Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Los microorganismos no presentan una variedad de aspectos anatómicos definidos, y por tanto
los procedimientos para la identificación de los microorganismos se realizan estudiando:
- Sus características morfológicas macroscópicas y microscópicas.
- Sus características tintoriales.
- Su comportamiento bioquímico.
Teniendo siempre presente que para realizar todas estas pruebas de identificación, previamente
hemos aislado el microorganismo y hemos obtenido un cultivo puro del mismo. Se han de usar cultivos
puros, jóvenes y en fase exponencial de crecimiento.
La morfología bacteriana celular es diferente de unas especies a otras, pero es poco variada. Se
diferencian las siguientes formas:
Formas esféricas o COCOS.
Formas cilíndricas rectas alargadas. BACILOS
Formas cilíndricas largas onduladas. ESPIRILOS
Formas cilíndricas cortas y curvas. VIBRIOS.
Formas alargadas en espiral. ESPIROQUETAS.
Cuando la célula bacteriana se divide, las nuevas células pueden agruparse o bien quedar células aisladas.
1
Los Cocos se agrupan en:
Parejas: Diplococos.
Cadenas: Streptococos.
Racimos: Stafilococos.
Masas cúbicas: Sarcinas.
Los Bacilos que habitualmente se presentan aislados, pueden formar cadenas, colonias móviles o
estructuras pedunculadas. (Ver dibujo anterior).
Una de las tinciones más importantes es la tinción diferencial de Gram, que divide a las bacterias
en dos grandes grupos basándose en el distinto comportamiento de los colorantes frente al espesor de la
pared celular las bacterias: bacterias Gram+ y bacterias Gram-.
Las Gram+: poseen una pared gruesa y uniforme, y en la tinción de Gram impiden la salida del
primer colorante (cristal violeta) al decolorar con alcohol-acetona y dan coloración azul-violeta.
Las Gram- : poseen una pared más delgada y heterogénea- Pierden el primer colorante (cristal
violeta) al decolorar con alcohol-acetona y conservan el segundo colorante (safranina) dando coloración
rosa.
Para la identificación correcta de los microorganismos debemos consultar los resultados obtenidos
durante las pruebas de identificación con un manual de identificación adecuado al sistema utilizado:
Manual Bergey de taxonomía, Tabla codificada, programa informático, Índice de perfiles API…
La clasificación de las pruebas bioquímicas es muy diversa vamos a establecer una en base a sus
funciones bioquímicas.
2
CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
DETERMINACIÓN DEL
METABOLISMO PROTEICO Hidrólisis de la Gelatina
Oxidasa
Catalasa
Ureasa
Reducción de nitratos
Indol
Citrato de Simons
Agar-Hierro-Kligler (AHK)
MACROTÉCNICAS
Agar-Sulfuro-Indol-Motilidad (ASIM)
SISTEMAS MULTIPRUEBAS
3
A. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO HIDROCARBONADO.
Estas pruebas se basan en la utilización de los hidratos de carbono por los microorganismos
mediante metabolismo oxidativo (aerobio) ó fermentativo (anaerobio).
El medio de cultivo que se emplea es el de Hug y Leifson que contiene entre otros componentes el
azúcar a estudiar y un indicador de ph (azul de bromotimol).
Se inoculan dos tubos en picadura, uno de ellos “abierto” vía oxidativa (proceso aerobio) y otro
cubierto con parafina para aislarlo del oxigeno, vía fermentativa (proceso anaerobio). Después del periodo
de incubación, si se produce viraje del color azulado a amarillo, indica que el microorganismo ha
producido acidez a partir del azúcar.
Si el color amarillo se manifiesta ligeramente en la parte superior del tubo sin
parafina y sin producción de gas, el microorganismo actúa sobre el azúcar
oxidativamente.
Si el viraje a amarillo se manifiesta intensamente desde la parte inferior a superior
en ambos tubos con ó sin producción de gases diremos que el microorganismo es
fermentador.
fermentativo oxídativo
negativo
4
A.2 Prueba de producción de ácido y gas: Se determina la capacidad del microorganismo de
fermentar azúcares produciendo ácidos (vira el indicador) y/o ácidos y gases. El gas se detecta
introduciendo una campana Durhan invertida en el tubo inoculado.
