PRÁCTICA No.

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

OBJETIVO GENERAL
El alumno identificará bacterias de interés a través del metabolismo microbiano.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• El alumno realizará pruebas para determinar la actividad enzimática sobre los carbohidratos y sales
orgánicas como principales fuentes de carbono.
• El alumno realizará pruebas de hidrólisis para aminoácidos y proteínas para conocer su actividad
enzimática.
• El alumno realizará pruebas para conocer la actividad enzimática en los procesos de óxido-reducción.

INTRODUCCIÓN
Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario sembrar la muestra por estría, ya que generalmente
se parte de un cultivo mixto de esta manera se logra aislar y observar su morfología colonial. Una vez que se tiene
el cultivo puro, se transfiere a un medio de cultivo en el cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos, es
necesario saber la temperatura óptima de crecimiento. Cuando se tiene el cultivo puro, se procede a realizar la
tinción de Gram para clasificarlo y saber a qué grupo pertenece Gram + ó Gram -. Además la morfología
microscópica permite conocer la forma y agrupación del microorganismo.
La identificación bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las características de las colonias y la
morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido en género y
especie se logra mediante la detección de su metabolismo. El metabolismo es un proceso químico, mediante el
cual los seres vivos transforman una serie de compuestos químicos con el fin de obtener energía. Los
microorganismos son capaces de efectuar reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos
finales permiten su identificación, a este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se
han clasificado según su origen:

a) Reacciones de carbohidratos (almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etcétera)

b) Reacciones para sales orgánicas (citrato, malonato, urea)
c) Reacciones para proteínas y aminoácidos (gelatina, caseína, triptófano, lisina, arginina y
ornitina)
d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos, anaerobios
Facultativos y anaerobios estrictos)

En el laboratorio, estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia aislada a una serie de
medios de cultivo que contienen substratos específicos e indicadores químicos que detectan los cambios de pH o
la presencia de un subproducto.

EQUIPO POR GRUPO

Incubadora a 37 °C (primera y segunda sesión)

EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO POR EQUIPO

1 Piseta (primer sesión)
1 charola para tinción (primer sesión)
1 Estereoscopio (primer sesión)
1 Microscopio (primer sesión)
Papel seda (primer sesión)
1 Pinza para portaobjetos (primer sesión)
1 vaso de precipitado de 250 mL (primer sesión)
2 Mecheros Bunsen (primera y segunda sesión)
1 Gradilla metálica (primera y segunda sesión)

REACTIVOS POR EQUIPO

1 gotero con 5 mL de Cristal Violeta para Tinción de Gram (primer sesión)
1 gotero con 5 mL de Yodo-lugol para Tinción de Gram (primera sesión)
1 gotero con 5 mL de Safranina para Tinción de Gram (primer sesión)
1 gotero con 5 mL de alcohol-acetona para Tinción de Gram (primer sesión)
Aceite de inmersión (primer sesión)
1 caja Petri con Agar almidón (primer sesión)
2 tubos con medio Agar TSI en pico de flauta (con 4 mL cada tubo) (primer sesión)
2 tubos con medio Agar LIA en pico de flauta (con 4 mL cada tubo) (primer sesión)
2 tubos con medio de Gelatina nutritiva (con 4 mL cada tubo) (primer sesión)
2 tubos con medio Agar Citrato de Simmons en pico de flauta (con 4 ml cada tubo) (primer sesión)
2 tubos con Caldo Rojo de metilo (con 3 mL de caldo para cada tubo) (primer sesión)
2 tubos con medio Agar Urea en pico de flauta (con 4 mL cada tubo) (primer sesión)
2 tubos con medio semisólido de medio MIO (con 3 mL cada tubo) (primer sesión)
1 gotero con 5 mL de Reactivo Rojo de metilo (segunda sesión)
1 gotero con 5 mL de Reactivo de Kovacs (segunda sesión)
1 gotero con 1 mL de H2O2 al 3% (segunda sesión)
1 gotero con 5 mL de Reactivo de Lugol para prueba de hidrólisis de almidón (segunda sesión)
Agua destilada (primer y segundo sesión)
1 gotero con 5 ml de alcohol al 96% (primer y segundo sesión)

