Anexo II - Pruebas de Identificación

C.F.G.
S: Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad Módulo: Ensayos Microbiológicos
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
BACTERIANA
Anexo II
1
C.F.G.S: Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad Módulo: Ensayos Microbiológicos
1. METABOLISMO HIDROCARBONADO ................................................................................ 3

1.1. PRUEBA DE LA -D GALACTOSIDASA (ONPG) ......................................................... 3
1.2. PRUEBA DE OXIDACIÓN/FERMENTACIÓN (HUGH LEIFSON) ................................ 5
1.3. PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE AZÚCARES ........................................................... 6
1.4. PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE LACTOSA .............................................................. 6
1.5. PRUEBA DE MANITOL SAL ........................................................................................... 7
1.6. PRUEBA DE BILIS ESCULINA ....................................................................................... 7
2. METABOLISMO PROTEICO.................................................................................................. 7
2.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO .................................................................... 7
2.2. PRUEBA DE LAS DESCARBOXILASAS ........................................................................ 9
2.3. PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE GELATINA ................................................................... 12
3. PRUEBAS ENZIMÁTICAS ................................................................................................... 13
3.1. OXIDASA........................................................................................................................ 13
3.2. CATALASA .................................................................................................................... 15
3.3. COAGULASA ................................................................................................................. 16
3.4. DNasa. PRUEBA DE LA DESOXIRRIBONUCLEASA .................................................. 17
3.5. REDUCCIÓN DE NITRATOS ........................................................................................ 18
3.6. UREASA ......................................................................................................................... 20
3.7. FENILALANINA DESAMINASA .................................................................................. 21
3.8. PRUEBA DE TRIBUTIRINA ESTERASA ...................................................................... 23
4. OTRAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA ................................................. 23
4.1. HEMÓLISIS .................................................................................................................... 23
4.2. CAMP TEST .................................................................................................................... 23
4.3. PRUEBA DE MOVILIDAD ............................................................................................ 24
5. PRUEBAS BIOQUÍMICAS SIMULTÁNEAS........................................................................ 25
5.1. MACROTÉCNICAS ........................................................................................................ 25
5.1.1. Agar-hierro-Kligler (KIA) ......................................................................................... 25
5.1.2. IMViC ....................................................................................................................... 28
Anexo II
2
1. METABOLISMO HIDROCARBONADO
1.1. PRUEBA DE LA -D GALACTOSIDASA (ONPG)
Esta prueba se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de fermentar la lactosa. Los
microorganismos que fermentan la lactosa poseen dos enzimas específicos uno es la lactosa
permeasa que está en la membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a través de la
membrana celular. El otro enzima es -D-galactosidasa que está localizado en el interior de la
célula y desdobla la lactosa en glucosa y galactosa.
Fundamento:
Los microorganismos, según fermenten o no la lactosa, se pueden clasificar en:
• Fermentadores activos de lactosa en 24 horas, los cuales poseen ambos enzimas.

• No fermentadores de lactosa, carecen de ambos enzimas, no degradan la lactosa, no
penetra en la célula la lactosa.
• Fermentadores tardíos de lactosa, poseen el enzima -D-galactosidasa son capaces de
permeabilizar ligeramente la lactosa con concentraciones altas de lactosa y fermentarla en 2-
15 días.
La aplicación fundamental es la diferenciación de enterobacterias: Escherichia (+), Serratia (+),

Yersinia (+), Proteus (-), Salmonella (-), excepto S. arizonae, Klebsiella (+), excepto K.
rhinoscleromatis, Shigella (+) y Enterobacter (+).
Para detectar en los microorganismos el enzima -D-galactosidasa se utiliza un compuesto similar a

la lactosa, pero en su fórmula molecular se ha sustituido la glucosa por el orto-nitrofenol; éste, al
liberarse al medio alcalino por acción del enzima -D-galactosidasa, si lo hubiera en el
microorganismo, produce un color amarillo.
El compuesto empleado se llama orto-nitrofenil- -D-galactopiranósido (ONPG).
Material:
• Dos tubos de ensayo estériles.

• Baño o estufa a 37°C.
• Asa.
Reactivos:
• Disolución tamponada a pH = 7 de ONPG.

Anexo II
3
• Disolución fisiológica estéril.

• Tolueno.
• Microorganismo.
Técnica
a) Preparar una suspensión densa del microorganismo a partir de un cultivo puro en 0,5 ml
de suero fisiológico estéril.
b) Liberar la -D-galactosidasa de las bacterias. Para ello se añade una gota de tolueno a la
suspensión y mezclar vigorosamente durante unos segundos.
c) Añadir 0,5 ml de la disolución tamponada de ONPG, mezclar.
d) Incubar a 37°C y leer antes de 24 horas.
e) Debe utilizarse un inóculo concentrado para que exista una concentración alta de enzima
y aumentar la velocidad de reacción.
f) Es importante que la disolución de ONPG sea incolora y por ello debe prepararse en el
momento y controlarse con controles positivos y negativos, pueden usarse los siguientes:
• Control positivo: Escherichia coli.

• Control negativo: Proteus spp.
g) La disolución debe guardarse en frascos de color topacio a una temperatura de 4°C pues
es fácilmente desestabilizable.
h) Antes de usarse se debe atemperar en un baño a 37°C para que se disuelvan los fosfatos
que cristalizan durante la conservación.
i) La disolución de ONPG se puede sustituir por tabletas o discos comerciales.
j) Los microorganismos que se ensayan deben estar incubados en un medio con lactosa, por
ejemplo, agar hierro Kligler.
Interpretación de los resultados:
• ONPG positivo: amarillo. En la mayoría de los microorganismos a los 60 minutos.

• ONPG negativo: incoloro. No se puede interpretar antes de 24 horas.
De forma alternativa se pueden emplear discos comerciales impregnados en ONPG y se realiza la

prueba como indica el esquema de la figura de abajo:
Anexo II
4
1.2. PRUEBA DE OXIDACIÓN/FERMENTACIÓN (HUGH LEIFSON)
Prueba para la diferenciación de bacilos Gram negativos, basada en la determinación del