FUNDAMENTO: Evidenciar la fermentación de la lactosa y la producción de gas. El medio inhibe Gram (+),
debido a que contiene verde brillante y bilis. Sirve para la detección de coliformes totales
Se muestra la prueba positiva en los tres Se observa la prueba negativa en los tres tubos, debido a que no
tubos, debido a que se observa hay crecimiento, pero eventualmente puede haber turbidez, pero si
crecimiento (turbidez) y formación de no hay producción de gas la prueba es negativa
burbuja en la campana de Durham.
Es decir presencia de coliformes.
5
B. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO PROTEICO
Son pruebas para detectar enzimas necesarias para el metabolismo de las proteínas.
B.1 Prueba de hidrólisis de la gelatina: Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un
microorganismo para producir enzimas proteolíticas que licúan la gelatina (gelatinasas).
MEDIO FRAZIER
Preparar 1 litro de agar nutritivo. Disolver 40 g de gelatina en una pequeña cantidad de agua hirviendo
(tomarla del agua utilizada para la preparación del agar nutritivo). Mezclar ambas soluciones. Esterilizar
durante 20 minutos a 120 ºC.
PROCEDIMIENTO
Inocule con filamento haciendo una estría en la superficie del medio (agar gelatina). Incube a 37°C por 2 a
7 días.
RESULTADOS
Cubra la placa con el reactivo precipitante de proteínas (Cloruro mercúrico ácido). Un precipitado blanco
indica presencia de gelatina no hidrolizada; la ausencia del precipitado en la región de crecimiento
bacteriano indica hidrólisis de la gelatina.
6
C. PRUEBAS ENZIMÁTICAS: Son pruebas que determinan la presencia de enzimas en el
microorganismo.
C.1 Prueba de la oxidasa: Esta prueba pone de manifiesto la presencia de la enzima oxidasa
(citocromo c oxidasa) en ciertos microorganismos, (bacterias aerobias, facultativas y microaerofilas). La
citocromo c oxidasa es una enzima que cede electrones de un sustrato al oxígeno en la cadena de
transporte electrónico.
La identificación de esta enzima se basa en la capacidad del colorante tetrametil-para-
fenilendiamino de oxidarse al ceder electrones al citocromo c. Este colorante es incoloro en estado
reducido y puede oxidarse rápidamente en presencia del citocromo c, dando una coloración azul. Esta
prueba permite diferenciar entre otras el grupo Enterobacteriacea (negativo) del género Pseudomonas
(positivo).
Reactivo.
El reactivo empleado es el cloruro de tetrametil-p-fenilendiamina, cuyo cambio oxidativo, al ceder
los electrones a la citocromo oxidasa, revela la prueba. Este reactivo debe ser de preparación momentánea.
Actualmente, esta reacción se puede realizar directamente empleando unas tiras reactivas que ya
llevan incorporado el reactivo.
Técnica.
Si la técnica emplea el reactivo recién preparado, se debe tomar un trozo de papel de filtro y
colocar una gota de reactivo y con ayuda del asa o pipeta Pasteur, se toma un pequeño inoculo del cultivo
y se pone en contacto con el reactivo.
Si por el contrario se emplean las tiras reactivas, la operación es más rápida, simplemente se debe
poner en contacto el asa o pinchar con el hilo en la zona de la tira que contiene el reactivo.
Esta reacción es muy rápida, en aprox 10 segundos se pueden observar los resultados que son:
La Prueba (+) se observa de color AZUL en tiras que poseen compuestos que son oxidados por la enzima.
7
La prueba (-) se observa de color amarillo.
Técnica Tomar con el asa una colonia y depositarla sobre el porta. Añadir con una pipeta una
gota de agua oxigenada al 3%.
Esta prueba se usa para determinar la presencia de la enzima catalasa. La prueba POSITIVA se
observa producción bubujas. De lo contrario la prueba es NEGATIVA.
Esta prueba determina la presencia, en algunas bacterias, de la enzima ureasa que es capaz de
hidrolizar la urea a carbonato amonico, que se detecta por la alcalinización del medio.
Medio Bactourea agar base de Christensen. Se le añade urea al 20% esterilizada por filtración.
