TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

SOUTHERN BLOT

El Southern Blot es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de

ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de
nitrocelulosa o nylon; Su nombre procede de la persona que lo diseñó Edwin Southern
y permite la detección simultánea de varias secuencias diana de distintos tamaños con
una única hibridación.

Para poder realizar el Southern blot  como primero hay que extraer y purificar el
ADN, éste puede ser tanto de tejido animal, vegetal o algún otro el cual es sometido a
una digestión enzimática, los enzimas más utilizados son el Hae III y Hinf I y E cori. El
ADN digerido se somete a una electroforesis en gel de agarosa para separar los
fragmentos producidos según su tamaño. Cuando se trabaja con ADN genómico, tras
la electroforesis se observa una estela fluorescente continua o “smear” debido a que la
digestión produce un número muy elevado de fragmentos diferentes con múltiples
tamaños; El siguiente paso es la transferencia del ADN a una membrana de nylon o
nitrocelulosa para obtener una réplica exacta del patrón de bandas de ADN que hay en
el gel. Esta consta de varios pasos que incluyen la desnaturalización para separar las
cadenas de ADN de forma que la sonda pueda hibridar; la transferencia desde el gel a
la membrana por capilaridad; y por último anclaje del ADNB a la membrana que se
consigue mediante incubación de la membrana a 80ºC, o irradiando con luz UV las
membranas.

La hibridación se realiza incubando la membrana con diferentes reactivos en un tubo

de hibridación, entre ellos la sonda o sondas marcadas específicamente y diluidas en
una solución de hibridación adecuada Finalmente, el revelado que se realiza mediante
autorradiografía con una película de rayos X, de manera que aparecerá una mancha
oscura en los puntos de la membrana en que se localicen los híbridos
sonda/secuencia diana.

Pasos:

1. Aislamiento de DNA

2. Cortar con enzimas de restricción

3. Separar fragmentos por electroforesis

4. Desnaturalizar el DNA

5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon

6. Hibridar con sonda específica

7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager

El Southern Blot tiene muchas aplicaciones, aunque muchas de ellas están siendo
substituidas por técnicas como la PCR, que aportan mayor sensibilidad y rapidez.

NOTHERN BLOT

El Northern blot es una metodología directa que permite la detección de los pequeñas
moléculas de ARN específicas en una mezcla de ARN,  La transferencia de Northern
blot se puede usar para analizar una muestra de ARN de un tejido o tipo de célula
particular para medir la expresión de ARN de genes particulares. Este método fue
nombrado por su similitud con la técnica conocida como Southern blot

El proceso general del Northern blot consiste en extraer RNA total, separarlo por

tamaño dentro de la muestra en hebras únicas mediante electroforesis (en presencia
de formaldehido) después de la separación, el ARN se transfiere e inmovilizar desde el
gel a una superficie sólida (membrana secante) a vez que se completa la
transferencia, la membrana de transferencia transporta todas las bandas de ARN
originalmente en el gel; luego la membrana se trata con una pequeña porción de ADN
o ARN llamada sonda, que se ha diseñado para tener una secuencia que es
complementaria a una secuencia de ARN particular en la muestra, se incorpora en la
membrana que contiene el RNA inmovilizado y finalmente la hibridación con la
secuencia complementaria es detectada. Anteriormente tanto la técnica de Southern
como de Northern blot se usan poco hoy en día al haber sido sustituidas por técnicas
derivadas de la PCR.

Ahora, nuevo protocolo para Northern blot no radiactivo denominado LED integra tres
metodologías desarrolladas separadamente, que modifican a su vez tres aspectos del
proceso determinantes de la especificidad y sensibilidad del Northern blot; Las
modificaciones consisten básicamente en remplazar las sondas de oligonucleótidos de
DNA, por sondas que contienen ácidos nucleídos bloqueados o no accesibles. La
inmovilización del RNA en la membrana, que normalmente se hace con luz ultravioleta
(UV), es remplazado por el uso de EDC (1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl)
carboniimide)). Adicionalmente, el uso de radioisótopos (32P), el método más común de
marcaje de sondas, con el cual se deben asumir todos los riegos de la radioactividad,
es sustituido por el uso de Digoxigenina (DG). Este nuevo protocolo aumenta la
sensibilidad y especificidad en la detección de pequeños RNAs por Northern blot, por
lo que su uso e implementación en los estudios de detección, caracterización y
funcionalidad de nuevos sRNAs será de gran utilidad.

Pasos:

1. Aislamiento de RNA

2. Desnaturalizar el RNA

3. Separar por electroforesis desnaturalizante

4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon

5. Hibridar con sonda específica

6. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager.

Tanto la técnica de Southern como de Northern blot se usan poco hoy en día al haber
sido sustituidas por técnicas derivadas de la PCR.

WESTERN BLOT

El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas
específicas en una muestra determinada sangre o tejido (una mezcla compleja de
proteínas, como un extracto tisular) la técnica implica el uso de electroforesis en gel
para separar las proteínas de la muestra atendiendo al criterio que se desee: peso
molecular, estructura, hidrofobicidad, etc.; Luego son transferidas a una membrana
adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de
interés con anticuerpos específicos contra ella; ésta expone a un anticuerpo específico
contra la proteína en estudio mediante un proceso llamado immunboblotting.