metabolismo oxidativo y/o fermentativo de los carbohidratos. El azul de bromotimol del medio
permite identificar las variaciones del pH. Los ensayos se hacen por duplicado en dos tubos, uno
cubierto con aceite de vaselina (F) y otro sin (O). Además del cambio de color del indicador (de
verde a amarillo) es necesario observar la producción de gas y el tipo de crecimiento obtenido. Al
medio se le añade el carbohidrato a estudiar en una concentración del 1%.
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar un tubo (O) y otro (F) por picadura a partir de un cultivo puro de la cepa que se
desea estudiar.
2. Incubar a 37ºC durante 24-48 horas.
3. Los microorganismos fermentadores dan reacción en los dos tubos. Los oxidativos sólo en
el tubo sin vaselina. La degradación oxidativa (color amarillo) sólo se observa en la parte
más cercana a la superficie del tubo mientras que en la fermentativa, se observa el color
amarillo, en toda la columna del medio. Los inactivos no provocan cambio en ningún tubo.
4. También puede observarse si la cepa en estudio es inmóvil (crecimiento sólo en el canal de
picadura) o móvil, (turbidez en toda la columna con medio).
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
CON CON CON
MICROORGANISMO GLUCOSA LACTOSA SACAROSA
O F O F O F
Escherichia coli AG AG AG AG K K Especie
fermentativa
Pseudomonas aeruginosa A K K K K K Especie
oxidativa
Salmonella enteritidis AG AG K K K K Especie
fermentativa
K = alcalino, verde (sin cambio)
G = gas, observable a veces
A = ácido, amarillo
Anexo II
5
1.3. PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE AZÚCARES
Prueba para la determinación del metabolismo fermentativo de los carbohidratos. El rojo de fenol
del medio permite identificar las variaciones del pH. Además del cambio de color del indicador (de
rojo a amarillo) se puede observar la producción de gas. Al medio se le añade el carbohidrato a
estudiar en una concentración del 1%.
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar un tubo con caldo rojo fenol y campana Durham, a partir de un cultivo puro de la
cepa que se desea estudiar.
2. Sellar con parafina estéril.
3. Incubar a 37ºC durante 18-24 horas.
4. Los microorganismos fermentadores virarán el medio a color amarillo. La producción de gas
se observa en la campana Durham.
1.4. PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE LACTOSA
Siembra en agar McConkey. Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el
crecimiento de las bacterias Gram positivas. Por la presencia de la lactosa, las bacterias capaces de
fermentarla acidifican el medio, cambiando el color del rojo neutro y formando colonias rojas o
rosadas, pudiendo presentar un halo turbio correspondiente al precipitado biliar. Las bacterias
lactosa-negativas dan colonias incoloras. El indicador de pH es el rojo neutro.
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar en superficie un inóculo de la muestra.

2. Incubar durante 18-24 horas a 37°C.
3. Si se observan colonias de color rojo al acidificarse el medio, la prueba resulta positiva.
Anexo II
6
18-24 horas
agar McConkey colonias rojas (+)
37ºC
1.5. PRUEBA DE MANITOL SAL
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de

estafilococos. Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina (7,5%).
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol acidificando el medio; las colonias
aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan
colonias rodeadas de una zona roja o púrpura. El medio lleva rojo fenol como indicador de pH.
PROCEDIMIENTO
4. Sembrar en superficie un inóculo denso de la muestra.

5. Incubar durante 18-24 horas a 35-37°C, en aerobiosis.
6. Si se observan colonias de color amarillo al acidificarse el medio, la prueba resulta positiva.
18-24 horas
agar manitol colonias amarillas (+)
salado 35-37ºC
1.6. PRUEBA DE BILIS ESCULINA
Este es un medio medio diferencial para enterococos, la presencia de la bilis de buey no inhibe el
crecimiento de los enterococos, pero sí el del resto de las bacterias gram positivas. Esta
característica junto con la capacidad de hidrolizar la esculina (carbohidrato unido a un compuesto
aromático) son propiedades constantes de los enterococos. El producto resultante de la hidrólisis de
la esculina es la esculetina que forma un complejo con el citrato de hierro (III) de un color pardo
oscuro, produciendo el oscurecimiento del medio.
1. El medio se puede emplear en placas o en tubos, en este caso solidificándolo en plano

inclinado.
2. Incubar entre 35º y 37ºC de 18 a 24 horas.
3. Se acepta que la prueba es negativa, si no hay oscurecimiento del medio después de 3 días
de incubación.
18-24 h
(hasta 3 días)
medio oscurecido (+)
35-37ºC
2. METABOLISMO PROTEICO
2.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO
Anexo II
7
Algunos microorganismos actúan metabolizando proteínas con aminoácidos azufrados, cistina,

cisteína, de forma que liberan azufre en forma de ácido sulfhídrico gas (H 2S).
El gas es detectado por medio de una prueba de detección de ácido sulfhídrico gas.
Fundamento:
Se observará si se ha liberado ácido sulfhídrico.
Aplicaciones: diferenciación de Brucella y Proteus.
B. abortus (variable)
B. suis (variable)
B. melitensis (-)
B. ovis (-)
P. mirábilis (+)
P. vulgaris (+)
P. morganii (-)
P. rettgeri (-)
Diferenciación de Pseudomonas putregaciens (+) de otros Pseudomonas (-).
El microorganismo debe poseer enzimas específicos (desulfurasas) capaces de actuar sobre los
aminoácidos azufrados.
Bacteria con enzimas desulfurasas + indicador + fuente de azufre + H + H2S gas
H2S gas + indicador Precipitado negro insoluble (FeS)
La bacteria problema va a utilizar la glucosa del medio produciendo ácidos que bajan el pH. Al
bajar dicho pH se activa el enzima desulfurasa que poseen las bacterias y actúa sobre los
aminoácidos azufrados de dicho medio de cultivo produciendo H2S. Este gas reaccionará con el
indicador de pH (sales de hierro principalmente), formándose un precipitado negro, lo que indicará
que la prueba H2S es positiva.
Se observará igualmente que la temperatura de incubación no sea superior a 37ºC pues se inhibiría
la producción de ácido sulfhídrico.
Material:
Tubo de ensayo.
Hilo de siembra.
Pipeta 10 ml.
Tapón.
Mechero.
Estufa de cultivo.
Reactivos:
Agar con hierro y peptona (AHP).

Microorganismo.
Anexo II
8
Técnica:
a) A partir de un cultivo puro y reciente del microorganismo problema se tomará una muestra
con un hilo.
b) Sembrar en picadura en un tubo con medio (AHP).
c) Incubar a 37 ºC durante 18-24 horas.
Sulfhídrico positivo: se observa a lo largo de la línea de inoculación ennegrecimiento del

medio.
Sulfhídrico negativo: no se ennegrece el medio.
Si la técnica se realiza con Brucella se debe incubar con una atmósfera de CO2.
Existen medios utilizados para varias pruebas a la vez y llevan elementos necesarios para la
producción de ácido sulfhídrico. Se verá posteriormente en pruebas bioquímicas simultáneas. (Agar
hierro-Kligler).
2.2. PRUEBA DE LAS DESCARBOXILASAS
Las descarboxilasas son enzimas que actúan sobre el grupo carboxilo de los aminoácidos lisina,
ornitina, arginina, para formar aminas y se desprende CO2, este proceso se realiza en anaerobiosis.
Cada descarboxilasa actúa sobre un aminoácido específico, así la lisina descarboxilasa, LDC, es el
enzima que actúa sobre la L-lisina obteniéndose cadaverina y CO2.
LDC
L-lisina  cadaverina + CO2
La ornitina descarboxilasa, ODC, es e1 enzima que actúa sobre la L-ornitina de la siguiente manera:
ODC
L-ornitina  putrescina + CO2
Anexo II
9
La arginina deshidrolasa, ADH, es el enzima que cataliza la hidrólisis de la L-arginina obteniéndose

L-citrulina más amoníaco, para posteriormente sufrir una descarboxilación en la L-citrulina
formándose putrescina más CO2.
ADH
L-arginina  L-citrulina + NH3  putrescina +CO2
En todas estas reacciones se desprende CO2, y se alcaliniza el medio.
Fundamento:
Estas pruebas se aplican para la identificación de enterobacterias, se pueden realizar por separado o
simultáneamente.
Cuando se procede al cultivo, todas las enterobacterias fermentarán la glucosa y el pH del medio
bajará. A partir de aquí, si son capaces de descarboxilar los aminoácidos, volverá a subir el pH del
medio, por lo que el indicador de pH recupera el color púrpura. Los tubos positivos tomarán un
color púrpura mientras que los tubos negativos serán amarillos.
Para ello se le añade a un medio base con indicador de pH el aminoácido correspondiente al enzima
a investigar.
Material:
• Tubos de ensayo.
• Asa.
Reactivos:
• Caldo de Moeller para descarboxilasas.