Se pesan todas las cantidades de los componentes señalados (tener en cuenta el contenido de NaCl
del agua de peptona y ajustar con la cantidad que hay que añadirle), excepto los gramos de urea. Se
mezclan todos (excepto la urea), se enrasa hasta 900 ml con agua destilada y se lleva a esterilizar al
autoclave.
Paralelamente se prepara la urea, se pesan los 20 gr y se disuelven en agua destilada hasta 100 ml;
se trata de una sustancia termolábil por lo que para su esterilización no puede realizarse en autoclave sino
que se realiza por filtración a vacío. Se recoge en el kitasato estéril y se mezcla con el medio base, que
debe estar sobrefundido 50-55ºC. Hay que tener mucho cuidado de que no se encuentre demasiado
caliente para evitar que la urea se descomponga.
Urea - Urea +
Hay que tener precaución por que también puede ocurrir que no se produzca cambio de coloración, en este caso
es negativo. el medio posee un color rosáceo (mucho menos intenso que los verdaderos positivos) lo que puede
llevarnos a error (falsos positivos)
Fundamento.
Esta prueba trata de poner de manifiesto, la capacidad de aquellos microorganismos que son
capaces de hidrolizar el almidón. Como consecuencia de esa hidrólisis, se produce zonas de aclaramiento
alrededor de las colonias bacterianas.
La detección se hace más visible por la adición de lugol que forma un complejo azul con el
almidón no hidrolizado.
Medio Agar almidón
9
Normas para preparación del medio: Agar nutritivo al que se le añaden 2g/l de almidón
Reactivo Lugol
Técnica Preparado el medio se tiende en placa pequeñas, luego con un asa se toma el inoculo
y se siembra tocando con el asa en varios puntos (no hay que volver a tomar el inoculo). Se lleva a incubar
a 37º C durante 48 horas.
Pasado el tiempo de incubación se retiran las placas de la estufa y para observar la prueba hay que
agregarle lugol.
Después de que ha crecido la bacteria en el medio de cultivo, se adiciona lugol sobre el medio y se
esperan unos minutos. En la parte izquierda de la placa se observa la prueba Negativa de
color azul oscuro, es decir que no se degradó el almidón. En la parte derecha se observa la
prueba Positiva debido a que no se unió el iodo-ioduro del lugol y el medio no toma ningún color.
Fundamento.
Esta prueba investiga la presencia de una enzima bacteriana encargada de la reducción de nitratos a
nitritos o a N2, es la enzima nitrato reductasa (nitrasa)..
Medio Indol-nitrito, aunque puede ser sustituido por agar nutritivo + KNO3 (1g/l).
10
Normas para preparación de estos reactivos.
Solución de alfa-naftilamina.
Técnica.
Se prepara el medio y se tiende en tubo inclinado, después con ayuda de un asa de siembra se toma
un inoculo y se en superficie. El tubo con el medio sembrado se lleva a incubar, a 37º C durante 48 horas.
Pasado el tiempo de incubación se retira el tubo de la estufa y se le agrega 0,5 ml de cada reactivo,
1º el 1-naftilamina y 2º el ac. sulfanílico y se observa al cabo de unos minutos la coloración que presente:
Coloración roja Los nitratos han sido reducidos a nitritos por el zinc, lo que
confirma que la bacteria no ha sido capaz de reducir los nitratos.
Sin coloración Indica que la bacteria ha reducido los nitratos a N2.
11
D. PRUEBAS PARA ENTEROBACTERIAS.
Medio Se puede emplear indol-nitrito, aunque también se puede sustituir por un medio
liquido, constituido por agua de triptona, NaCl y agua destilada, ajustándolo a un pH = 7,2.
Técnica.
Se siembra la bacteria en un tubo con el medio liquido, empleando un asa de siembra y se incuba a
37º C durante 48 horas.
Finalizado el tiempo de incubación, se retira el tubo de la estufa, se añade 5 gotas del reactivo de
Kovacs se agita y se deja reposar unos minutos.
12
Prueba positiva (presencia de enzima triptofanasa) Aparición de anillo rojo en la
parte superior del tubo.
Las bacterias fermentadores de azucares pueden hacerlo mediante rutas diferentes, así algunas
pueden seguir una ruta fermentativa ácido-mixta.
El crecimiento de algunas bacterias (anaerobias, anaerobias facultativas) en medio glucosado,
transforma la glucosa en ácidos orgánicos, que van a disminuir el pH a menos de 5 al cabo de 48 horas de
incubación. Esta característica se detecta con el viraje al rojo del indicador rojo de metilo.
