de proteínas.
Por lo cual se recomienda la adición lenta de sulfato de amonio, manteniendo una agitación
constante durante el proceso. Por otra parte, en los procesos de precipitación a gran escala se
prefiere el segundo enfoque.
En la precipitación con sulfato de amonio se deben determinar la cantidad de sal que se debe
agregar para alcanzar cada porcentaje de saturación, estas se pueden obtener mediante el uso
de la ecuación (3) o a partir de la Tabla 2.1 (Quesada, S. 2007).
515 ∙ (𝑋 − 𝑋𝑜) (3)
𝑔=
100 − 0.27 ∙ 𝑋
Donde:
- g: Corresponde a los gramos de sulfato de amonio que se deben agregar a 1L de
solución de proteínas a 0°C.
- X: Porcentaje de saturación que se desea alcanzar.
- Xo: Porcentaje de saturación inicial en la solución de proteínas.
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Tabla 2.1: Cálculo de cortes con sulfato de amonio a 0°C.
Tabla 2.1: Cálculo de cortes con sulfato de amonio a 0°C (continuación).
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3. METODOLOGÍA
Para la realización del trabajo practico de precipitación se siguió el siguiente protocolo:
- En primer lugar, se preparó una solución de 100 ml de solución proteica de BSA
(1mg/ml) en 500 ml de disolución con Buffer Tris HCl (mM) pH8
- Se vertió 100 mL de esta disolución proteica de BSA fría en un vaso precipitado,
luego se colocó este vaso precipitado en un baño de agua-hielo sobre una placa
agitadora magnética (Hot plate stirrer, Daihan Labtech). Con una micropipeta se tomó
una muestra de la solución antes de agregar la sal para cuantificar la proteína inicial
- Se activó el agitador magnético suavemente, y se agregó gradualmente por
aproximadamente 2 a 3 minutos, 5,3 [g] de sulfato de amonio necesaria para el primer
corte de 10% de saturación.
- Se continúo agitando la solución por aproximadamente 10 minutos, hasta que se
observó la disolución completa de la sal.
- Se tomó una muestra de 0,5 mL con la cual se cuantificó la concentración proteína en
el sobrenadante
- Se maso (Winkler, modelo Revel) la cantidad necesaria de sulfato de amonio para el
siguiente porcentaje de saturación y se repitieron los últimos pasos, hasta completar
6 muestras
- Cada una de las muestras se centrifugaron (Heatrow Scientific, modelo Sprout) por 5
minutos, y se recuperó el sobrenadante, para luego medir la absorbancia a 595 nm,
cada muestra se midió por duplicado mediante el método de Bradford.
- Para el método de Bradford, se disolvió 25 uL de la muestra inicial con 25uL de agua
y luego se adicionaron y homogenizaron 1000 uL de reactivo Coomassie Billan Blue.
- Se posicionaron las muestras en un lugar oscuro y se esperó aproximadamente 3
minutos para que la reacción se llevara a cabo
- Se midió la absorbancia a 595 nm (Thermo Scientific, modelo UV-Vis Genesys 10S),
para obtener una gráfica de concentración de BSA versus porcentaje de corte
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4. DATOS
Tabla 4.1: Gramos de sulfato de amonio necesarios para alcanzar el respectivo porcentaje
de saturación.
Saturación [%] Sulfato de amonio Masa Real
[g] Agregada [g]
10 5.30 5.3327
25 8.49 8.4916
45 12.48 12.4814
65 14.07 14.1103
85 16.00 16.0235
100 13.51 13.5258
Tabla 4.2: Absorbancias a 595 nm medidas por duplicado para cada uno de los % de corte.
% Corte Absorbancia 595 [nm]
0 0,664 0,759
10 0,580 0,568
25 0,551 0,606
45 0,560 0,538
65 0,546 0,559
85 0,152 0,151
100 0,449 0,619
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5. RESULTADO Y DISCUSIONES
Para cumplir el objetivo del practico, el cuál era determinar en qué porcentaje de corte de
sulfato de amonio se lograba la precipitación de la proteína BSA, se necesitaba una ecuación
de la recta de una curva de calibración de concentración de BSA a distintas concentraciones.
Para esto se ocuparon los datos de la curva de calibración del práctico anterior. Gracias a la
ecuación de la recta de la tabla 5.1 se pudo obtener los valores de concentración de proteína
de BSA a distintos porcentajes de saturación.
Tabla 5.1 Ecuación de la recta de la curva de calibración de concentración de BSA
Ecuación de la
Recta Y= 1,2999x + 0,218
R² 0,986
Concentración de BSA a Absorbancia