• Aminoácidos ensayados en la forma -L.
• Parafina o vaselina estéril.
• Microorganismo.
Técnica:
a) Se preparan cuatro tubos que se rotularán con las letras siguientes:
C (control): 5 ml de caldo Moeller (color rojo púrpura inicial).

L: 5 ml de caldo Moeller + L-lisina al 1%.
O: 5 ml de caldo Moeller + L-ornitina al 1%.
A: 5 ml de caldo Moeller + L-arginina al 1%.
b) Se inoculan los cuatro tubos a partir de un cultivo puro y joven del microorganismo
problema.
c) Se sellan con 2-3 ml de parafina estéril.
d) Incubar a 37°C durante 18-24 horas.
Resultado positivo: tubo control amarillo y tubo con aminoácido rojo púrpura.
Resultado negativo: tubo control amarillo y tubo con aminoácido amarillo.
Anexo II
10
Cuando el microorganismo tiene el enzima capaz de actuar sobre el aminoácido, este aminoácido se
descarboxila y se forman aminas que alcalinizan el medio, con lo que el color amarillo del medio
pasa a rojo púrpura.
El tubo control debe tener un color amarillo después de 18-24 horas de incubación debido a la
fermentación de la glucosa del medio Moeller que acidifica el medio; un color rojo púrpura invalida
la prueba. La utilización del aminoácido específico por la descarboxilasa, dará aminas como
resultado que alcalinizan el medio dando color rojo.
Es importante que el pH del caldo Moeller esté ajustado a 6.
Moeller fue el primero que puso en práctica un ensayo de diferenciación basado en este principio.
Más tarde se fueron desarrollando medios diferenciales de uso corriente conteniendo lisina, ornitina
o arginina según el caso. Por ejemplo el caldo lisina descarboxilasa (indicador de pH púrpura de
bromocresol): lisina descarboxilasa (+) color violeta; lisina descarboxilasa (-) color amarillo.
--------------------------------------------------------------------------------------------------
Lisina descarboxilasa:
Anexo II
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2.3. PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE GELATINA
Se emplea en estudios de microorganismos proteolíticos que degradan la gelatina por la producción

de gelatinasa.
MATERIAL:
1. Tubos de cultivo y tapón.

2. Asa aguja.
3. Pipeta de 10 ml.
4. Mechero.
5. Estufa de cultivo.
REACTIVOS:
1. Gelatina nutritiva.
2. Microorganismos.
TÉCNICA:
1. En dos tubos poner el medio y esterilizar.

2. Sembrar la muestra por picadura en uno de los tubos, el otro se utilizará como control
negativo, se clavará la aguja sin tener microorganismos.
3. Incubar el medio con el microorganismo a estudio a 20-22°C, o bien a la temperatura óptima
para el microorganismo (normalmente 37ºC). Si la incubación se realiza a temperatura
superior a los 20-22°C (la gelatina será líquida) antes de proceder a la lectura los cultivos
deben enfriarse en la nevera para no dar falsos positivos (hasta 20ºC).
4. Cultivar de 1-7 días. Por regla general se aconsejan incubaciones máximas de 14 días con
lecturas cada 3, pero debe tenerse en cuenta que ciertos organismos pueden tardar hasta
varios meses en licuar la gelatina.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
Gelatinasa +: el medio se licua debido a la producción de gelatinasa.

Gelatinasa -: el medio no se licua.
Bacillus subtilis (gelatinasa+); Clostridium perfringens (gelatinasa+); Escherichia coli

(gelatinasa—); Staphylococcus aureus (gelatinasa+).
Anexo II
12
1-7 días enfriar a 20ºC

gelatina medio licuado (+)
nutritiva 10 ml 37ºC
3. PRUEBAS ENZIMÁTICAS
3.1. OXIDASA
Esta denominación se le da de forma genérica al enzima citocromo C oxidasa que participa en la

transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxígeno. La oxidasa se puede definir
como el enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al oxígeno.
O2 H2O
O2 H2O2
Los microorganismos aerobios obtienen su energía por la respiración y la almacenan en forma de

ATP, el oxígeno es reducido a partir de un sustrato orgánico que procede de la nutrición con la
intervención de un sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria,
produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la especie microbiana.
Aplicación:
Detectar en el microorganismo estudiado el enzima citocromo C oxidasa.
Diferenciar:
Enterobacterias que son oxidasa negativa de

Pseudomonas oxidasa positiva
Fundamento:
Se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios

estrictos carecen de ella.
Se determina a través de esta prueba la presencia o ausencia del enzima “citocromo C oxidasa” en
el microorganismo, el cual cataliza el último paso de transferencia de electrones desde un sustrato
orgánico (azúcares, polipéptidos, etc.) al oxígeno.
Para ello se observará el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando está reducido y
coloreado cuando se oxida.
Entre los indicadores más utilizados se encuentra la tetrametilparafenilendiamina, que por acción
del enzima citocromo C oxidasa da un compuesto químico de color azul.
Anexo II
13
citocromo C
e-
forma reducida incolora forma oxidada azul

tetrametilparafenilendiamina
Material:
Pipeta Pasteur.
Pipeta de 10 ml.
Placa Petri.
Asa.
Papel de filtro Whatman nº 1.
Mechero.
Estufa de cultivo.
Reactivos:
Agar sangre.
Reactivo oxidasa de Kovacs.
Los reactivos deben ser recientemente preparados puesto que pierden su eficacia en
disolución rápidamente, pueden conservarse a 4ºC durante 5-10 días.
Técnica:
a) Se cultiva en una placa de Petri con agar sangre el microorganismo problema. Se puede
emplear otro medio que sea más conveniente para el crecimiento del microorganismo
investigado. Los medios que contengan glucosa pueden inducir a falsos resultados negativos
debido a que la fermentación de la glucosa inhibe la actividad de la oxidasa.
b) Sobre una placa Petri vacía y estéril, colocar un trozo de papel de filtro Whatman nº 1 de
unos 6 cm2. La tira de papel de filtro impregnada con reactivo oxidasa de Kovacs se puede
sustituir por discos comerciales ya preparados, aunque antes de utilizarlos se deben
rehidratar con unas gotas de agua destilada.
c) En el centro del papel de filtro dejar caer 2-3 gotas de reactivo oxidasa de Kovacs. No
confundirlo con el reactivo indol de Kovacs.
d) Con un asa se toma una colonia de la placa con el cultivo del microorganismo y se extiende
en el papel.
e) Se lee el resultado a los 5-10 segundos.
f) Se puede realizar esta técnica de otra manera. Añadiendo directamente el reactivo oxidasa
de Kovacs sobre las colonias de la placa Petri con agar sangre.
Oxidasa +: aparece un color azul en el papel, si se desarrolla el color a los 10-60

