Técnicas de

Hibridación Almaraz Orozco Maritza

Amaro Xochitiotzi Suriel
Ambriz Martínez Roxana Jazmín
Barajas Villanueva Jocelyne Gabriela
Delgado Banda María Guadalupe
García Rodríguez Valeria
Gutierrez Coronado Veronica Valeria
Profesora: Mayra Guadalupe Mena Enriquez
Gutierrez Guzmán Juanita Yudith

Introducción

Al saber los numerosos métodos mediante los cuales

las células procesan, añaden, eliminan y transfieren
información genética, los biólogos moleculares
abrieron el camino para el desarrollo de sus propias
manipulaciones genéticas. En los últimos años, se
han desarrollado técnicas que han permitido abordar
el análisis y la manipulación del ADN.
La tecnología del ADN recombinante ha hecho
posible investigar más a fondo la estructura y la
función de los genes, en especial de los genes
eucarióticos, inaccesibles por otros métodos.

Sin embargo por el gran tamaño y la complejidad del

ADN, la posibilidad de descifrar la información
genética codificada resultaba una tarea muy
compleja.
 Al estudiar un gen individual, se debe
aislar del resto del genoma ya que, cada gen representa una pequeña sección dentro
de un cromosoma y, en ese contexto, no puede individualizarse, para el aislamiento
de un gen o de fragmentos más pequeños, el ADN debe fragmentarse.
Para avanzar hacia un estudio más detallado
del ADN fue necesaria una metodología
que permitiera obtener grandes cantidades
de fragmentos específicos de ADN.
Estos fragmentos podían ser ADN
genómico, ADN complementario (ADNc) o
ADN obtenidos a partir de oligonucleótidos
sintéticos.
Antes de que un determinado fragmento
de ADN o de ARN mensajero (ARNm)
pueda manipularse primero debe
localizarse.
Para localizar fragmentos específicos se
utiliza la técnica de hibridación de ácidos
nucleicos. Entre las técnicas de hibridación
más comunes se encuentran Southern
blot, Northern blot, Slot blot, Dot blot e
hibridación in situ.
Electroforesis de ácidos
nucleicos
La electroforesis es una técnica analítica de
separación de macromoléculas. La separación es
debido a la diferente movilidad de las
macromoléculas cargadas cuando se someten a
un campo eléctrico como consecuencia de su
relación carga/masa.

 Los ácidos nucleicos son moléculas

cargadas negativamente, debido a la
presencia de grupos fosfato en su
estructura.
La electroforesis en geles de agarosa se
lleva a cabo en aparatos apropiados,
cámaras generalmente horizontales, y
requiere de dos elementos indispensables:
la fase móvil y la fase estacionaria.

 Los fragmentos de
ácidos nucleicos
separados por
electroforesis se
visualizan mediante su
tinción con bromuro
de etidio, un colorante
que se intercala entre
las bases del ADN y
que emite
fluorescencia cuando
se irradia con luz
ultravioleta.
Sondas
Las sondas son segmentos de ADN o ARN de
cadena sencilla marcados con moléculas
reporteras, como enzimas o radioisótopos, que
permiten su fácil detección. El diseño de la sonda,
es decir, su secuencia nucleotídica, es lo que le
permitirá, entre miles de fragmentos que forman
parte del genoma de un ser humano, identificar
“un solo gen” o “el fragmento de un gen”.

TÉCNICA DE
SOURTHERN BLOT
 ¿QUÉ ES?
Es una técnica empleada en los laboratorios
de biología molecular que se usa para
detectar secuencias de ADN específicas a
partir de un preparado de tejido

Se basa en la aplicación de dos procesos

fundamentales: la desnaturalización o
separación de las cadenas complementarias
del ADN y la hibridación o unión de dos
cadenas complementarias.
El nombre de esta técnica se debe
al inventor de la misma, el biólogo
británico Edwin Southern
El trabajo de esta técnica apareció en el Journal of Molecular Biology,
número 98, en 1975. Desde entonces se han implementado algunas
mejoras, aunque el procedimiento básico es el mismo.
 Para que sirve ...
Detección de genes específicos en el ADN celular:

Enfermedades de transmisión genetica

Prueba de paternidad

Identificar mutaciones

Detectar la presencia del ADN de un individuo en un lugar

 PASOS :
1- Extraer el ADN
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
3. Electroforesis en gel de agarosa
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
5. Hibridación con sonda radioactiva
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía

7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales

Northern blot
¿Qué es?
Técnica
Técnica de laboratorio que se utiliza
para detectar una secuencia de ARN
específica en un muestra de sangre o
de tejido.
 Las moléculas de ARN en una muestra
se separan por tamaño mediante
electroforesis en gel. Pasos:
Los fragmentos de ARN son
transferidas del gel a la superficie de
una membrana.
La membrana se expone a una sonda
de ADN marcada con una etiqueta
radiactiva o química.
Si la sonda se une a la membrana,
entonces la secuencia complementaria
Biology 1

de ARN está presente en la muestra.

El término Northern blot es realmente un juego de
palabras de cómo las personas inicialmente analizaban
el ADN.
La técnica reciba el nombre de Northern o del norte.
El término "blot" o mancha, se refiere al protocolo en
si donde se tiene un gel y luego se coloca como si
fuera un sándwich,

con la membrana que desea transferir

en la parte superior, y finalmente se
agrega una pila de material absorbente,
-usamos toallas de papel - y es como si
estás emborronando, transfiriendo, el
ADN a la parte superior de la
membrana para su posterior análisis.
 Es la contraparte del Southern blot y como ácido
nucleico se utiliza ARN en lugar de ADN. A
diferencia del Southern blot, con esta técnica no
se utilizan enzimas de restricción, ya que las
moléculas de ARN son más pequeñas y para su
análisis no requieren su fraccionamiento.
Diferencias a
otras técnicas:
 Sin embargo, prácticamente comparten
todos los demás pasos, como son la
electroforesis, la desnaturalización
(aunque el ARN es de cadena sencilla,
puede formar estructuras secundarias),
la transferencia y la hibridación con una
sonda
Aplicaciones:

Es una herramienta muy útil para el estudio de los productos de la

transcripción génica (ARNm) y de su regulación, ya que se pueden
estudiar las potenciales variaciones en la abundancia de especies
del ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar
condiciones clínicas normales o patológicas.
 Biología Molecular
HIBRIDACIÓN IN
SITU
 Biology 1
¿Qué es?
Es una técnica de laboratorio que consiste
en marcar una hebra sencilla de ARN o ADN
denominada sonda y permitir que se
empareje con su secuencia complementaria
en el ARN o el ADN presente en una
muestra de tejido o de cromosomas.
Descubrimiento
La técnica se desarrolló en el año de 1969 por dos grupos de
investigación, Gall y Pardue e independientemente por Jonh et al, en el
mismo año.
Gall y colaboradores describieron una técnica en la cual se formaban
híbridos moleculares entre RNA y DNA.

La sensibilidad depende de

Biology 1
Preparación de la muestra
Construcción de la sonda
Etiquetado de la sonda
Sensibilidad del método
Ventajas Permite usar al máximo la muestra
de un tejido, logrando realizar
cientos de hibridaciones diferentes
en el mismo tejido.

Desventajas Esta limitada por su incapacidad

para detectar secuencias que tienen
bajo número de copias de ADN y
ARN.
Biology 1
 Tipos de Hibridación in situ
PCR con hibridación in situ

Se usa para la amplificación de secuencias específicas de ADN o

ARN en células o secciones de tejido, de forma que el número de
copias se incrementen en PCR in situ a niveles detectables por
métodos estándar de hibridación in situ.

Posee una baja eficiencia de amplificación y una mala

reproducibilidad.
Hibridación in situ con fluorescencia (FISH)

Detecta secuencias de ácidos nucleicos en células o tejidos

preservados mediante el empleo de una sonda marcada
con un fluorocromo, la cual va dirigida hacia un lugar
específico del cromosoma y que emite fluorescencia que
puede ser observada por medio de un microscopio.

Se caracteriza por permitir la visualización directa de las

alteraciones genéticas en la célula.
Hibridación in situ con cromógenos (CISH)

En esta técnica los anticuerpos se conjugan con una

enzima que cataliza reacciones de sustratos cromogénicos.

Los cromógenos resultantes precipitan en el lugar de

destino de la sonda y se pueden detectar con un
microscopio de campo brillante estándar.
Hibridación in situ genómica (GISH)

Se utiliza con el fin de distinguir los cromosomas de

diferentes progenitores o de diferentes genomas en
híbridos interespecíficos o alopoliploides.

La característica principal de esta técnica es que mientras

FISH utiliza secuencias específicas de ADN como sondas,
GISH utiliza ADN genómico de una especie como sonda.
 Biology 1
PASOS
1. Preparación de la sonda
2. Fijación
3. Hibridación de la sonda
4. Detección de la señal
Bibliografía
Bueno Topete, M. & González Cuevas, J. (2013). Técnicas de hibridación. En Salazar Montez, A. Sandoval
Rodrígez, A. & Armendáriz Borunda, J. Biología Molecular: Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la
salud.1ra.(pp.139-144). México: McGrawHill Education

Contreras, R. (2013, 30 diciembre). Southern blot | La guía de Biología. La guía. Recuperado 14 de noviembre
de 2021, de https://biologia.laguia2000.com/tecnicas-en-biologia/southern-blot