ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Las técnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y

caracterizar ADN y ARN respectivamente. La técnica de Southern fue
desarrollada por Edwin Southern para separar ADN y por analogía la separación
de ARN se denominó Northern. El Southern Blot, que detecta la presencia de
ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en
el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos
en determinadas condiciones. Hemos visto que dos células del mismo organismo
se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos
permite evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de
diferentes genes. Estas técnicas comienzan con una electroforesis en gel con el
objetivo de separar las moléculas por su tamaño, posteriormente la transferencia
a una membrana para finalmente identificar un fragmento específico de ADN,
una molécula de ARN particular o una proteína de interés mediante la unión
específica de otra molécula de ácido nucleico (sonda) para ADN o ARN o
anticuerpo para proteínas.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que
la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en
un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
 Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas
de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una
secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen
secuencias complementarias a la de la sonda.
 Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas
de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una
secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen
secuencias complementarias a la de la sonda.
A. Southern blot.
Es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de
una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para
ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar
los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia
a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda. Su nombre
procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.
Los pasos para Southern blot:
1. Extracción del ADN: Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido
humano.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción. El ADN extraído
de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una
enzima que corta el ADN bicatenarios en donde tenga una secuencia
característica.
3. Electroforesis en gel de agarosa: Tras la digestión del ADN, los
fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante
electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las
moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo
positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se
ve reducida por la matriz del gel de agarosa.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot"): Tras la
electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan
mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una
disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario
resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon,
realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot,
conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de
desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en
recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern.
5. Hibridación con sonda radioactiva: Una sonda de locus único es una
molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar con el ADN de un
fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación
de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de
bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN
presente en el"calco". Las sondas de locus único se marcan
habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se
eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo
cromosoma humano.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía: Las posiciones de
hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de
Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, La
membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de
rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las
posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el
 revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern
se conoce como autorradiografía.
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales: En un
análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en
varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía
para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución
a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una
segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así
las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de
autorradiografías de una misma transferencia de Southern se conoce
como un "perfil de ADN".

B. Northern blot.
Es similar a la técnica anterior, pero permite detectar RNA en vez de DNA.
En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y su
posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las muestras
de RNA son normalmente separadas en geles de agarosa que contienen
formaldehído como agente desnaturalizante del RNA para obtener su estructura
secundaria. Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados
bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea
también pueden utilizarse, aunque esto suele limitarse a fragmentos de RNA o
miRNA, ya que crean un tamaño de poro más estrecho en su matriz, por lo que
el RNA que suele utilizarse no podría desplazarse por el gel.
 Las moléculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el
Southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y posterior a
la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican
la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendo
marcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los
RNA que se han identificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño preciso
de un mRNA, luego del empalme transcripcional. Además, sirve para identificar
diferentes tipos de mRNA codificados por un mismo gen y para determinar la
cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra un mRNA
específico. Así, será posible determinar los niveles de actividad génica, por
ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares)
durante un período definido dela vida, o después de haber sido sometido a los
organismos a diferentes estímulos fisiológicos.