segundos se considera oxidasa retardado positivo, después es negativo.
Oxidasa -: No se produce color.
Anexo II
14
aparición de color azul (+)
3.2. CATALASA
La catalasa es un enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y

anaerobios facultativos que contienen citocromo.
La catalasa cataliza la reacción siguiente: 2 H2O2 2 H2O + O2 (gas)
El peróxido de hidrógeno es un producto final de la degradación aeróbica oxidativa de los hidratos

de carbono.
La catalasa actúa sobre el peróxido de hidrógeno descomponiéndolo en agua y oxígeno gas. Si se

acumulase el peróxido de hidrógeno en los microorganismos estos morirían, por ello es fundamental
la presencia en los microorganismos de la catalasa.
Aplicaciones:
Diferenciación de: Streptococcus (-) de Staphylococcus (+); Bacillus (+) de Clostridium (-); Listeria
monocytogenes (+) de Erysipelothrix (-).
Fundamento:
Se pondrá en contacto el microorganismo problema con el peróxido de hidrógeno. Si el

microorganismo tiene el enzima catalasa se formará gas O 2. Al reducir la catalasa el peróxido de
hidrógeno.
Material:
Portaobjetos.
Pipeta Pasteur.
Asa.
Mechero.
Reactivos:
Peróxido de hidrógeno al 30%.

Microorganismo.
El peróxido de hidrógeno es inestable, se descompone con la luz, por ello se debe
mantener en frasco opaco en refrigerador.
Técnica:
a) Con un asa se toma una colonia del cultivo del microorganismo de 12-24 horas.
b) Se coloca la colonia de microorganismos en un portaobjetos.
c) Encima del microorganismo, añadir una gota de peróxido de hidrógeno al 30%.
d) Se puede colocar sobre la mezcla un cubreobjetos para facilitar la lectura evitando que
quede aire entre el cubre y portaobjetos.
Anexo II
15
e) No homogeneizar la mezcla microorganismo-peróxido de hidrógeno con el asa de platino

pues reaccionaría el asa de platino catalizando la reacción. El cultivo puro puede estar
inoculado en tubo en agar inclinado. A este tubo se le añade el peróxido de hidrógeno
directamente.
Catalasa +: formación de burbujas de oxígeno inmediatamente.

Catalasa - : No aparecen burbujas.
Se podrán observar falsos resultados positivos si se utilizan medios de cultivo con agar sangre u
otros que lleven hematíes, pues estos medios contienen catalasa.
H2O2
aparición de burbujas de O2 (+)
3.3. COAGULASA
La coagulasa es un enzima producido por algunos microorganismos capaces de coagular el plasma.
Aplicación:
Diferenciación de Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus.
Fundamento:
Observar la coagulación del plasma por acción de la coagulasa al poner en contacto el

microorganismo problema con plasma.
Material:
Tubos de hemólisis.
Asa.
Pipetas de 0,5 ml.
Mechero.
Baño termostatado a 37ºC.
Estufa de cultivo.
Reactivos:
Caldo cerebro corazón (BHI).

Plasma de conejo EDTA reconstituido.
Microorganismo.
Técnica:
a) En un tubo de hemólisis estéril, se ponen 0,3 ml de plasma al que añadimos 0,1 ml de

cultivo joven en medio líquido (BHI) del microorganismo problema. Se pueden añadir 2-3
colonias con asa de cultivo si se parte de un medio sólido y emulsionarlas con el plasma.
b) Mezclar por rotación suave el tubo.
Anexo II
16
c) En baño termostatado incubar a 37ºC y observar cada 30 minutos si se forma el coágulo

inclinando el tubo suavemente. Si a las seis horas no se forma coágulo se deja en la estufa de
cultivo durante 24 horas.
Prueba positiva, coagulasa positiva: formación del coágulo.

Prueba negativa, coagulasa negativa: no se forma coágulo.
0,1 ml
18 – 24 h 0,3 ml plasma de 6h formación

BHI 2 ml 37ºC conejo EDTA coágulos (+)
37ºC
reconstituido
También podemos realizar esta prueba con kits rápidos, por tecnicas de aglutinación que se verán
más adelante.
3.4. DNasa. PRUEBA DE LA DESOXIRRIBONUCLEASA
Esta prueba se utiliza para diferenciar las especies de Staphylococcus aureus, productora
normalmente del enzima desoxirribonucleasa, de otras especies de este género que no la producen.
Fundamento:
Se fundamenta en conocer si el microorganismo objeto de estudio posee enzima

desoxirribonucleasa capaz de despolimerizar a las moléculas de ADN existentes en un medio de
cultivo, con la pérdida de la estructura inicial del medio. Esta despolimerización del DNA se revela
al añadir al medio ácido clorhídrico 1 N, que se mantiene unos minutos.
Reactivos:
Medio agar DNA en placa.

Ácido clorhídrico 1N.
Técnica:
Inoculación: sembrar, a partir de un cultivo joven y puro con colonias aisladas, en el centro de una
placa agar DNA, en forma de estría estrecha.
Incubar a 37ºC durante 24 horas, y añadir sobre el cultivo, de forma que se quede totalmente
cubierto, disolución de HCl 1N. Dejar en reposo durante 3-5 minutos.
Positivo: se observa un halo claro alrededor del crecimiento bacteriano, quedando opaco el resto de
la placa.
Negativo: no se observa zona clara, toda la placa queda opaca.
Anexo II
17
HCl 1N
24 h
agar DNasa agar transparente (+)
37ºC
3.5. REDUCCIÓN DE NITRATOS
La nitratasa o nitrato reductasa es el enzima que cataliza el proceso por el cual los nitratos son
reducidos a nitritos. Está presente en algunos microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos
los cuales utilizan nitrógeno como último aceptor de electrones en el proceso metabólico.
La reacción que se produce es la siguiente:
NO-3  NO-2  N2
nitrato nitrito nitrógeno molecular
Se pueden generar diversos productos finales dependiendo de la especie bacteriana de que se trate,
entre éstos está el amoníaco, nitrógeno molecular, óxido nítrico, óxido nitroso o hidroxilamina.
La prueba consiste en la detección de los productos de reducción cuando estos son liberados al
medio.
Los productos comúnmente liberados al medio son el nitrito y nitrógeno molecular.
Aplicación:
Diferenciación de especies de Haemophilus y Neisseria. Diferenciación de enterobacterias.
Fundamento:
Consiste en la detección de nitritos con un reactivo colorimétrico. Cuando no se forma color al

añadir los reactivos puede significar que:
a) No se ha reducido el nitrato. Para comprobarlo se añade polvo de zinc que actúa como
reductor y se desencadena la reacción colorimétrica.
b) La reducción de nitratos ha sido llevada hasta la formación de nitrógeno molecular; éste
se observa en el interior de la campana de Durham si el medio es líquido o por la aparición
de grietas o burbujas en el caso de que el medio fuera sólido.
c) La reducción de nitratos ha formado otros productos nitrogenados: óxido nítrico,
amoníaco, hidroxilamina, etc.
Material:
• Tubos de cultivo.
• Asa.
• Pipeta de 10 ml.
• Campana de Durham.
• Algodón graso.
• Mechero.
• Estufa de cultivo.
Anexo II
18
Reactivos:
• Caldo con nitrato.

