Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de

Restricción (RLFPs)

Los fragmentos de restricción de longitud polimorfica (RFLPs) son un tipo de

polimorfismo que resulta de la variación en la secuencia de ADN reconocida por las
enzimas de restricción.
Los RFLPs se utilizan como marcadores en los mapas genéticos. Un marcador es
cualquier característica heredable que permite identificar diferencias entre
individuos. Estos marcadores se basan en la identificación de diferencias en el
tamaño de fragmentos generados mediante restricción con endonucleasas. Algunas
de estas diferencias de secuencia del ADN originan diferencias en la longitud de los
fragmentos de ADN que se obtienen por digestión con una enzima de restricción
(EcoRI). Después de la digestión con EcoRI, se producen distintos números de
fragmentos entre las moléculas de ADN analizadas.
En el ADN, hay sitios particulares, de una serie de cuatro a ocho ácidos nucleicos,
que son un sitio donde la enzima de restricción de bacteria puede unirse y cortar el
ADN. Esto resulta útil ya que podemos utilizar esta característica de la secuencia
del ADN donde se une la enzima de restricción o no, para observar las diferencias
entre las personas, es decir, si tienen ese sitio o no. Las diferencias que produce el
cambio de una sola base entre dos personas, podría resultar en la presencia o
ausencia de ese sitio de corte. Entonces, si se aísla ese pedazo de ADN que rodea
a ese sitio en dos personas y en una de ellas la enzima corta y en la otra no, eso
refleja un polimorfismo, o diferencia entre esas dos personas.

Los pasos para la visualización del polimorfismo detectado por

RFLPs son:
 Extracción del DNA
El paso es la extracción del DNA, generalmente el DNA genómico total. Es
necesario obtener gran cantidad de DNA, limpio y sin romper. Es importante
cuantificar el DNA extraído con objeto de analizar aproximadamente la misma
cantidad de DNA por muestra.
 Digestión del DNA extraído
A continuación, se lleva a cabo la digestión del DNA, durante el tiempo suficiente
para que se realice la digestión completa, con la enzima de restricción apropiada.
Es conveniente comprobar mediante electroforesis.
Si la digestión no se ha completado correctamente es necesario volver a realizar la
digestión. Y en el caso de repetirse la digestión y no lograse un resultado adecuado
es conveniente repetir la extracción de DNA.

 Separación mediante electroforesis

Una vez comprobada la digestión, el proceso continúa cargando en un gel de
agarosa todo el producto restante de aquellas muestras en las que ésta se ha
realizado correctamente y llevando a cabo una separación de los fragmentos
resultantes de la digestión.
La electroforesis debe realizarse a bajo voltaje, para mejorar la resolución y
disminuir la degradación por calor. Este gel de agarosa es el que se transferirá a
una membrana para su posterior hibridación.
 Transferencia
La trasferencia del contenido del gel a la membrana se realiza mediante la técnica
“Southern blot” (Southern, 1975). Se trata de disponer del DNA en una superficie
sólida que pueda ser sometida a hibridación. Los fragmentos de DNA, separados
en el gel por su tamaño migran verticalmente, sin variar su posición relativa, hasta
una membrana. Las membranas que se utilizan son de nylon o nitrocelulosa. El DNA
se fija a la misma, de forma que puede ser sometido a un proceso de hibridación.
 Hibridación
El paso siguiente es la hibridación con una sonda marcada. El marcaje de la sonda
puede realizarse también por distintos métodos, siendo los más frecuentes el
marcaje con radioactividad o con digoxigeninas. En cualquier caso, la sonda debe
desnaturalizarse, para, a continuación, llevar a cabo la incubación de la membrana.
 Detección
La forma de visualización de los resultados dependerá del sistema de marcaje
empleado. Como ejemplo, si la sonda se ha marcado con radioactividad, la
visualización se puede realizar por exposición de una película fotográfica. Si el
marcaje se ha realizado con digoxigeninas, la detección se puede realizar
añadiendo un sustrato que proporcione, bien una señal de color

¿Cuáles son las mutaciones que pueden generar polimorfismo

entre dos individuos?
Aquellas que afectan a los sitios de restricción, o bien al tamaño del fragmento
limitado por dos sitios de restricción dados. Por lo tanto, las causas de polimorfismo
son las mutaciones puntuales y las pequeñas inserciones o deleciones.
Esta técnica permite la separación de una mezcla de proteínas según su peso
molecular en un campo eléctrico, y es la técnica de entrada para la realización del
Western-Blot, purificación de proteínas para su análisis por espectrometría de
masas, estimación de peso molecular o identificación de variaciones en la expresión
o estructura de proteínas.
Se necesitan dos fuerzas opuestas: el campo eléctrico que va a provocar
la movilidad de la proteína en base a su carga, y un soporte sólido que va
a retener la proteína en base a su interacción debido al tamaño.

