Cromatografa lquida de alta resolucin:

1. Cromatografa del ion par

La cromatografa por formacin de pares ionicos (PIC) permite una mejora en la

separacin de los compuestos inicos o muy polares (aminocidos y cidos orgnicos)
que tienen demasiada poca afinidad por la fase estacionaria cuando esta es apolar
Figura 1. As, este carcter polar o ionico debe reducirse para aumentar la retencin.
Para algunos se puede modificar el pH, pero si esto no es suficiente, entonces se aade
a la fase mvil un compuesto que incorpora simultneamente una cadena carbonada
(poco polar) y de un grupo polar de carga opuesta a la del compuesto que hay que
separar (por ejemplo, alquilamonio o alquilsulfonato). Esto permite crear un par de
iones neutro, bastante estable y lipoflica, que ser ms retenido en la fase
estacionaria, siguiendo este principio permite la separacin de los cationes o aniones
inorgnicos sobre una fase de polaridad inversa (RP).

1 Glucosa C6H12O6
2 Maltosa C12H22O11
3 Maltotriosa C18H32O16
4 Maltotetraosa C24H42O11
5 Maltopentosa C30H52O26
6 Maltohexaosa C36H62O31
7 Maltoheptaosa C42H72O36

Figura 1. La separacin de azcares en una fase de "amino". El orden de elucin de 7

azcares homlogas indica que la fase estacionaria es polar y que la fuerza elutropica
de la fase mvil disminuye a medida que aumenta la masa molecular.

Figura 2. El efecto sobre la separacin de par inico en una columna de polaridad

invertida. (a) El cromatograma de una mezcla de tres nucletidos que muestran la
situacin "normal" de una elucin con el fin de reducir la polaridad; (b)
Alternativamente, en la situacin de fase inversa: trifosfato de adenosina asociado con
 el ion de tetrabutilamonio se ha vuelto ms lipfilo y por lo tanto se retiene ms tiempo
(cortesa reproducida de Alltech).

Las resinas de intercambio inico poseen especies cargadas unidas a la fase slida, pero
los grupos ionicos pueden estar recubiertos dinmicamente en columnas de fase
reversa usando compuestos ionicos que se unen al relleno de la fase reversa. Se pueden
aadir al eluyente aniones de cidos alquilsulfonicos; por ejemplo, acido
hexanosulfonico (CH3(CH2)5SO3- H+).

Estos cubren a la fase estacionaria de la fase reversa, dndole propiedades de

intercambio catinico. Anlogamente, se pueden aadir al eluyente cationes, como el
hidrxido de tetrapropilamonio ((CH3CH2CH2)4N+OH-), para darle propiedades de
intercambio aninico. Estos aniones y cationes orgnicos se denominan reactivos de
emparejamiento ionico, y la separacin que se lleva a cabo en estas condiciones se
denomina Cromatografa de pares inicos (IPC) . El grado de retardo de los analitos
puede ajustarse usando diferentes concentraciones del reactivo de par ionico en el
eluyente as como cambiando el poder eluyente, de la fase mvil. Estas opciones
proporcionan una flexibilidad aadida en las separaciones de analitos inicos. Un
problema es que los grupos inicos de la cadena larga como el C12-sulfonato pueden
ser difciles de eliminar de las columnas de fase reversa. Las propiedades de intercambio
inico se mantienen mientras permanezca el reactivo de par inico, y la columna no
volver a su qumica original. Por otro lado, un C6- sulfonato se eliminara fcilmente
con, por ejemplo, metanol. La cromatografa de par inico se utiliza para analizar
compuestos inicos de elevada polaridad, solubles en agua como detergentes o algunas
drogas.