• Reactivo A: alfa-naftilamina al 0,5%.
• Reactivo B: ácido sulfanílico al 0,8%.
• Zinc en polvo.
• Microorganismo.
El polvo de zinc debe estar exento de nitratos.
Los reactivos A y B deben conservarse a 4°C en refrigerador, así son estables tres meses.
El medio de cultivo es un caldo con nitrato cuya composición es la siguiente:
Extracto de carne 3g
Peptona 5g
Nitrato potásico 1g
Agua destilada 1000 ml.
pH 7,2
Este medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es productor de ácido sulfhídrico,
H2S, éste impide la formación de color.
Técnica:
a) Se toma una muestra con el asa a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas.
b) Colocar un tubo de cultivo, con campana Durham, con caldo con nitrato, e inocular con el
microorganismo.
c) Incubar a 37°C durante 12-24 horas.
d) Si hay gas en la campana indica que los nitratos han sido reducidos a N2 y se termina aquí
la prueba.
d) Si no hay gas en la campana, agregar un mililitro de reactivo A y 1 mililitro de reactivo B.
e) Si se formara color rojo o rosado antes de 30 segundos será que los nitratos han sido
reducidos y se termina aquí la prueba.
f) Si no se formara color se añade al tubo 20 miligramos de polvo de zinc.
Esta prueba debe interpretarse muy rápidamente pues el color puede desaparecer.
El medio puede ser también sólido utilizando agar inclinado con nitrato.
Hay tres casos en los que la prueba se considera positiva.
• Cuando aparece color rojo o rosado al añadir el reactivo A y B indica reducción de nitratos
a nitritos.
• Cuando aparece gas en la campana de Durham indica reducción de nitratos a nitrógeno
molecular.
• Cuando al añadir polvo de zinc no se desarrolla color indica formación de otros productos
nitrogenados.
Anexo II
19
La prueba es negativa cuando:
• Se forma color rojo o rosado al añadir polvo de zinc en menos de 30 segundos.
3.6. UREASA
Esta prueba detecta la presencia del enzima ureasa en los microorganismos a través de una prueba
en la que se observa la alcalinización del medio.
La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea dando lugar a carbonato amónico, con lo que el medio se
alcaliniza.
La reacción es la siguiente:
Aplicación:
Diferenciación de Proteus (rápidamente +) de otras enterobacterias (negativo o positivo

retardado).
Diferenciación de Bordetella pertussis (-) de Bordetella parapertussis (+) y Bordetella
bronchiseptica (+).
Diferenciación de Yersinia pestis (-) de Yersinia pseudotuberculosis (+) y Yersinia
enterocolitica (+).
Fundamento:
Observar la alcalinización del medio sólido debido a la formación del carbonato amónico a través
del cambio de color del indicador de pH, por acción de la ureasa sobre la urea.
Anexo II
20
Material:
• Tubos de cultivo.
• Asa.
• Pipeta de 10 ml.
• Algodón graso.
• Mechero.
• Estufa de cultivo.
Reactivos:
• Agar urea de Christensen.

• Microorganismo.
• Se puede utilizar caldo urea de Stuart para obtener medio líquido.
Técnica:
a) Con el asa estéril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24 horas.
b) Sembrar el microorganismo en un tubo con agar urea de Christensen inclinado, (sembrar
la superficie, no la parte profunda).
c) Incubar a 37°C hasta detectar cambio de color del indicador, guardarlo durante 6 días, si
no se produce cambio de color se da como prueba negativa.
Algunas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Brucella requieren 6 días de incubación.
Ureasa positiva: color rojo rosado debido al cambio de color del indicador rojo fenol.
Positiva rápida si tarda menos de 6 horas.
Ureasa negativa: no vira el indicador.
6 h – 6 días si se pone rosa chicle (+)

agar urea (el microorganismo
(medio salmón) 37ºC desdobla la urea)
3.7. FENILALANINA DESAMINASA
Esta prueba se basa en la capacidad que tienen algunas bacterias de desaminar la fenilalanina,
produciendo ácido fenilpirúvico Esta prueba determina la presencia de la enzima fenilalanina. El
género Proteus da positiva esta prueba.
Anexo II
21
Medio de cultivo
DL Fenilalanina 2g
Extracto de levadura 3g
Cloruro sódico 5g
Fosfato sódico 1g
Agar 12 g
pH 7,3
El medio se prepara y se calienta hasta su disolución, se reparte en los tubos y se esteriliza en

autoclave. Se dejan reposar los tubos en posición inclinada, el medio es sólido en tubo.
Reactivos
Disolución ácida de cloruro férrico al 10 %.
Cloruro férrico 10 g
HCl 2,5 ml
Agua destilada csp 100 ml
Inoculación
A partir de un cultivo joven y puro se inocula por estría el pico de flauta del medio, utilizando un
asa.
Incubación
Incubar a 37°C durante 24 horas.
Adición del reactivo
Agregar directamente el reactivo tras la incubación, cuatro o cinco gotas, procurando que se deslice
el reactivo sobre la zona inoculada.
Interpretación de los resultados
En el caso de que la reacción sea positiva aparece una coloración verdosa debido a la
presencia del ácido fenilpirúvico. Si no hay cambio de color la prueba se interpreta como
negativa.
fenilalanina desaminasa FeCl3

fenilalanina fenilpirúvico compuesto verde oscuro
NH3
24 h FeCl3 10%
verde oscuro (+)
37ºC 2 gotas
Anexo II
22
3.8. PRUEBA DE TRIBUTIRINA ESTERASA
Se investiga la presencia de la enzima tributirina esterasa, lipasa que produce la hidrólisis de la

tributirina (gliceril tributirato).
1. Sembrar el microorganismo en estudio en una placa de Petri con agar tributirina (siembra
aislamiento).
2. Incubar las placas de agar tributirina a 30ºC durante 3 días y observar si las colonias
presentan halo de aclaración.
3 días
agar halo aclaramiento (+)
tributirina 30ºC
4. OTRAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
4.1. HEMÓLISIS
La modificación del entorno colonial más significativa es la hemólisis producida en agar sangre
(presencia de una zona de eritrocitos lisados alrededor de una colonia). Es un dato que resulta muy
útil en la identificación inicial de ciertas bacterias, sobre todo estreptococos.
Pueden distinguirse tres tipos de hemólisis:
• Hemólisis alfa ( ): la colonia está rodeada de una zona de eritrocitos parcialmente lisados
(lisis incompleta), frecuentemente acompañada por una coloración marrón-verdosa o
parduzca.
• Hemólisis beta ( ): en este caso está rodeada de una zona clara, del color del medio base,
lo que indica lisis completa de los eritrocitos.
• Hemólisis gamma ( ): no se observa hemólisis aparente.
24 h
agar sangre agar transparente (+)
37ºC
4.2. CAMP TEST
Esta prueba se utiliza para diferenciar Listeria monocytogenes (única patógena para el hombre) de
otras especies de Listeria (L. innocua). Este grupo bacteriano elabora una -hemolisina que tiene
una acción sinérgica con la producida por Staphylococcus aureus. Esta acción es la base de la
prueba diagnóstica CAMP. También se utiliza en la diferenciación de especies de estreptococos
(Streptococcus agalactiae).
Se siembra en forma de línea recta, en placas de agar sangre, un cultivo de Staphylococcus aureus
utilizando un asa de inoculación o un alambre mantenido en ángulo recto al agar.
Anexo II
23
Sembrar la cepa a analizar en ángulo recto a la estría de Staphylococcus aureus sin que lleguen a
tocarse, y se encuentren como mínimo separados de 1 mm a 2 mm (se pueden sembrar varias cepas
a analizar en una misma placa).
Incubar a 37°C durante 18 a 24 h. La reacción se considera positiva cuando se observa una zona de
-hemólisis acentuada en la intersección de la cepa ensayada con el cultivo de Staphylococcus
aureus.
Las cepas de L. monocytogenes son CAMP test positiva, lo que nos permitiría diferenciarla de otras
especies de Listeria, excepto de L. seeligeri que también da una reacción positiva.
NOTA: No todas las cepas de S. aureus son válidas para la prueba de CAMP, para ello se necesita
una cepa -hemolítica de S. aureus.
Existen algunas cepas poco frecuentes de L. monocytogenes que no muestran -hemólisis o