MATERIAL BIOLÓGICO POR EQUIPO

1 caja Petri chica y un tubo con Bacillus subtilis de 24 h de crecimiento (primer sesión)
1 caja Petri chica y un tubo con Escherichia coli de 24 h de crecimiento (primer sesión)
1 caja Petri chica y un tubo con Enterobacter sp. de 24 h de crecimiento (primer sesión)
1 caja Petri chica y un tubo con Staphylococcus aureus de 24 h de crecimiento (primer sesión)
1 caja Petri chica y un tubo con Proteus vulgaris de 24 h de crecimiento (primer sesión)
1 caja Petri chica y un tubo con Streptococcus sp. de 24 h de crecimiento (primer sesión)

Material proporcionado por los alumnos

10 mL de H2O2 (segunda sesión)

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Sesión 1

A) Observación al microscopio de la muestra a analizar.

1.- Realización de un frotis con el microorganismo indicado por su profesor.

2.- En el frotis realizado llevar a cabo una tinción de Gram.
3.- Observación al microscopio.
4.- Anotar en el manual los resultados obtenidos (coloración, forma celular, agrupación, si es Gram+ o Gram-,
etc.).

B) Siembra de pruebas Bioquímicas

Prueba de Hidrólisis de almidón

El almidón es un homopolisacárido, producto de condensación de monómeros de un único tipo de monosacárido,

α-D-glucosa, que forma un polímero de muchas unidades unidas por puentes α-glucosídicos. La estructura básica
del almidón es una mezcla de dos moléculas de glucosa: amilosa lineal (10-20%) y amilopectina ramificada (80-
90%). La enzima específica para la hidrólisis del almidón en bacterias es la enzima α-amilasa.

Fundamento:
Bajo la presencia de yodo lugol, la aparición de una halo claro alrededor de la bacteria indica la degradación del
almidón presente en el medio de cultivo, debido a la presencia de la enzima responsable de la degradación de este
polisacárido, la enzima α-amilasa.

Metodología:
1.- La placa proporcionada a cada equipo se divide en dos partes (la caja Petri se divide marcando con plumón
permanente la parte inferior de la caja)
2.- Etiquetar correctamente la caja Petri en la parte inferior (nombre del medio, microorganismo o tubo control,
grupo, equipo y fecha). En una de las partes se inoculará al microorganismo proporcionado por sus profesores y
en la segunda mitad se utilizará como control negativo (sin la inoculación de microorganismo).
3.- Esterilizar el asa bacteriológica.
4.- Inocular por estría simple con una porción de una colonia aislada del microorganismo proporcionado.
5.- Incubar la caja a 37 °C durante 24 a 48 h.
6.- Después del periodo de incubación añadir unas gotas de lugol, cubriendo la superficie de la placa en donde
exista crecimiento del microorganismo
7.- Anotar los resultados obtenidos.

Interpretación de resultados:
Positivo.- Si se forma un halo claro alrededor del crecimiento (Figura 1A).
Negativo.- No se forma un halo claro alrededor del crecimiento (Figura 1B).
 A

Figura 1. A) Resultado positivo (después de la adición de lugol se observa un halo claro alrededor del crecimiento
bacteriano, B) Resultado Negativo (después de la adición de lugol, no se observa halo alrededor del crecimiento).

Prueba en agar triple azúcar y hierro (MedioTSI)

El agar con azúcar triple y hierro (TSI) es un medio de cultivo diferencial en tubo, que cumple un doble propósito:
a) la determinación de fermentación de hidratos de carbono y b) la determinación de la producción de H2S. Un
microorganismo puede usar varios sustratos incorporados en el medio; el patrón de sustratos metabolizados se
usa para diferenciar entre los diversos grupos, géneros o especies, principalmente entre los miembros de la familia
Enterobacteriaceae. El medio TSI presenta los siguientes hidratos de carbono: lactosa al 1%, glucosa al 0.1% y
sacarosa (disacárido de glucosa y fructosa) al 1%. La fermentación tiene lugar tanto en aerobiosis (en el pico de
flauta) como en anaerobiosis (en el fondo del tubo). En el pico de flauta, el monosacárido glucosa es catabolizado
inicialmente por la vía metabólica anaerobia de Embden-Meyerhor-Parnas, usada por aerobios y anaerobios para
producir el intermediario clave, ácido pirúvico. El ácido pirúvico es degradado luego a través del ciclo de Krebs
por aerobios o anaerobios facultativos para la obtención de CO 2, H2O y energía. La lactosa es un disacárido
compuesto por dos unidades de monosacárido: glucosa y galactosa (Figura 2).