2. Cromatografa de interaccin hidrfoba

La cromatografa de interaccin hidrfoba (HIC), se emplea principalmente para el separacin

de compuestos bio - orgnicos tales como protenas solubles en agua. Se utiliza una columna
apolar y se comienza la elucin con una fase mvil muy salina (por ejemplo, sulfato de amonio
2 M y fosfato monosdico 0,1 M, a pH 7). Bajo estas condiciones, las protenas se unen por su
regin hidrfoba sobre la fase estacionaria. A continuacin, se disminuye progresivamente la
concentracin salina con el fin de que las protenas vuelven a la fase mvil (Figura 3). De este
modo son eludidas en orden decreciente de su hidrofilicidad.

Esta operacin es similar a una tcnica empleada en la qumica orgnica: cuando en un embudo
de decantacin, con el fin de extraer con ter un compuesto orgnico diluido en un medio
acuoso, se le aade salmuera para reducir la solubilidad del compuesto orgnico en agua y por
lo tanto facilitar su extraccin con el ter.
 Figura 3.16 Separacin mejorada por aplicacin del principio de interaccin hidrfoba.
Cromatograma de una mezcla de protenas cada vez menos hidrofilas obtenido al
disminuir, durante el proceso cromatgrafico, la concentracin salina (cortesa de
Supelco).

Cromatografa de interaccin hidrofbica:

Tcnica para purificacin de compuestos biolgicos.

Combina las caractersticas desnaturalizantes precipitantes de las sales y la precisin de
la cromatografa para obtener una alta resolucin junto con una buena recuperacin de
la actividad.
Se basa en la adsorcin debil de biomolculas a una superficie hidrfoba a altas
concentraciones de sal, seguido de elucin con un gradiente de sal descendente.
Las regiones hidrfobas presentes en la superficie de las biomolculas se unen a
ligandos hidrfobos inmovilizados sobre soportes de cromatografa.
Esta basada en una caracterstica de todas las protenas, esto puede aplicarse a
protocolos de purificacin de protenas.
Preserva la actividad biolgica de las protenas.

Principios de la cromatografa de interaccin hidrofbica:

Interacciones hidrofbicas:

Las interacciones hidrofbicas tienen gran importancia en los sistemas biolgicos, impulsores de
la estabilizacin de la estructura y el plegamiento de protenas. Adems, las interacciones
hidrofbicas son altamente selectivas y juegan un papel importante en varios procesos
biolgicos, como las reacciones antgeno-anticuerpo, la catlisis enzimtica, la agregacin de
protenas, la regulacin y el transporte a travs de membranas.
Figura 1. Interacciones hidrofbicas entre un ligando de HIC y una molcula de protena.

Inicialmente, las molculas de agua se organizan alrededor del ligando no polar y la parte
hidrofbica de la protena. Cuando estas dos estructuras interactan, las molculas de agua
ordenadas son desplazadas al disolvente, resultando en un aumento de la entropa y un proceso
termodinmicamente favorable.

Mecanismo de Retencin y Principios de adsorcin

La tcnica que nosotros llamamos HIC ha sido descrito por una variedad de trminos en la
literatura:

Cromatografa de desplazamiento salino

Cromatografa de afinidad hidrfoba
Cromatografa de adsorcin hidrofbica-[11
Cromatografa de adsorcin promovida por sal.

La influencia de diferentes sales en la adsorcin por HIC generalmente esta basada sobre la
salificacin y precipitacin de protenas. El Hofmeister o serie liotrpica enumera los iones en el
orden que promueven interacciones hidrofbicas y precipitacin de protenas (iones anti
caotrpicos) a los que disminuyen la fuerza de estas interacciones (iones caotrpicos) (Cuadro
2). Melander y Horva'th demostraron que la molalidad y el incremento de la superficie molal de
la sal son los factores ms importantes que determinan el efecto de la sal sobre la retencin de
HIC, ya que un aumento en la tensin superficial promovida por un resultados de adicin de sal
en aumento de la unin de las protenas a los medios de HIC.

Figura 2: La serie de Hofmeister Algunos aniones y cationes Segn clasificacin a su efecto sobre
la solubilidad de protenas en soluciones acuosas.