reacción positiva al ensayo de CAMP.
4.3. PRUEBA DE MOVILIDAD
Se puede realizar en un medio semisólido en tubo donde las bacterias con capacidad de movimiento
se difundirán a partir de la línea de inóculo dando lugar a un enturbiamiento homogéneo debido a la
distribución aleatoria de los microorganismos. Al contrario las bacterias inmóviles permanecerán en
la misma línea de aplicación.
También se puede ver la movilidad haciendo una siembra del microorganismo en BHI e incubarlo
4-6 horas a temperatura ambiente. Examinar en gota pendiente. Si es necesario volver a examinar a
las 18 horas.
Anexo II
24
5. PRUEBAS BIOQUÍMICAS SIMULTÁNEAS
5.1. MACROTÉCNICAS
Existen sistemas multipruebas que permiten realizar varias pruebas bioquímicas simultáneamente,
facilitando notablemente la identificación del microorganismo. Estos sistemas son los siguientes:
Agar- Hierro- Kliger (KIA)

IMViC
5.1.1. Agar-hierro-Kligler (KIA)
Fundamento:
Se pueden realizar tres pruebas a la vez:
Utilización de azúcares, glucosa y lactosa.

Producción de gas.
Producción de ácido sulfhídrico.
Estas pruebas se utilizan para la identificación de enterobacterias, según su capacidad de

metabolizar o no la lactosa.
Cuando un microorganismo utiliza como fuente primaria de carbono los azúcares, se acidifica el
medio, porque se forman ácidos orgánicos. Si no utilizan o no tienen en el medio hidratos de
carbono, utilizan proteínas que alcalinizan el medio por la formación de aminas. Las proteínas en
condiciones de aerobiosis se metabolizan mejor por la vía de la descarboxilación oxidativa de los
aminoácidos que en anaerobiosis.
Anexo II
25
La glucosa se metaboliza mejor que la lactosa porque la estructura molecular de la glucosa es más
sencilla que la de la lactosa. Para que se metabolice la lactosa, el microorganismo debe tener el
enzima -D galactosidasa.
Material:
Tubos de cultivo.
Hilo o asa.
Pipeta de 10 ml.
Algodón graso.
Mechero.
Estufa de cultivo.
Reactivos:
Agar-hierro-kliger (KIA).
Microorganismo.
Técnica:
a) De una colonia de microorganismo puro y joven, con un asa se recoge el centro de la

colonia.
b) Inocular por picadura y estría un tubo de cultivo con medio KIA en pico de flauta.
c) Incubar 18-24 horas a 37 ºC. Leer justamente a las 18-24 horas, si se leyera antes puede que
no se haya producido la suficiente fermentación de la glucosa y la lactosa para formarse
medio ácido capaz de hacer virar el indicador (rojo de fenol) del medio. Si se leyera más
tarde las 24 horas podría dar un resultado falso alcalino pues el microorganismo habría
utilizado la peptona.
Se observarán los tres parámetros siguientes:
Cambios de pH.
Producción de gas.
Producción de ácido sulfhídrico.
Siempre se pondrá un testigo no inoculado.
Cambios de pH:
Se observan por el cambio de color del medio de cultivo. Aparecen dos partes en el tubo, la
superficial y la interior en el fondo (glucosa) y en la zona inclinada (lactosa) pudiendo ocurrir las
siguientes situaciones:
Fermentación de los azúcares: fermentación solamente de la glucosa; glucosa + lactosa -:

zona profunda amarillo (reacción ácida), zona superficial roja (reacción alcalina). Si
aparece primeramente acidificación del medio por la producción de ácidos a partir de la
glucosa, el medio de cultivo se presenta inicialmente de color amarillo entero, pero
posteriormente aparece el color naranja en la superficie del tubo, debido a la
alcalinización de la superficie del medio causada por las aminas que provienen de la
Anexo II
26
descarboxilación oxidativa de los aminoácidos que forman la peptona. El

microorganismo utiliza primero la glucosa y cuando ésta se ha agotado, utiliza como
fuente de carbono la peptona. Este microorganismo metaboliza la glucosa.
Fermentan glucosa y lactosa +: zona inclinada y zona profunda amarillas. Se acidifica el
medio tanto en la superficie inclinada como en el interior del tubo color amarillo del
medio. Estos microorganismos metabolizan glucosa y lactosa.
No metabolizan ni lactosa ni glucosa: glucosa – y lactosa -: aparece color rojo en el
fondo y en la superficie del tubo inclinado (reacciones alcalinas). En los
microorganismos aerobios el tubo aparece color naranja en la superficie inclinada debido
a la alcalinización del medio ocasionada por la utilización de la peptona, y en la capa
profunda no aparece cambio de color por no poderse desarrollar en ausencia de oxígeno.
En los microorganismos anaerobios facultativos se alcaliniza el medio tanto en la
superficie como en la capa profunda. En estos casos no se metaboliza ni la glucosa, ni la
lactosa pero si la peptona.
Si el microorganismo no utiliza ni glucosa, ni lactosa, ni peptona, no se produce cambio
de color del medio en ninguna zona del tubo. No hay cambio de color en todo el tubo.
Esto significa que no metaboliza ni la glucosa ni la lactosa, ni la peptona. pH inicial =
7,4, color naranja del medio.
Producción de gas:
Aparecen burbujas, agrietamiento o desplazamiento del medio del fondo del tubo,
debido a la formación de hidrógeno y de anhídrido carbónico.
Producción de ácido sulfhídrico H2S:
Se manifiesta por el color negro de la capa profunda, o bien por un anillo negro cerca de
la parte superior de la capa profunda, así como por un precipitado negro en la capa
profunda. El color negro puede enmascarar la acidificación del medio.
Para expresar las reacciones producidas en KIA existe un código que es el siguiente.
REACCIONES GÉNERO
A/A Erwinia
A/A,G Escherichia
K/A Shigella
K/A Yersinia
K/A, G, H2S Edwarsiella
K/A, G, H2S Salmonella
K/A, G, H2S Citrobacter
K/A, G, H2S Proteus
A/A, H2S Klebsiella
A/A, H2S Enterobacter
A/A, H2S Serratia
A/A, H2S Hafnia
Se expresa primero la reacción producida en la superficie inclinada del medio y luego la reacción
producida en la capa profunda de la siguiente manera:
(K/A) = superficie inclinada alcalina/capa profunda ácida