Figura 2. Reacciones y vías metabólicas involucradas en la prueba en agar triple azúcar y hierro.

Fundamento:
Para aquellos microorganismos que sólo fermentan la glucosa, después de 18-24 h de incubación la concentración
baja de la glucosa se agota y el microorganismo empieza a usar las peptonas del medio como nutrientes de
desarrollo. El catabolismo de la peptona libera amoníaco (NH 3) que alcaliniza el pH y mediante el rojo fenol
(indicador de pH) se genera una coloración roja. El fondo del tubo tiene una coloración amarilla por la degradación
anaerobia de la glucosa, en la que al producirse diversos ácidos se produce un pH ácido (color amarillo). La
concentración de la lactosa es 10 veces la de la glucosa, por lo que después de 18-24 h de incubación los
microorganismos que fermentan la lactosa presentan un medio ácido debido a la fermentación de este hidrato de
carbono, el cual no se ha agotado. Si el microorganismo no fermenta la glucosa o la lactosa hará uso de las
peptonas del medio de manera aeróbica o anaeróbica, lo cual dependerá si existe un cambio a una coloración roja
(pH alcalino) en el pico de flauta (aeróbico) o el fondo del tubo (anaeróbico).
La producción de CO2 y H2 es debida como producto final del metabolismo de los hidratos de carbono. Otro
sistema de diferenciación es gracias a los indicadores de ácido sulfhídrico (H 2S) presentes en el medio: tiosulfato
de sodio (involucrado en la primera reacción) y el citrato de amonio férrico (involucrado en la segunda reacción).
Algunas bacterias son capaces de liberar enzimáticamente H2S gaseoso (primera reacción) a partir de los
aminoácidos azufrados para producir una reacción coloreada visible, negra (segunda reacción), en presencia de
un sistema indicador de presencia de H2S.

Metodología:
1.- Etiquetar correctamente los tubos (nombre del medio, microorganismo o grupo control, grupo, equipo y fecha).
2.- Esterilizar el asa bacteriológica.
3.- Sembrar en la parte inferior del tubo una porción de una colonia aislada del microorganismo proporcionado
mediante la técnica de punción (por picadura) y por estría en la porción de pico de flauta. Para ello se debe utilizar
el asa recta, introduciéndolo en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con un movimiento en “S”
(ambas inoculaciones con la misma muestra)
4.- Los tubos inoculados se incuban a 37°C 18 a 24 h.
5.- Anotar los resultados obtenidos.

Interpretación de resultados:
En lo que respecta a la fermentación de los hidratos de carbono la interpretación debe de realizarse después de
18-24 h de incubación (Figura 3). Las interpretaciones realizadas antes o después pueden dar patrones de
fermentación no válidos que producirán errores al agrupar los microorganismos entre los miembros de la familia
Enterobacteriaceae o en la identificación de género y/o especie.
El indicador de pH utilizado en el medio es el rojo de fenol. Una coloración amarilla indica pH ácido, una
coloración roja indica pH alcalino.
• Un pico de flauta con coloración roja (alcalino) y fondo con coloración amarilla (ácido), indica que la
glucosa fue degradada.
• Un pico de flauta con coloración amarilla (ácido) y fondo con coloración amarilla (ácido), indica que la
glucosa, la lactosa o la sacarosa fueron degradadas.
• Un pico de flauta con coloración roja (alcalino) y fondo con coloración roja (alcalino) [K/K], indica que
la glucosa, la lactosa y la sacarosa no fueron degradadas; uso de las peptonas.
• Un pico de flauta con coloración roja (alcalino) y fondo sin cambio, indica que ni la glucosa ni la lactosa
son degradas; uso de las peptonas.