Promedio(mg/ml) por el factor de dilución
0,900
0,800
Concentración de BSA (mg/ml)
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
Corte a Corte 1 Corte 2 Corte 3 Corte 4 Corte 5 Corte 6
-0,100
tiempo 0 (10%) (25%) (45%) (65%) (80%) (100%)
Porcentaje de Corte de Sulfato de Amonio
Figura 5.1 Gráfico de Barra de Concentración de BSA a distintos cortes de sulfato de amonio
La precipitación de proteínas con sulfato de amonio ocurre debido a que la BSA (y las demás
proteínas) al interaccionar con la sal se provoca una disminución de la solubilidad de las
proteínas, esto ocurre debido a diversos factores cómo se explicó anteriormente Estos
factores son principalmente el aumento de la concentración de sal en la solución, ya que este
aumento provoca una mayor cantidad de iones que compiten por las moléculas de agua
provocando que las moléculas de H2O que estaban alrededor de las proteínas (en la región
hidrofílica de la BSA) se desplacen (debido a la formación de puentes de hidrógeno entre las
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moléculas de H2O y la sal) provocando una disminución en la solubilidad de la BSA (Allen,
2004), además de que este aumento de concentración de sal provoca cambios estructurales
en la BSA, ya que la BSA al ser una proteína globular (esto significa que tiene una región
hidrofóbica en el interior y una región hidrofílica en la superficie) (Tromelin et al., 2006), su
región hidrofóbica es más propensa a aumentar las interacciones hidrofóbicas provocadas
por el sulfato de amonio debido a las sales pueden competir con el agua por las interacciones
con las regiones hidrofóbicas de la proteína (Allen, 2004). Además de que la presencia del
buffer Tris provoca que la BSA mantenga una carga neta negativa (debido a que su punto
isoeléctrico es 4.7-5.4 (Zydney, 1998)) y contribuyendo a mantener un pH constante
(Gomori, 1955).
Cómo se puede observar en la figura 5.1, el porcentaje de corte en el cual se logra una
precipitación de la proteína BSA se encuentre entre el 65% y 80% de porcentaje de
saturación. Según la literatura a una mayor concentración de sal se produce una mayor
efectividad en la precipitación, por lo que no es anómalo que el corte de sulfato de amonio
se encuentre en este rango. Lo anormal sería que el corte se haya producido antes del 50%
de saturación para el volumen de solución. Otro evento que se pudo observar fue un leve
aumento en la concentración de BSA en el sobre nadante en los primeros cortes de sulfato de
amonio (bajas concentraciones), esto se le conoce como el efecto salting-in que es cuando la
proteína a bajas concentraciones aumenta su solubilidad hasta llega al punto de salting-out
que es cuando la solución tiene demasiada concentración de sal que la proteína pierde
solubilidad y comienza a precipitar (Garrido Pertierra & Teijón Rivera, 2006).
Lo que se logra apreciar en el corte 6, no es un aumento súbito en la concentración de proteína
en el sobrenadante, si no que es la interferencia provocada por las grandes cantidades que se
agregaron de la sal sulfato de amonio, su concentración en la solución es tan alta que
comenzaron a provocar un aumento en los valores de absorbancia, además de las partículas
en suspensión y los agregados proteicos. Ya que estos materiales particulados producen
interferencias en la dispersión de la luz provocando una disminución en la transmisión de la
luz y por consiguiente un aparente aumento en la absorbancia (Harris et al., 1987).
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6. CONCLUSIONES
A partir de lo recopilado sobre la precipitación de la proteína BSA con sulfato de amonio se
puede concluir que la precipitación de proteínas con sulfato amónico se produce debido a la
disminución de la solubilidad de las proteínas provocada por la interacción con la sal. Este
aumento de la concentración de sal provoca una disminución de la solubilidad debido al
desplazamiento de las moléculas de agua alrededor de la proteína y a la formación de enlaces
de hidrógeno entre las moléculas de agua y la sal.
Por otro lado, la presencia del tampón Tris ayuda a mantener un pH constante y una carga
neta negativa en la proteína BSA, contribuyendo a los resultados experimentales. La gráfica
de concentración de BSA versus el porcentaje de sulfato de amonio indica que la
precipitación de la proteína BSA se produce entre el 65% y el 80% de saturación.
Finalmente se puede concluir que los objetivos planteados fueron cumplidos entendiendo el
proceso de precipitación mediante el uso de sales cosmotrópicas y el impacto que la
concentración de sulfato de amonio genera en la solubilidad de las proteínas. Además de
determinar el porcentaje de corte necesario para la precipitación de la gran parte de la BSA
El análisis detallado y la metodología experimental presentados contribuyen a una
comprensión más profunda de la interacción entre el sulfato de amonio y la proteína BSA.
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7. REFERENCIAS
Garrido Pertierra, A., & Teijón Rivera, J. (2006). Fundamentos de bioquímica estructural. 2°
Edición. Madrid: Tébar
Gomori, G., Preparation of buffers for use in enzyme studies. Methods Enzymology (1955)
Harris, D. A., Bashford, C. L., & Harris, D. A. (1987). Spectrophotometry &
spectrofluorimetry: A Practical Approach. Oxford University Press, USA.
Quesada, S. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Costa Rica:
Universidad Estatal a Distancia
Tejeda, A. Montesinos, R.M. Guzmán, R. (2011). “Bioseparación”. 2° Edición. Editorial
Pearson. Capítulo 9.
Tromelin, A., Andriot, I., & Guichard, É. (2006). Protein–flavour interactions. En Elsevier
eBooks (pp. 172-207). https://doi.org/10.1533/9781845691400.2.172
Zydney, A.L., Protein separations using membrane filtration: new opportunities for whey
fractionation, Int. Dairy J., 8 (1998) 243.
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Integrantes: Francisco Fernández V

Tabla 2.1: Cálculo de cortes con sulfato de amonio a 0°C (continuación).

Concentración de BSA a Absorbancia

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