Pasado el tiempo de incubación se retiran los tubos de la estufa y se le añaden 5 gotas del reactivo,
la observación será:
13
Prueba positiva (fermentación ácido-mixta) Viraje a rojo del medio (RM(+)).
Prueba negativa Presencia de coloración amarilla (RM(-)).
Al adicionar el reactivo Rojo de metilo sobre el medio MR/VP se evalúa la prueba. A la izquierda se
observa la prueba POSITIVA en donde hay producción de ácidos mixtos estables a partir de la
glucosa. La prueba NEGATIVA se observa a la derecha en donde no hay producción de ácidos mixtos
estables.
Fundamento.
Existen algunas bacterias que pueden fermentar la glucosa por otra vía alternativa, llamada ruta
fermentativa butilen-glicolica.
En esta ruta, la fermentación de la glucosa puede conducir a la formación de acetil-metil-
carbinol o acetoína (precursor del 2,3 butanodiol necesario para la síntesis de lípidos), que con el reactivo
de Voges-Proskauer (alfa-naftol en disolución alcalina) se forma un complejo de color rosa .
KOH ................................................. 40 g
Agua destilada ................................. 100 ml
Solución de alfa-naftol.
Técnica Se tiende el medio liquido en tubo, se siembra la bacteria (con asa de siembra) y se
incuba 48 horas a 37°C.
Pasado el tiempo de incubación se retiran los tubos de la estufa, se le añaden 0,5 ml de cada
reactivo y se agita. Se de debe añadir 1º el 1-naftol y 2º el KOH, agitar suavemente el tubo y mantenerlo
inclinado para favorecer la oxidación de la acetoina por el oxígeno atmosférico. El resultado de la prueba
se observara en menos de una hora y se interpretara:
VOGES PROSKAUER VP
15
D.4.- PRUEBA DE CITRATOS (CIT).
Fundamento.
Esta prueba indica la capacidad de las bacterias para metabolizar el citrato, empleándolo así como
única fuente de carbono.
El medio empleado (medio Simmons) contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de
amonio como única fuente de nitrógeno y azul de bromotimol como indicador. Únicamente las bacterias
capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y al hacerlo utilizaran los fosfatos
liberando iones amonio, que generara una basificación del medio, que virara a color azul.
Técnica Se prepara el medio y se tiende en tubo inclinado, con el asa se siembra y se lleva a
incubar durante 48 horas a 37º C.
Pasado el tiempo de incubación se observa la coloración del tubo, si es azul (se ha producido el
viraje del indicador), la prueba es positiva, las bacterias allí sembradas son capaces de emplear el citrato
como única fuente de carbono. También se considera positiva la prueba por el crecimiento del
microorganismo.
Citrato de Simmons
Prueba de citratos (+) izquierda, (-) derecha. Utilización de Citrato como única fuente de carbono.
Indicador de pH: azul de bromotimol.
16
E. MACROTÉCNICAS.
Son técnicas que utilizan medios que permiten realizar varias pruebas bioquímicas a la vez.
Fundamento.
El medio empleado en esta prueba es el, agar hierro de Kligler, se trata de un medio diferencial
muy útil, ya que demuestra varias características enzimáticas de la bacteria. Su principal aplicación es la
identificación de Enterobacterias, las cuales se dividen en dos grandes grupos, según su capacidad de
metabolizar o no la lactosa.
Está compuesto por dos azúcares en distinta proporción (glucosa 0,1% y lactosa 1%) tiosulfato
sódico, citrato ferrico y rojo fenol como indicador de pH. Esta composición permite determinar diferentes
características enzimáticas, para lo cual es necesario realizar una siembra tanto en superficie como en
profundidad.
Características enzimáticas analizadas.
Técnica.
Se preparan tubos ligeramente inclinados (en pico de flauta) con el agar y ayudados con el hilo de
siembra con el que tomamos el inoculo, se siembra por estrías en la superficie inclinada y seguidamente
en picadura (sin necesidad de tomar de nuevo inoculo).
17
Precipitado negro: SH2 (+).