La producción de gas (CO2 y H2) se observa por la fragmentación del medio, por una sola burbuja de gas, por el
desplazamiento completo del medio desde fondo del tubo dejando una zona libre o por una ligera separación del
medio de las paredes del tubo.

La aparición de un precipitado negro indica la producción de H 2S (prueba positiva).

A B C
 D E F
Figura 3. A) Tubo sin inocular; B) Un pico de flauta con coloración amarilla (ácido), fondo con coloración
amarilla (ácido) y generación de gas; C) Un pico de flauta con coloración roja (alcalino) , fondo con coloración
amarilla (ácido) y generación de gas; D) Un pico de flauta con coloración roja (alcalino) y fondo con coloración
amarilla (ácido); E) Un pico de flauta con coloración roja (alcalino), fondo con coloración amarilla (ácido),
generación de gas y generación de H2S; F) Un pico de flauta con coloración roja (alcalino) y fondo sin cambios.

Prueba de licuefacción de la gelatina

Las enzimas capaces de producir gelatinólisis se denominan gelatinasas. Estas enzimas proteolíticas son
importantes factores de virulencia de algunos microorganismos. Las proteínas naturales son demasiado grandes
para entrar en una célula bacteriana; por ende, para que una célula pueda usar las proteínas, éstas primero deben
ser catabolizadas a componentes más pequeños (primero a polipéptidos y después a aminoácidos). Ciertas
bacterias segregan gelatinasas exocelulares para degradar las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación
bacteriana.

Fundamento:
La gelatina, una proteína derivada del colágeno animal, se incorpora a diferentes medios de cultivo para
determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas proteolíticas (proteinasas), detectadas por
digestión o licuefacción de la gelatina.

Metodología:
1.- Etiquetar correctamente los tubos (nombre del medio, microorganismo o grupo control, grupo, equipo y fecha).
2.- Esterilizar el asa bacteriológica.
3.- Inocular una porción de una colonia aislada del microorganismo proporcionado mediante la técnica de punción
(por picadura) hasta las 2/3 partes de profundidad del tubo, para ello utilizar el asa recta.
4.- Los tubos inoculados se incuban a 37°C 18 a 24 h.
5.- Después del tiempo de incubación del paso 4, sacar de la incubadora y colocar los tubos en el refrigerador por
10 minutos.
6.- Anotar los resultados obtenidos.

Interpretación de resultados:
Observar si hay licuefacción de la gelatina (es decir, si ésta es líquida) lo cual indicaría una prueba positiva, si la
gelatina se solidifica indica una prueba negativa.

Desaminación y descarboxilación de aminoácidos en medio LIA (Lysine Iron Agar)

Esta prueba se utiliza para determinar si un bacilo gramnegativo descarboxila o desamina la lisina y forma ácido
sulfhídrico (H2S). El agar lisina hierro (LIA) contiene lisina, peptonas, una pequeña cantidad de glucosa, citrato
amónico férrico y tiosulfato de sodio.

Fundamento:
Cuando se produce la fermentación de la glucosa en el fondo del medio se acidifica (amarillo). Si el
microorganismo produce lisina descarboxilasa se forma cadaverina, que neutraliza los ácidos orgánicos formados
por la fermentación de la glucosa, y el fondo del medio vuelve al estado alcalino (violeta). Si no se produce
descarboxilasa el fondo permanece ácido (amarillo). Si hay desaminación oxidativa de la lisina se forma un
compuesto que, en presencia de citrato amónico férrico y una coenzima, flavina mononucleótido, produce un
color borgoña en el agar inclinado. Si la desaminación no tiene lugar la superficie del agar inclinado conserva su
color violeta.

Metodología:
1.- Etiquetar correctamente los tubos (nombre del medio, microorganismo o grupo control, grupo, equipo y fecha).
2.- Esterilizar el asa bacteriológica.
3.- Sembrar en la parte inferior del tubo una porción de una colonia aislada del microorganismo proporcionado
mediante la técnica de punción (por picadura) y por estría en la porción de pico de flauta. Para ello se debe utilizar
el asa recta, introduciéndolo en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con un movimiento en “S”
(ambas inoculaciones con la misma muestra).
4.- Los tubos inoculados se incuban a 37°C 18 a 24 h.
5.- Anotar los resultados obtenidos.

