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PRÁCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

I. OBJETIVOS

- Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse.

- Saber llevar a cabo los diferentes métodos de siembra e inoculaciones.
- Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en condiciones de
asepsia y esterilidad.

II. MARCO TEORICO

Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder
cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados.

Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes
problemas:
- Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son
contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos
puros.

2.1. SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de
cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus
exigencias vitales, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de
inoculación, puedan desarrollarse y multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos
finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un trasplante.

AISLAMIENTO
Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a partir de una
muestra problema. Se requiere un medio sólido con gran superficie para que los
microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa)
por formación de colonias separadas. Si se aíslan especies distintas, cada colonia
tendrá características especiales, la morfología bacteriana será también distintiva.

TRANSPLANTE
Significa la separación previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en
tubo, que puede ser líquido o sólido.
 Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes trasplantes en medios especiales, se
logra conocer las propiedades culturales y bioquímicas y como resultado la
identificación específica. Los trasplantes se pueden realizar:
1. De líquido a sólido.
2. De líquido a líquido.
3. De sólido a sólido.
4. De sólido a líquido.

2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION

Existen los siguientes materiales:

 ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta
en asa o recta y en el otro extremo insertado con un mango cilíndrico para un uso
sencillo.

Se utiliza para inoculación o siembra por estría en medios sólidos, presentan un

arco bastante cerrado en su extremo cuyo diámetro es más o menos específico es
decir muchas asas son calibradas y corresponden a un volumen determinado de
siembra las más utilizadas son las de 0,01 mililitro que se esterilizan por
flameado.

 HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA)

Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo,
únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios
semisólidos y sólidos.

 ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de triángulo más o menos abierto. Se utiliza para
extender el inóculo líquido previamente adicionado en la placa, a través de una
pipeta pasteur. Se esteriliza en autoclave, aunque generalmente se puede hacer
empapando en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.
  HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra
desecación, deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a través
del hisopo en el medio de cultivo. Se suele comercializar ya estéril listo para
utilizar y desechables.

 PIPETAS
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio,
reutilizables por esterilización o de plástico, generalmente desechables. Pueden
ser graduadas (contienen volúmenes específicos), en cuyo caso su aspiración se
realizará con aspiradores para pipeta tipo pera o pipeta. La pipeta pasteur no
contiene volúmenes graduados son muy utilizados en bacteriología y cuya
aspiración se realiza con chupetes de goma. También nos encontramos con
micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un
determinado medio de cultivo.

2.3. PREPAPACION DE INOCULOS

Un inóculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de
microorganismos problema. Así pues, se debe partir, por un lado, de un, cultivo
puro y, por otro lado, de una concentración adecuada de microorganismos
problema.

Si la muestra no es pura se aplicará distintos métodos para el aislamiento

mediante técnicas específicas, como es el caso de la siembra por estrías en placa
o por agotamiento, o la técnica de la placa invertida, que en general va a permitir
el crecimiento más o menos separado de los microorganismos. Es muy útil usar
medios de cultivo enriquecidos específicos y diferenciales que permitan el
crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De esta forma,
una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada
como puro.

 METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS

Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de siembra estéril.
Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta pasteur estéril en
cantidad suficiente y, en ambos casos se homogenizará

2.4. PREPARACIÓN DE INÓCULOS

Si la muestra es sólida o semisólida se tomara siempre con asa de siembra estéril.
Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta pasteur estéril en
cantidad suficiente, y en ambos casos se homogenizará posteriormente en el
medio específico de cultivo.
 Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio líquido se
homogenizará y se dejará crecer a la temperatura adecuada, que generalmente
para organismos patógenos coincidirá con la temperatura corporal, dejándolos
crecer aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesaria
la utilización de un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en
todo el medio líquido, aunque esto va a depender de su aplicación posterior y de
la cantidad de inóculo que se requiera.

Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de

cultivo sólido, se utilizara diferentes técnicas de siembra y posteriormente se
verificará el cultivo, ej. Siembra por agotamiento.

Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un

medio líquido, se homogenizará la mezcla inicial por agitación y se dejará crecer
a una temperatura de 37ºC por 24 horas. Es importante que los inóculos sean
siempre jóvenes.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y ésta se añade a un
medio sólido, se extenderá con el asa de Digrasky, previamente estéril a través
de toda la placa incubándose a temperatura adecuada durante 24 horas. Se
requieren también cultivos jóvenes.

Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina estéril o
caldo de cultivo base.

A veces es necesario partir de un inóculo con un número aproximados de

microorganismos problema. En estos casos, los inóculos se establecen en medios
líquidos y el número de microorganismos se recuenta de forma aproximada, por
comparación de medios líquidos con diferentes gradientes de turbidez. Este es el
caso de la escala de Mc-Farland formada por una batería de tubos cada uno de
las cuales tiene distinta turbidez según la concentración de sulfato bárico. Cada
tubo corresponderá a una determinada concentración de microorganismos.

2.5. METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MÉTODOS DE

AISLAMIENTO)
El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea líquido o sólido
se denomina siembra o inoculación.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina
resiembra.
La siembra del inóculo puede realizarse en medio sólido o en medio líquido.

2.5.1. SIEMBRA DEL INÓCULO EN EL MEDIO SÓLIDO

Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.
En primer lugar encendemos una llama, a la cual acercaremos el asa de siembra
y lo quemamos (hasta ponerse al rojo vivo) para poder coger los
microorganismos que deseamos cultivar en la placa sin contaminar ésta. Una vez
quemado el asa de siembra lo dejamos cerca de la llama para que se enfríe un
poco y evitar matar a los microorganismos. Posteriormente acercamos el asa de
siembra a la muestra que vamos a sembrar, lo rozamos por ella y lo acercamos a
la placa en la que vamos a sembrarlos, la cual hemos abierto un poco. Con el asa
de siembra seguimos un camino en zig-zag desde el centro al exterior de la placa,
luego la giramos, hacemos lo mismo y volvemos a repetir el proceso dos veces
más

2.5.2. SIEMBRA DEL INÓCULO EN PLACA

Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del
medio sólido. Se va descargando gradualmente el inóculo, para que en los
últimos planos del medio queden escasas células aisladas que en el ambiente
nutritivo se irán multiplicando, logarítmicamente hasta formar colonias puras.
Los métodos de aislamiento varían según el dispositivo de siembra y la forma de
distribuir el inóculo.
Cualquiera que sea el método ensayado, aprovechando el máximo de superficie
del medio se logra el aislamiento de mayor número de cepas microbianas.

CLASES DE SIEMBRA
- Siembra por agotamiento o por estrías.
- Siembra por difusión.
- Siembra por diseminación.

a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE

Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye una
cantidad adecuada de muestra problema depositando el inóculo en uno de los
extremos superiores de la placa, a partir de aquí se realizará movimientos en zig -
zag de un extremo a otro de la placa no tomándose en ningún momento nuevos
inóculos y no levantándose el asa hasta concluir la siembra en toda la placa.

- ESTRIA MÚLTIPLE
Se tomará la muestra problema con el asa de siembra previamente estéril y dicho
inóculo se depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un
extremo a otro de ésta solo en la parte superior. Flameado el esa de platino y
girando ligeramente dicha placa repetiremos el proceso anterior que nos
permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedó la muestra
hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas
de platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma
dirección se repite la operación hasta un total de cuatro o cinco veces, que son
los que tienen cabida aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el
último tramo se efectuará hacia el interior de la misma.
El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que
cada vez que se va arrastrando y separando más la muestra. Es importante que
para separar estas colonias se realice en cada estría un flameado previo del asa de
siembra.
- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES
Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos
líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la placa de tal forma
que esta queda dividida en cuatro cuadrantes iguales. Se tomará con el asa de
siembra estéril una cantidad de inóculo y se adicionará en el extremo superior de
uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese cuadrante en forma de zig -
zag. Realizamos la misma operación sin flamear el asa en todos los demás
cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el
microorganismo problema observándose en el último cuadrante las colonias más
aisladas o separadas.

- TECNICA DE LOS TRES GIROS

Se rotula la placa en forma análoga al caso anterior. Se toma inóculo con el asa
de platino y se siembra por estría la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa
de platino giraremos la placa unos 90º y volveremos a sembrar una segunda vez.
Así sucesivamente hasta completar toda la siembre (girando de nuevo la placa
900) ésta técnica no es muy utilizada.

b. SIEMBRA POR DIFUSION (TÉCNICA DE BARRY)

En este método, el medio de cultivo se mezcla con el inóculo, al solidificar las
colonias crecen en diferentes niveles, los cuales servirán para contaje de
colonias.
 Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a
una temperatura de 45 a 50ºC) en el tubo, en el tubo se adicionará la cantidad de
inóculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogenizará la muestra en el tubo
mediante el vibrador.

Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y se dejará
solidificar, la mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque
la homogenización en este caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por
ejemplo, para la determinación de CMI (concentración mínima inhibitoria) de un
antibiótico frente a determinados microorganismos.

c. SIEMBRA POR DISEMINACIÓN (CON ASA DE DIGRASKY).

Consiste en adicionar al medio sólido, un inóculo que puede oscilar entre 0,2 y 1
ml según los casos con una pipeta graduada estéril, y posteriormente se extiende
con el asa de Digrasky también estéril. Esta técnica se puede utilizar para el
recuento de células viables, antibíogramas, etc.

2.6. SIEMBRA DEL INÓCULO EN TUBO

a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO

Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad
de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la superficie de ésta
realizando movimientos ascendentes en zig - zag hasta completar toda la
superficie del medio. Este método es utilizado para conservar cepas durante
largos períodos, así como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas
como la prueba de ureasa.

b. SIEMBRA POR PICADURA

Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones también puede
hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo
que se encuentra en el tubo hasta el fondo de esta y en posición central. Esta
técnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semisólidos ej. Medio de
oxidación - fermentación de Hugh-Leiffson.
 c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA
Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas. Este
método se lleva a cabo cuando el medio es sólido y está inclinado. Primero se
realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estría ej. Prueba
de medio KIA y la prueba en medio citrato entre otras.

2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA

CELULARES

El empleo de microorganismos en Biotecnología se fundamente en la obtención

de cultivos puros, que están constituidos por una única especie microbiana. La
mayoría de las aplicaciones en biotecnología conlleve el uso de cultivos puros.

La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en algún

método de dilución. El método más útil y práctico es el aislamiento en placa, en
el que un cultivo mezclado se inocule y se extiende sobre la superficie de un
medio de cultivo de modo que las células individuales queden separadas una de
otras. Cada célula aislada crece ahora para formar una colonia y, por lo tanto, un
cultivo (o clon) puro puesto que las células que componen la colonia son la
progenie de una única célula original.

Existen varios métodos para confirmar la pureza de un cultivo:

1. Repitiendo la operación de aislamiento; una colonia aislada procedente de

un aislamiento en placa inicial debería dar lugar al repetir la operación a
colonias todas del mismo tipo, y cuya morfología concuerda con la del
aislamiento inicial.
2. El examen microscópico de los organismos procedentes de una colonia
deberían mostrar un único tipo celular. Los métodos diferenciales de tinción
Gram, son útiles pare establecer que la colonia una mezcla de tipos
microbianos diferentes.

Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y
para mantener la esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando
asépticamente, el biotecnólogo tome prudentemente las precauciones necesarias
para prevenir la contaminación o de las soluciones con microorganismos no
deseados.
III. MATERIALES Y EQUIPOS

Material de Vidrio Otros materiales

- Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x - Gradillas
100) - Mechero Bunsen
- Placas petra - Asas de siembra
- Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml - Algodón
- Erlenmeyer - Pinzas

Equipos
- Estufa 37ºC
- Autoclave

Reactivo y Medios de cultivo

- Medios de cultivo
 Agar Mc Conkey  Agar TSI, LIA (tubos pico de
 Agar nutritivo flauta)
 Agar Saboraud  Agar SIM (tubos fondo)
 Caldo SIM

IV. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS

4.1. SIEMBRA DE UNA MUESTRA LÍQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY
Muestra: Inóculo de un cultivo puro
Medio de cultivo: Agar nutritivo
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4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA

Muestra: Microorganismos
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Medio de cultivo: Agar nutritivo
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características
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4.3. TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES

Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Medio de cultivo: Agar nutritivo

Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características

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V. CUESTIONARIO

1. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen?

2. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia?
3. ¿Por qué debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una
transferencia?
4. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo fuente o
del tubo a ser inoculado.
5. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿por qué es necesario tocar
una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
6. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de
siembra?
7. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES