Métodos de identificación y cuantificación de Ácidos Nucleicos

Cuantificación de ácidos nucleicos

Una vez extraído el ADN, una forma de estimar la cantidad presente en el extracto, es mediante la
cuantificación. Según el método que se utilice, se puede apreciar la cantidad de ácidos nucleicos
totales, proteínas presentes, pureza del extracto, ADN humano solamente, etc. El determinar
cuanto ADN hay y su pureza en un extracto, es muy importante en muchos de los ensayos basados
en PCR. Por ejemplo, existen ensayos que resultan mejor si la concentración de ADN es baja. En
casos donde hay mucho ADN, podría inhibirse la PCR o los resultados podrían presentar picos que
se salen de la escala los cuales imposibilitan el análisis. Este tipo de contratiempos se pueden
evitar al hacer diluciones de extracto luego de la cuantificación. Por el contrario, donde hay muy
poco ADN se pueden presentar falsos negativos por una falla en la amplificación; se puede tratar
de corregir si se sabe que hay poco ADN al agregar mayor cantidad de muestra a la reacción de
PCR.

Cuantificación Espectrofotométrica

Una característica del ADN es la de presentar un pico de absorción en presencia de radiación a

260nm. Este pico de absorción se debe la presencia de las bases púricas (timina y citosina) y
pirimídicas (guanida y adenina). El ADN bicatenario presenta una absorción menor que el
monocatenario, debido a que el emparejamiento de las bases (por enlaces de puentes de
hidrógeno) reduce la absorción de la luz ultravioleta. Esta particularidad es aprovechable en la
cuantificación de ADN; sin embargo, así como encontramos ADN en la muestra, también se
encuentran contaminantes tales como proteínas o fenol residual que pueden incurrir en un falso
positivo. Es decir, la absorbancia a 260nm no es específica para ADN.

La cuantificación espectrofotométrica también permite estimar la cantidad de ARN presente en un

extracto. La absorbancia del ARN se puede analizar en términos de proporciones, lo que genera
información útil de pureza. Por ejemplo, si la proporción entre la absorbancia de ARN a 260nm y
280nm es menor a 1.75, el extracto contiene contaminantes de tipo proteínico, y si la proporción
entre la absorbancia a 260nm y 230nm es menor a 2.0, existe contaminación por carbohidratos en
el extracto.
Cuantificación por Hibridación con una sonda

Existen otros tipos de cuantificación, por ejemplo, los que implican la afinidad de una sonda. Este
tipo de técnica se puede obtener en diferentes presentaciones según la casa comercial y el
objetivo que se persigue. Su objetivo específico es el medir la cantidad de “ADN humano”, por
comparación con un patrón. La técnica consiste en hibridación de una sonda específica de 40 pb
(pares de bases) complementaria a la secuencia D17Z1, localizada en el cromosoma 17. Este
ensayo requiere de varias horas, pero es muy certero ya que puede detectar ADN humano de
cadena simple y doble. Además permite la cuantificación de varias muestras al mismo tiempo.

Explicación del efecto Hipercrómico

El efecto hipercrómico es el incremento de absorbancia en un material. El caso opuesto es
el efecto hip ocrómico. El caso más conocido es la hipercromicidad del ADN, que ocurre cuando
el dúplex (doble hélice: consiste típicamente en dos hélices congruentes con un mismo eje,
difiriendo por una traslación a lo largo del eje.) se desnaturaliza, dando dos cadenas sencillas que
absorben más en el ultravioleta. Esta característica del ADN es una forma de seguir el proceso de
desnaturalización de la molécula: a medida que el proceso avanza, se observa un incremento en la
absorbancia.
Cuantificación de DNA especie específico por hibridación en
membrana de nylon
TRANSFERENCIA (BLOTTING)

La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y

permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de
proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con
radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA
marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel
contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA
marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel
contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Northern blot

Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que
son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.

En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y su posterior separación
por tamaño mediante electroforesis en gel (las moléculas de RNA se separan desde mayor a
menor tamaño). Las moléculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el
Southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y posterior a la detección según
el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican la ubicación de los tipos de RNA que
sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede
conocer el tamaño de los RNA que se han identificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño
preciso de un mRNA, luego del empalme transcripcional. Además, sirve para identificar diferentes
tipos de mRNA codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido específico
(o tipo de células) en que se encuentra un mRNA específico. Así, será posible determinar los
niveles de actividad génica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos
celulares) durante un período definido de la vida, o después de haber sido sometido a los
organismos a diferentes estímulos fisiológicos.
Southern blot

Una técnica que se utiliza para identificar y localizar secuencias de ADN en una mezcla compleja y
que son complementarias a otro fragmento de ADN llamado sonda.