Protocolo de SDS-PAGE
1. Preparación de la muestra:

Las muestras de la proteína son desnaturalizadas calentándolos con un detersorio

SDS y mercaptoetanol. Les dan una alta carga negativa mientras que este último
libera grupos del sulfidrilo, así el rendimiento del polipéptido encadena a llevar
exceso de una carga negativa.

2. Preparación del gel:

El gel electroforético tiene generalmente varios componentes incluyendo la

acrilamida, el BIS, y un almacenador intermedio. La mezcla se desgasifica para
prevenir la formación de burbujas durante la polimerización del gel. El persulfato del
amonio, una fuente del radical libre, y un estabilizador se agregan a la
polimerización del comienzo. El BIS también se agrega a las interconexiones de la
forma entre las moléculas de la acrilamida hasta que un gel se forme final.

3. Electroforesis:

Mientras que una corriente eléctrica es aplicada las proteínas emigran a través del
gel al electrodo positivo pues tienen una carga negativa. Cada molécula se mueve
a un diverso régimen basado en su peso molecular - pequeño movimiento de las
moléculas más rápidamente a través del gel que los más grandes. La migración es
generalmente más rápida en voltajes más altos. Después de algunas horas, las
proteínas son separadas por peso molecular.
 4. Coloración y visualización:

El gel se puede teñir colorantes tales como azul de Coomassie o bromuro de etidio
brillante para hacer que las proteínas separadas aparezcan como bandas
coloreadas distintas en el gel.

El tinte se elimina del gel. Los geles teñidos entonces se secan así que la intensidad
del color de las bandas de la proteína puede ser medida. Las bandas de proteínas
radioactivas se pueden descubrir por la autoradiografía. Las proteínas se pueden
también cuantificar, como el contenido proteínico es directamente proporcional a la
cantidad de tinte retenido por las bandas.

Referencias bibliográficas:

Pavan, W. (s. f.). Fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP). | NHGRI.

Genome.gov. Recuperado 13 de octubre de 2020, de
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Fragmentos-de-restriccion-de-
longitud-
polimorfica#:%7E:text=Los%20fragmentos%20de%20restricci%C3%B3n%20de,p
or%20las%20enzimas%20de%20restricci%C3%B3n.&text=Por%20lo%20general
%2C%20para%20visualizar,utiliza%20la%20electroforesis%20en%20gel.

Audesirk, T., Audesirk, G., & Byers, B. E. (2016). Biología: La vida en la tierra (9.a ed.).
Pearson. https://books.google.com.mx/books?id=uO48-
6v7GcoC&pg=PA248&dq=Polimorfismos+de+Longitud+de+Fragmentos+de+Rest
ricci%C3%B3n&hl=en&sa=X&ved=2ahUKEwi9m7qO-
rLsAhUvFjQIHZz2AQ0Q6AEwAnoECAQQAg#v=onepage&q=Polimorfismos%2
0de%20Longitud%20de%20Fragmentos%20de%20Restricci%C3%B3n&f=false

Pérez de Castro, A. M., & Picó, M. B. (s. f.). Marcadores basados en restricción e
hibridación: RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms). Universidad
Politécnica de Valencia. Departamento de biotecnología. Recuperado 13 de octubre
de 2020, de
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/38353/articulo_docente_RFLPs.pdf?se
quen

Menor-Salvan, C. (2019, 2 febrero). SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida –

ChemEvol. ChemEvol. http://www3.uah.es/chemevol/index.php/sds-page-
electroforesis-en-gel-de-poliacrilamida/

Cheriyedath, S. (2019, June 28). ¿Cuál es electroforesis del gel de poliacrilamida

(PAGINACIÓN)?. News-Medical. Retrieved on October 16, 2020 from
https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Polyacrylamide-Gel-
Electrophoresis-(PAGE).aspx.