(A/A) = superficie inclinada ácida/capa profunda ácida
Anexo II
27
Los símbolos utilizados para expresar las distintas reacciones son:

A: ácido; K: alcalino; G: gas; H2S: ácido sulfhídrico; SC; sin cambio.
sembrar en 24 h
superficie y fermentación lactosa (amarillo)
KIA 37ºC fermentación glucosa (amarillo)
picadura
color negro (producción de H2S)
grietas (producción de gas)
5.1.2. IMViC
Aunque estas pruebas se hacen de una en una, para dar un resultado certero se deben realizar todas
conjuntamente, la prueba de indol, la de rojo de metilo, la de Voges-Proskauer y la del citrato.
IMViC son las iniciales correspondientes a cuatro pruebas de identificación bioquímica I: prueba
del indol, M: prueba del rojo de metilo, V: Voges Proskauer, C: prueba del citrato.
Anexo II
28
Se emplean en la identificación de las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.
5.1.2.1. Prueba del indol
Fundamento:
Estudia el metabolismo proteico, especialmente la degradación del triptófano por parte de los
microorganismos. Y la capacidad de formar indol y productos indólicos a partir del triptófano.
La molécula de triptófano es un aminoácido que puede ser degradado por medio de un enzima
intracelular llamado triptofanasa y formar varios metabolitos indólicos: indol, escatol, ácido indol-
acético, etc…
Algunas bacterias poseen el enzima triptofanasa capaz de degradar el triptófano y, según la bacteria,
dará como producto uno u otro, indol, escatol, alanina, ácido indolacético.
Material:
Tubos de cultivo.
Algodón graso.
Asa.
Pipeta de 10 ml.
Estufa de cultivo.
Mechero.
Reactivos:
Agua de peptona (AP) o agua de peptona nitrato.

Reactivo indol de Kovacs (paradimetilaminobenzaldehído).
Microorganismo.
Técnica:
Se pueden seguir dos métodos, método de Kovacs o método Ehrlich.
Anexo II
29
Método de Kovacs:
a) En el tubo con agua de peptona se siembra el microorganismo problema. El medio de

cultivo es el agua de peptona, pues este medio tiene triptófano. El medio no debe tener
glucosa, pues la fermentación de la glucosa eleva la acidez del medio y puede inhibirse la
triptofanasa, ya que el enzima triptofanasa, actúa a un pH óptimo de 7,4-7,8.
b) Incubar a 37ºC, durante 24-48 horas.
c) Añadir al cultivo 5 gotas de reactivo indol de Kovacs. El reactivo indol de Kovacs debe ser
fresco, pues con el tiempo cambia el color de amarillo a castaño y pierde sensibilidad. Puede
conservarse en nevera a 4-10ºC algunos días, debe conservarse en frasco color topacio con
cierre hermético.
d) Agitar suavemente el tubo y dejarlo unos minutos en reposo.
24 h 5 gotas
agua anillo rosa (+)
triptona 37ºC Kovacs
2 ml
Indol positivo: aparece un anillo color rojo en la superficie del medio.

Indol negativo: aparece un anillo de color amarillo en la superficie del medio.
Si la reacción diera negativa en un cultivo de 24 horas, debe incubarse otras 24 horas y repetirse la
prueba.
5.1.2.2. Prueba de rojo de metilo
Fundamento:
Muchas bacterias de la familia Enterobacteriaceae con importancia clínica son anaerobios

facultativos. Para obtener la energía necesaria para sus reacciones metabólicas utilizan la
fermentación ácido-mixta de los hidratos de carbono produciéndose ácidos como productos finales
tales como: ácido succínico, ácido acético, alcohol etílico, etc., según el siguiente esquema:
Glucosa Ácido pirúvico Ácido láctico

Ácido fórmico
Acetil coenzima A Ácido succínico
Ácido acético
Alcohol etílico
Mediante esta prueba llamada del rojo de metilo se observa el cambio de color del medio con
indicador (rojo de metilo) debido a la acidificación de éste.
Los microorganismos rojo de metilo positivos acidifican el medio por aparición de ácidos estables.
Los microorganismos rojo de metilo negativos pueden también acidificar el medio pero debido a la
formación de compuestos de amonio procedentes de las proteínas del medio o debido a la nueva
degradación de los ácidos orgánicos.
Anexo II
30
Esta fermentación es característica de las siguientes enterobacterias: Escherichia, Proteus, Yersinia,

Salmonella, Shigella, Vibrio.
Material:
Tubos de cultivo.
Algodón graso.
Asa.
Pipeta de 10 ml.
Mechero.
Estufa de cultivo.
Reactivos:
Medio de Clark y Lubs (MR-VP).

Se puede utilizar otro medio que contenga peptona, 0,5% de glucosa, y tampón fosfato,
si no se dispone de medio de Clark y Lubs.
Disolución de rojo de metilo, se pueden utilizar otros indicadores de pH como rojo fenol,
cuyos intervalos de viraje son 6,8 amarillo-8,4 rojo violeta; azul de bromotimol, 6
amarillo-7,6 azul; púrpura de bromocresol, 5,2 amarillo-6,8 púrpura.
Microorganismo.
Disolución de rojo de metilo:
Rojo de metilo …………… 1g

Alcohol etílico c.s.p ……... 100 ml
Agua de peptona:
Peptona……………………10 g
Cloruro sódico …………… 5 g
Difosfato potásico ………... 5 g
Agua destilada c.s.p ……… 1.000 ml
Técnica:
a) En un tubo de ensayo que contenga medio de Clark y Lubs se siembra el microorganismo

problema. El aumento de la concentración de glucosa no acelera la reacción.
b) Se incuba a 37ºC durante 48-72 horas. Se debe incubar al menos 48 horas, pues tiene que
transcurrir un tiempo hasta que los microorganismos fermenten toda la glucosa y formen los
ácidos estables. En un tiempo de 18-24 horas de incubación los resultados serán falsamente
positivos ya que no habrán tenido tiempo para metabolizar los productos ácidos iniciales
procedentes de la fermentación de la glucosa.
c) A este cultivo se le añaden unas gotas (5) de indicador rojo de metilo u otro cuyo intervalo
de viraje sea apropiado. El rojo de metilo a pH = 4,5 es de color rojo, a pH 6,3 es amarillo.
Cambiará de color cuando el pH del medio sea inferior a 4,5.
d) Leer después de añadir el indicador.
Anexo II
31
48 h 5 gotas rojo (+)

Clark- 37ºC rojo metilo
Lubs 2 ml
Rojo de metilo positivo: medio rojo fuerte.