Interpretación de resultados:
*Decarboxilación de la lisina y falta de fermentación de la glucosa (Figura 4):
Superficie alcalina / profundidad alcalina (pico violeta / fondo violeta) [K/K]

*Fermentación de la glucosa (Figura 4):

Superficie alcalina /profundidad ácida (pico violeta / fondo amarillo) [K/A]

*Estos patrones pueden acompañarse de un precipitado negro que indica la producción de H 2S (Figura 4).

Desaminación de la lisina y fermentación de la glucosa (Figura 4):

Superficie rojiza / profundidad ácida (fondo amarillo) [R/A]
Resultado negativo: La superficie no tiene cambios

Figura 4. A) Alcalino en superficie/alcalino en profundidad (K/K); B) alcalino en superficie/alcalino en

profundidad, H2S positivo (K/K, H2S+); C) alcalino en superficie/ácido en profundidad (K/A); D) rojo en
superficie/ácido en profundidad (R/A); E) Tubo sin sembrar.

Prueba de catalasa

El peróxido de hidrógeno (H2O2) es un producto final oxidativo de la degradación aerobia de los azúcares. Las
catalasas eliminan el H2O2 descomponiéndolo en oxígeno y agua, por lo que esta enzima es esencial en la defensa
biológica contra las formas tóxicas del oxígeno. La catalasa está presente en la mayoría de las bacterias aerobias
y anaerobias facultativas que contienen citocromos; las excepciones principales son las especies de Streptococcus,
que carecen de catalasa.

Fundamento:
Los microorganismos que presentan la enzima catalasa son capaces de descomponer el H 2O2 adicionado en la
prueba en agua y oxígeno, en el cual éste último es observable debido a la generación de burbujas.

Metodología:
1.- Etiquetar correctamente un portaobjetos limpio (a un costado anotar el microorganismo utilizado o grupo
control).
2.- Esterilizar el asa bacteriológica, una vez que el asa esté “frío”, colocar una porción de una colonia aislada
obtenida en el cultivo del medio TSI en el portaobjetos.
3.- Adicionar dos gotas de H2O2.
4.- Anotar los resultados obtenidos (no demorar la observación ya que se pueden producir falsos positivos).

Interpretación de resultados:
La presencia de burbujas indica una prueba positiva. La ausencia de burbujas indica una prueba negativa (Figura
5).
 A

Figura 5. A) Prueba negativa, ausencia de burbujas; B) Prueba positiva, presencia de burbujas.

Prueba de citrato de Simmons

Esta prueba se usa para determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar citrato de sodio como única
fuente de carbono y sales inorgánicas de amonio como única fuente de nitrógeno.

Fundamento:
El metabolismo del citrato comprende una condensación de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para e ntrar
en el ciclo de Krebs. El desdoblamiento del citrato comprende un sistema enzimático sin la intervención de la
coenzima A. La enzima implicada en el metabolismo del citrato se denomina citritasa o citrato desmolasa
produciéndose oxalacetato y acetato. Sin embargo, los productos finales del metabolismo del citrato dependen
del pH del medio:

pH básico: Citrato CO2 + ácido fórmico + 2 ácido acético

pH ácido: 2 Piruvato acetato + CO2 + lactato

2 Piruvato acetoína + 2CO2

El medio comienza a alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar
carbonato, un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de
pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH >
de 7.6).

Metodología:
1.- Etiquetar correctamente los tubos (nombre del medio, microorganismo o grupo control, grupo, equipo y fecha).
2.- Esterilizar el asa bacteriológica.
3.- Sembrar una porción de una colonia aislada del microorganismo proporcionado mediante la técnica de estría
simple sólo en la porción de pico de flauta, para ello utilizar el asa recta.
4.- Los tubos inoculados se incuban a 37°C 24 h hasta 7 días.
5.- Anotar los resultados obtenidos.

Interpretación de resultados:
La prueba positiva presenta una coloración azul. Si existe crecimiento aún sin cambio de coloración en el medio,
la prueba también se considera positiva. La prueba negativa no presenta crecimiento y permanece el medio de
color verde (Figura 6).