La Immunoblotting utiliza anticuerpos de proteínas y de unión de anticuerpos a través

de sitios de reconocimiento específicos, proporcionando la alta especificidad necesaria
para la identificación de una sola proteína. Finalmente, se detecta la unión antígeno-
anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros métodos. De esta forma
se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad
relativa respecto a otras proteínas.

Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la

biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología.

Pasos:

1. Preparación de la muestra
2. Electroforesis en gel.
3. Transferencia gel – membrana
4. Inmunodetección
5. Radiactividad - Controles recomendados en WB
6. Diagnóstico.

RFLP

POLIMORFISMO EN LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN

En 1985, Sir Alec Jeffreys descubrió los polimorfismos en la longitud de los fragmentos
de restricción que en biología molecular el término RFLP (del inglés Restriction
Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en
el ADN  que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción  (también
llamadas endonucleasas  de restricción) y que varían entre individuos. Los
polimorfismos de ADN son ampliamente utilizados para el análisis de configuraciones
únicas en la DNA hace fragmentos para genético distinguir entre los organismos,
determinar paternidades, parentescos, identificación de restos humanos y la base
genética de varias enfermedades. El ADN”fingerprinting” (huella genética) permite la
identificación del origen de una muestra de ADN; importante para investigaciones
forenses.

El polimorfismo genético se define como las diferencias genéticas heredadas entre

individuos hacia adentro sobre el 1% de población normal. La técnica del PTFR
explota estas diferencias en series de la DNA para reconocer y para estudiar la
variación intraespecies.

Pasos:

1. Selección de las muestras

2. Extracción del ADN genómico
3. Amplificación por PCR del fragmento de ADN a estudiar
4. Enzimas de restricción utilizadas: AluI (Arthrobacter luteus)5’ ----AG/CT --3’
BfaI (Bacteroides fragilis) 5 ‘---C/TAG--- 3’}
5. Análisis electroforético

AFLP

POLIMORFISMOS DE LONGITUD EN FRAGMENTOS AMPLIFICADOS

Los polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados son un tipo de marcador

molecular que está basado en la restricción del ADN genómico mediante enzimas de
restricción y en la subsecuente amplificación de algunos de esos fragmentos mediante
la reacción en cadena de la polimerasa. Son una herramienta poderosa de análisis
del genoma  dado que poseen un alto poder de detección de la variabilidad genética.

Los pasos para realizar en ensayo de AFLP consiste:

1. digestión del ADN con dos enzimas de restricción del ADN con dos enzimas de
restricción (Generalmente una de ellas es de corte raro (ej. EcoRI) que generan
dos extremos cohesivos con diferentes secuencias.
2. los fragmentos de ADN doble cadena de 20 a 30 pares de bases llamados
adaptadores se ligan en forma específica a los extremos de los fragmentos
obtenidos en el paso 1 generando el molde de ADN para la amplificación
3. Amplificación selectiva de los fragmentos por PCR con dos cebadores de
secuencias idénticas a cada uno de los adaptadores más tres nucleótidos
adicionales en el extremo 3’, con lo que se obtiene una reducción drástica del
número de fragmentos amplificados. este producto de amplificación obtenido
es empleado como molde en una nueva amplificación empleando iniciadores
que poseen dos nucleótidos selectivos adicionales al anterior.
4. análisis de los fragmentos amplificados que se resuelven geles
desnaturalizantes de acrilamida o en analizadores de fragmentos.
FISH

HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU

La Hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica de laboratorio para

detectar y localizar una secuencia específica de ADN en un cromosoma. La
técnica se basa en exponer los cromosomas a una pequeña secuencia de ADN
llamado sonda que tiene una molécula fluorescente pegada a ella. La secuencia de
la sonda se une a su secuencia correspondiente en el cromosoma. En primer
lugar, la muestra de DNA (cromosomas metafásicos o núcleos en interface)
se desnaturaliza, proceso que separa las hebras complementarias de la
estructura bicatenaria en doble hélice del DNA. A la muestra desnaturalizada se le
añade entonces la sonda de interés, que se asociará al DNA de la muestra en el
sitio diana, en el proceso denominado hibridación, donde se vuelve a formar una
doble hélice. La sonda está unida covalentemente (marcada) con un fluoróforo,
que emite una señal observable mediante un microscopio de fluorescencia; así la
muestra de DNA se puede clasificar según la presencia o ausencia de la señal, lo
que desvela la presencia o ausencia de la secuencia diana en el DNA
cromosómico; Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los
13, 18, 21, X e Y, que son los más propensos a sufrir anomalías. Están
relacionados a enfermedades como el síndrome de Patau (13), el síndrome de
Edwards (18), el síndrome de Down (21), el síndrome de Turner  (X) y el síndrome
del superhombre (Y), entre otros. Este tipo de FISH se utiliza para detectar
microdeleciones específicas, translocaciones o para identificar material extra de
origen desconocido.