Rojo de metilo negativo: medio amarillo.
5.1.2.3. Prueba de Voges Proskauer
Fundamento:
El fundamento de la reacción es la fermentación butanodiólica también llamada butilenglicólica o

acetoínica.
Glucosa ácido pirúvico acetoína (acetil metil carbinol) 2,3 butanodiol ; diacetilo
Por reducción, la acetoína forma 2,3 butanodiol y por oxidación, diacetilo.
Se observará la capacidad de un microorganismo de producir, en presencia de oxígeno atmosférico

y álcali, un compuesto llamado diacetilo que generará un compuesto coloreado al añadirle los
reactivos apropiados.
Como producto intermediario derivado de la fermentación butanodiólica de la glucosa se forma

acetoína (acetil metil carbinol) que es un metabolito neutro.
Esta prueba es característica de los siguientes géneros de bacterias:
Klebsiella, Serratia, Enterobacter, la mayoría de especies de Erwinia, no todas las especies de

Aeromonas.
Material:
El mismo que la prueba anterior.
Reactivos:
Medio de Clark y Lubs.

Disolución de alfa naftol.
Disolución de hidróxido potásico al 40 % o hidróxido sódico al 40%.
Microorganismo.
Técnica:
a) En un tubo de ensayo que contenga un medio de Clark y Lubs se siembra el

microorganismo problema.
Anexo II
32
b) Se incuba durante 48 horas a 37ºC.

c) Se añade: 1º 0,5 ml de la disolución de alfa naftol; 2º 0,5 ml de la disolución de
hidróxido potásico. El orden de la adición es importante, pues si se altera puede dar
resultado falsos.
d) Agitar e inclinar casi horizontalmente el tubo para que se favorezca la oxidación de la
acetoína.
e) Reposar el tubo 10-15 minutos e interpretar los resultados.
48 h VP1 ( -naftol) 6 gotas

Clark- rojo (+)
Lubs 2 ml 37ºC VP2 (KOH 0,1M) 2 gotas
esperar 15 min
Voges Proskauer positiva: medio de coloración rojo rosada.

Voges Proskauer negativa: el medio queda de color amarillento o cobrizo debido a la
reacción de los reactivos al mezclarse.
Algunas enterobacterias pueden dar reacción positiva Voges Proskauer y negativa rojo de metilo,
pero la mayoría dan reacciones opuestas.
5.1.2.4. Prueba del citrato
Fundamento:
Se observará el crecimiento de microorganismos y el viraje de color del indicador incorporado al

medio por la alcalinización de éste. Se utiliza un medio de cultivo que contenga citrato como fuente
de carbono, sales de amonio inorgánicas como fuente de nitrógeno.
Se investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono.
La alcalinización del medio es debida a la formación de amoníaco a partir de las sales de amonio
que había en el medio. Y la formación de carbonados y bicarbonatos se debe a la degradación del
citrato.
Material:
Tubos de cultivo.
Algodón graso.
Asa.
Pipeta de 10 ml.
Mechero.
Estufa de cultivo.
Reactivos:
Anexo II
33
Medio citrato de Simmons (agar inclinado).

Microorganismos.
Técnica:
a) En dos tubos poner el medio elegido. Tener cuidado de no introducir otras fuentes de
carbono.
b) Inocular un tubo con microorganismo y el otro va a servir de control negativo. El
inóculo no debe ser muy grande para evitar falsos resultados positivos.
c) Icubar 24-48 horas a 37ºC dejando los tubos destapados para que se desprenda el
anhídrido carbónico.
d) Leer los resultados a las 48 horas de incubación.
24-48 h
agar azul (+)
citrato 37ºC
Citrato +: Con medio Simmons aparece color azul intenso en la superficie del medio de
crecimiento.
Citrato - : Con medio de Simmons no aparece cambio de color ni crecimiento.
Anexo II
34

Anexo II - Pruebas de Identificación

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Anexo II - Pruebas de Identificación

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C.F.G.

S: Laboratorio de Análisis y de Control de Calidad Módulo: Ensayos Microbiológicos

1. METABOLISMO HIDROCARBONADO ................................................................................ 3

1.1. PRUEBA DE LA -D GALACTOSIDASA (ONPG)

Los microorganismos, según fermenten o no la lactosa, se pueden clasificar en:

• Fermentadores activos de lactosa en 24 horas, los cuales poseen ambos enzimas.

La aplicación fundamental es la diferenciación de enterobacterias: Escherichia (+), Serratia (+),

Para detectar en los microorganismos el enzima -D-galactosidasa se utiliza un compuesto similar a

El compuesto empleado se llama orto-nitrofenil- -D-galactopiranósido (ONPG).

• Dos tubos de ensayo estériles.

• Disolución tamponada a pH = 7 de ONPG.

• Disolución fisiológica estéril.

• Control positivo: Escherichia coli.

Interpretación de los resultados:

• ONPG positivo: amarillo. En la mayoría de los microorganismos a los 60 minutos.

De forma alternativa se pueden emplear discos comerciales impregnados en ONPG y se realiza la

1.2. PRUEBA DE OXIDACIÓN/FERMENTACIÓN (HUGH LEIFSON)

Prueba para la diferenciación de bacilos Gram negativos, basada en la determinación del

1.3. PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

1.4. PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE LACTOSA

1. Sembrar en superficie un inóculo de la muestra.

1.5. PRUEBA DE MANITOL SAL

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de

4. Sembrar en superficie un inóculo denso de la muestra.

1.6. PRUEBA DE BILIS ESCULINA

1. El medio se puede emplear en placas o en tubos, en este caso solidificándolo en plano

2.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO

Algunos microorganismos actúan metabolizando proteínas con aminoácidos azufrados, cistina,

Se observará si se ha liberado ácido sulfhídrico.

Aplicaciones: diferenciación de Brucella y Proteus.

Diferenciación de Pseudomonas putregaciens (+) de otros Pseudomonas (-).

Bacteria con enzimas desulfurasas + indicador + fuente de azufre + H + H2S gas

H2S gas + indicador Precipitado negro insoluble (FeS)

Agar con hierro y peptona (AHP).

Interpretación de los resultados:

Sulfhídrico positivo: se observa a lo largo de la línea de inoculación ennegrecimiento del

2.2. PRUEBA DE LAS DESCARBOXILASAS

La arginina deshidrolasa, ADH, es el enzima que cataliza la hidrólisis de la L-arginina obteniéndose

En todas estas reacciones se desprende CO2, y se alcaliniza el medio.

• Caldo de Moeller para descarboxilasas.

a) Se preparan cuatro tubos que se rotularán con las letras siguientes:

C (control): 5 ml de caldo Moeller (color rojo púrpura inicial).

Interpretación de los resultados:

Es importante que el pH del caldo Moeller esté ajustado a 6.

2.3. PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE GELATINA

Se emplea en estudios de microorganismos proteolíticos que degradan la gelatina por la producción

1. Tubos de cultivo y tapón.

1. En dos tubos poner el medio y esterilizar.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

Gelatinasa +: el medio se licua debido a la producción de gelatinasa.

Bacillus subtilis (gelatinasa+); Clostridium perfringens (gelatinasa+); Escherichia coli

1-7 días enfriar a 20ºC

Esta denominación se le da de forma genérica al enzima citocromo C oxidasa que participa en la

Los microorganismos aerobios obtienen su energía por la respiración y la almacenan en forma de

Detectar en el microorganismo estudiado el enzima citocromo C oxidasa.

Enterobacterias que son oxidasa negativa de

Se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios

forma reducida incolora forma oxidada azul

Interpretación de los resultados:

Oxidasa +: aparece un color azul en el papel, si se desarrolla el color a los 10-60

aparición de color azul (+)

La catalasa es un enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y