Figura 6. A) Prueba positiva (azul); B) Prueba negativa (verde).

Prueba de Rojo de Metilo

Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de generar y mantener productos finales
ácidos estables por fermentación de la glucosa y para superar la capacidad amortiguadora del sistema.

Fundamento:
Permite detectar aquellas bacterias que siguen la vía de fermentación de la glucosa a través de la vía ácida mixta,
produciendo la cantidad de ácido suficiente como para mantener el pH por debajo de 4.4 (el valor crítico de color
de ácido del indicador rojo de metilo).

Metodología:
1.- Etiquetar correctamente los tubos (nombre del medio, microorganismo o grupo control, grupo, equipo y fecha).
2.- Esterilizar el asa bacteriológica.
3.- A partir de la suspensión bacteriana proporcionada, inocular en caldo Rojo de metilo.
4.- Los tubos inoculados se incuban a 37°C por 48 h.
5.- Adicionar 5 gotas del reactivo Rojo de metilo (no agitar).
6.- Anotar los resultados obtenidos.

Interpretación de resultados:
Un color rojo brillante indica un resultado positivo (Figura 7A).
Un color rojo anaranjado indica un resultado positivo débil.
Un color amarillo indica un resultado negativo (Figura 7B).

Figura 7. A) Resultado positivo, coloración roja; B) Resultado negativo, coloración amarilla.

Prueba de la ureasa

Para determinar la presencia de la enzima ureasa se inocula un microorganismo en un caldo o un agar que contenga
urea como fuente principal de carbono y se detecta la producción de amoníaco. La prueba de la ureasa ayuda a
identificar ciertas especies de Enterobacteriaceae, como especies de Proteus y otras bacterias importantes como
Corynebacterium urealyticum y Helicobacter pylori.

Fundamento:
La enzima ureasa producida por el microorganismo actúa sobre la urea presente en el medio, lo que genera la
formación de amoníaco, agua y dióxido de carbono. El amoníaco producido provoca un aumento en el pH del
medio, por lo que su presencia se detecta con facilidad con un indicador de pH.

Metodología:
1.- Etiquetar correctamente los tubos (nombre del medio, microorganismo o grupo control, grupo, equipo y fecha).
2.- Esterilizar el asa bacteriológica.
3.- Sembrar una porción de una colonia aislada del microorganismo proporcionado mediante estría simple en la
porción de pico de flauta, o bien si se proporciona caldo urea sembrarla en este medio.
4.- Los tubos inoculados se incuban a 37°C por 24 a 72 h.
5.- Anotar los resultados obtenidos.

Interpretación de resultados:
Un cambio de color del naranja-pálido al rojo fucsia indica un resultado positivo (Figura 8A).
Si no existe cambio en la coloración del agar, el resultado se considera negativo (Figura 8B).

A B

Figura 8. A) Prueba de la ureasa negativa (sin cambio de color); B) Prueba de la ureasa positiva (cambio de color
del naranja-pálido al rojo fucsia).

Prueba de motilidad-indol-ornitina (MIO)

La prueba MIO se utiliza para la identificación de Enterobacterias, sobre la base de la movilidad (motilidad), la
producción de ornitina descarboxilasa e indol. La movilidad se puede detectar empleando tubos con agar
semisólido, ya que permite una libre diseminación de los organismos.

Fundamento:
Motilidad. La movilidad bacteriana es otra característica importante en la identificación de una especie, las
bacterias se mueven por medio de flagelos, cuyo número y ubicación varia en las diferentes especies.
Prueba de Indol. Las bacterias que producen la enzima triptofanasa pueden degradar el aminoácido triptófano en
ácido pirúvico, amoníaco e indol. Este último se detecta por la reacción con el grupo aldehído del indicador
paradimetilaminocinamaldehído al 1%, que origina un color rojo fucsia brillante.
Descarboxilación de la ornitina. Existen enzimas capaces de descarboxilar el aminoácido L-ornitina con la
liberación de la diamina putrescina y dióxido de carbono como productos. Para medir esta propiedad se detecta
la generación del pH alcalino en el medio, o en la determinación directa de productos de la reacción.