Viraje a amarillo en la parte inferior: ( Glu (+)
Viraje a amarillo en la superficie inclinada: ( Lac (+)
Burbujas o ruptura del medio ( Gases (+)
Posibles resultados de la prueba de Kligler. De izquierda a derecha se observa primero un tubo sin
inocular; luego un tubo Lactosa (+), Glucosa (+), H2S (-), Gas (+); en seguida un tubo Lactosa (-),
Glucosa (+), H2S (+), Gas (-).
Es un medio semisólido, y se detecta: Indol (anillo rojo), producción de ácido sulfhídrico (pp negro), y la
movilidad de la bacteria.
Medio: Agar ASIM.
Técnica.
Se siembra en picadura y se incuba a 37ºC durante 18-24 horas.
La interpretación de resultados y las aplicaciones son las correspondientes a las pruebas que lo
componen.
18
Se observa la producción de sulfuros, que se precipitan con iones férricos, a partir del tiosulfato de sodio
presente en el medio. La prueba positiva (tubos del centro e izquierda) se observa un precipitado
negro en el medio de cultivo donde creció la bacteria.
Adicionalmente se observa la motilidad de la bacteria que ha sido sembrada por punción en este medio
semi-sólido. Se observa el movimiento de las bacterias que crecen a manera de sombrila al rededor del
eje de siembra.(Motilidad+ tubos del centro e izquierda).
Se observa la capacidad de la bacteria para desdoblar el triptófano por medio de la enzima triptofanasa y
producir INDOL. Al adicionar Kovacs sobre el medio cuando hay produccion de Indol se forma un
anillo rojo (tubo de la derecha INDOL+). De lo contrario se forma un anillo amarillo (tubo del centro
y la izquierda INDOL-).
F. MICROTÉCNICAS.
Son sistemas miniaturizados que permiten realizar varias pruebas bioquímicas simultáneamente, y
actualmente son muy utilizados por su rapidez y eficacia.
Existen varios tipos: en tubo y en tira.
Vamos a describir el sistema en tira API 20E . El sistema en tubo es similar y existen para
Enterobacterias y otros géneros como Staphloccoccus.
19
H2S Producción de H 2 S
URE Ureasa
TDA Triptófano desaminasa
IND Producción de indol
VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer)
GEL Gelatinasa
GLU Fermentación/oxidación de glucosa
MAN Fermentación/oxidación de manitol
INO Fermentación/oxidación de inositol
SOR Fermentación/oxidación de sorbitol
RHA Fermentación/oxidación de ramnosa
SAC Fermentación/oxidación de sacarosa
MEL Fermentación/oxidación de melobiosa
AMY Fermentación/oxidación de amigdalina
ARA Fermentación/oxidación de arabinosa
OX Citocromo oxidasa
Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada pocillo tiene un tubo y una cúpula,
parte aerobia), de todos los pocillos.
20
Llenar la cúpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensión de bacterias.
Cubrir con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis.
Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Previamente poner agua en los alvéolos de
la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.
21
Incubar a 37 °C durante 18-24 h.
Tras la incubación se anotan los resultados inmediatos, es decir, los que no requieren ser revelados.
Determinadas pruebas requieren ser reveladas, para el revelado se tienen que tener en cuenta dos
criterios:
Si el compartimento de glucosa GLU da negativo (AZUL o azul verdoso) y los tests positivos son dos
o menos de dos, no hay que añadir reactivos ya que el microorganismo no se trata de una
Enterobacteria. Cuando ésto ocurre se hacen otros tipos de API como el API 20NE, API OF, el API M
o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales.
Si la glucosa es positiva y/o tres o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos:
TDA
Añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2 H5 OH).
IND
Oxidasa
INTERPRETACIÓN
La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de
las tablas de lectura, y anotando el resultado como positivo o negativo (más adelante se explicará
con detalle).
Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Los pocillos están
separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test número 21
corresponde al test de la oxidasa).
Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se obtiene un código de
7 cifras.
24
Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata, para realizar esta
operación hay programas informáticos.
PERFILES NUMÉRICOS.
ANEXO I.
α-naftilamina
Reducción A.N. + KNO3 Ac. Sulfanilico 48 horas, 37º C Tubo inclinado Color rojo cereza
NO3-
26
Triptona+NaCl
Indol (IND) + Agua Kovacs “ Tubo Anillo rojo
27