La técnica de hibridación o southern blot denominada así en honor a quien la desarrollo en 1975,
se emplea para identificar fragmentos específicos de ADN en una mezcla compleja. Inicialmente se
digiere el ADN que queremos estudiar con una o más enzimas de restricción, las cuales cortan en
puntos específicos de la secuencia, generando fragmentos de varios tamaños. Seguidamente,
estos fragmentos se separan por su tamaño en un gel de agarosa empleando corriente eléctrica y
luego se transfieren a una membrana de nylon. Para la detección del fragmento de interés en la
membrana, utilizamos otro fragmento de ADN o ARN que se llama sonda y que contiene la
secuencia complementaria al fragmento que queremos identificar. La sonda, se marca con un
isótopo radiactivo, se agrega a una solución y se incuba con la membrana por varias horas. Esta
hibridización, hace que la sonda se adhiera la fragmento de ADN en la membrana el cual contiene
las bases complementarias. Al exponer la membrana a una película de fotografía, podemos
identificar el fragmento y establecer así si está o no está contenido en el ADN que estamos
estudiando.
Southern blot El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern para
la detección de genes específicos en el ADN celular. El ADN es digerido con una enzima de
restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. Se
realiza tinción con bromuro de etidio para comprobar la calidad de la electroforesis y del ADN. A
continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados con un ácido
débil y desnaturalizados con NaOH para permitir la transferencia. Posteriormente, el ADN es
transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la
disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba
durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la
incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia
complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede
visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para
el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con
fluorocromo.

Northern blot Es esencialmente idéntica al método de Southern blot, salvo que las moléculas de
ácido nucleico de la muestra, en este caso de ARN (total, mensajero, vírico, etc.), se separan por
electroforesis en condiciones desnaturalizantes (en presencia de formaldehído, que forma parte
de la composición del gel). Esto es debido a que, a pesar de ser una molécula de una sola cadena,
se forman complejas estructuras secundarias que dificultan la migración. Al igual que en el
Southern blot, el ARN se transfiere a la membrana de filtro y se hibridan con sondas de ADN
marcada. Durante la electroforesis se pueden observan grandes cantidades de ARNm
correspondiente a ribosomal (unidades 28S y 18S). Tanto la técnica de Southern como de
Northern blot se usan poco hoy en día al haber sido sustituidas por técnicas derivadas de la PCR

Fundamento de las técnicas de PCR y RFLP

PCR
La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones
de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia
blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN
polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. En la reacción,
si usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una PCR, pero si
usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le
conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés). Esta conversión se logra
mediante una reacción conocida como transcripción reversa y controlada por la enzima
transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molécula de ADNc. Este método fue
copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en
ADN duplicarse en millones de partículas virales.2 El ADNc se utiliza cuando analizamos la
expresión del ARNm de algún gen de interés. Los elementos importantes en la reacción son el
templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los oligonucleótidos o primers, los
desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el ión magnesio
(Mg +), una solución amortiguadora o buffer y H2 O. Todos estos elementos interactúan en tres
etapas principales de las que se compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. Los
equipos en donde se realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están diseñados
para establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo
necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para corroborar si se
amplificó la secuencia blanco de interés, los productos de la PCR o también llamados amplicones
son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa.

RFLP

Se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por
las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre
individuos. En un cromosoma humano, una enzima de restricción puede producir un gran número
de cortes en los lugares donde reconozca la secuencia específica para hacerlo. Las secuencias de
restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el
ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población
es polimórfica para estos fragmentos de restricción. Los RFLP son marcadores génicos del ADN y se
pueden encontrar en regiones que codifican proteínas o exones, en los intrones o en el ADN que
separa un gen de otro. Lo único que se necesita para que puedan ser marcadores genéticos es que
sean polimórficos teniendo más de un alelo. La técnica RFLP se usa como marcador para identificar
grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia
forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relación genética
entre individuos.