Metodología:
1.- Etiquetar correctamente los tubos (nombre del medio, microorganismo o grupo control, grupo, equipo y fecha).
2.- Esterilizar el asa bacteriológica.
3.- Inocular una porción de una colonia aislada del microorganismo proporcionado mediante la técnica de punción
(por picadura) hasta las 2/3 partes de profundidad del tubo, para ello utilizar el asa recta.
4.- Los tubos inoculados se incuban a 37°C por 24 a 48 h.
5.- Pasado el tiempo de incubación, hacer primero la interpretación de resultados para la prueba de movilidad y
descarboxilación de ornitina.
6.- Para la lectura de la prueba de indol adicionar 0.5 ml del Reactivo de Kovacs.
7.- Anotar los resultados obtenidos.

Interpretación de resultados:
La interpretación se realiza en el siguiente orden:
Movilidad
Positivo: Se observa diseminación a partir de la línea de siembra (turbidez) (Figura 9A).
Negativo: Crecimiento sobre la línea de siembra, no se observa diseminación (Figura 9B).

A B

Figura 9. A) Prueba de motilidad (MIO) positiva; B) Prueba de motilidad (MIO) negativa.

Descarboxilación de ornitina
Positivo: Se observa una coloración púrpura (Figura 10)
Negativo: Se observa un color amarillo, pero a veces se observa color violáceo en la superficie del medio.
Figura 10. Prueba de descarboxilación de ornitina positiva (desarrollo de color color púrpura).

Presencia de Indol
Positivo: Desarrollo de un anillo color rosado a rojo oscuro tras el agregado del reactivo (Figura 11A).
Negativo: No hay cambio de color tras el agregado del reactivo (Figura 11B).

Figura 11. A) Prueba del Indol positiva (generación de un anillo color rosa); B) Prueba del Indol negativa (sin
cambio de color).

Sesión 2:

Realice la interpretación de las pruebas faltantes de acuerdo a los tiempos señalados para cada prueba bioquímica.

RESULTADOS

Anotar los resultados en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1. Características coloniales y morfológicas.

Nombre del Características coloniales Características celulares Tinción Gram
microorganismo

Tabla 2. Resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas.

Nombre de la prueba Observaciones (coloración, generación Interpretación (positivo o
bioquímica de precipitado, generación de halo, negativo)
turbidez, etc.)
Hidrólisis de almidón
 Prueba en agar triple azúcar y
hierro (MedioTSI)
Prueba de licuefacción de la
Gelatina
Desaminación y
descarboxilación de
aminoácidos en medio LIA
(Lysine Iron Agar)

Prueba de catalasa

Prueba de Citrato de Simmons

Prueba de Rojo de metilo

Prueba de la Ureasa

Prueba de motilidad

Prueba de descarboxilación de
la ornitina
Prueba de Indol

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Con base a la morfología microscópica y colonial observada, a los fundamentos y resultados de las pruebas
bioquímicas realizadas, discutir la identidad del microorganismo proporcionado. Así mismo discutir la
importancia en la selección de pruebas bioquímicas para la identificación de un microorganismo de acuerdo a las
Tablas 1 y 2 y a la bibliografía consultada.

CONCLUSIONES
Elaborar una conclusión puntual con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos y a la
bibliografía consultada.

CUESTIONARIO
1.- Explicar porqué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se emplea un
indicador de pH, cual es el indicador y cuál es su intervalo de sensibilidad.
2.- ¿Cómo se detectan los productos de la degradación de los aminoácidos: arginina, lisina y ornitina?

REFERENCIAS
1. Forbes, Sahm, Weissfeld. Bailey & Scott Diagnóstico Microbiológico. Doceava Edición. Editorial Médica
Panamericana (2007).
2. MacFaddin. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias. Tercera Edición. Editorial Médica
Panamericana (2000).
3. Winn, Allen, Janda, Koneman, Procop, Schreckenberger, Woods. Koneman Diagnóstico Microbiológico.
Texto y atlas color. Sexta Edición. Editorial Médica Panamericana (2006).

Anexo

En la Tabla 3, se muestra algunos resultados de pruebas bioquímicas para algunos microorganismos.

Tabla 3. Características claves de identificación para las Enterobacterias más frecuentes.