UNIVERSIDAD PRIVADA

DEL VALLE
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

TEMA:
TÉCNICA DE
SOUTHERN
BLOT
Docente:
Dra. María Carmona Miranda
Integrantes:
• Fiorela Figueroa Solís
• Nicole Durand León
INTRODUCCIÓN

La técnica de Southern Blot es una técnica de hidratación que nos permite identificar fragmentos de
ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nylon. Es
utilizada para detectar una secuencia específica de ADN en una muestra de sangre o tejido.
Una enzima de restricción se utiliza para cortar una muestra de ADN en fragmentos que se separan
mediante electroforesis en gel. Los fragmentos de ADN son transferidos del gel a la superficie de una
membrana. La membrana se expone a una sonda de ADN marcada con un marcador radiactivo o
químico. Si la sonda se une a la membrana, entonces la secuencia de la sonda está presente en la
muestra. La hibridación se realiza incubando la membrana con diferentes reactivos en un tubo de
hibridación, entre ellos la sonda o sondas marcadas específicamente y diluidas en una solución de
hibridación adecuada.
Finalmente, el revelado que se realiza mediante autorradiografía con una película de rayos X, de manera
que aparecerá una mancha oscura en los puntos de la membrana en que se localicen los híbridos
sonda/secuencia diana.
El ADN presente en el núcleo de cualquier célula es el material genético que actúa como traductor para
la síntesis de proteínas de cada célula. No obstante, en mamíferos, una larga fracción del ADN total no
codifica para proteínas y su función no está muy clara.

ADN polimórfico:

Se refiere a las regiones del cromosoma que varía de un individuo a otro. Examinando varías de estas
regiones dentro del ADN genómico obtenido de un individuo, uno puede determinar el ADN
”fingerprinting” (huella genética o tipaje) para este individuo.
Las personas no pueden tener el mismo patrón de los lugares de reconocimiento de los enzimas de
restricción. Variaciones en la longitud de los fragmentos entre diferentes individuos es conocido como
polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción.
Los polimorfismos de ADN son ampliamente utilizados para determinar paternidades, parentescos,
identificación de restos humanos y la base genética de varias enfermedades.

MARCO TEÓRICO

Pasos del procedimiento:

1. Extracción del ADN:

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de
un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El
ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído
de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.

2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción

El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que
corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más
frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.

3. Electroforesis en gel de agarosa

Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante
electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga
negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración
se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través
de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de
los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan
la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.

4. Preparación de un ensayo de Southern

Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el

gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de esta, el DNA
monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una
copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es "secante"). Este
proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien
lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda
transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la membrana de
nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado
de la electroforesis.

5. Hibridación con sonda radioactiva

Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de
formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el
ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de
bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". Las sondas
de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen
para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern
resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único,
bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse
esta, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la
membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.

6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía

Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se
detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez lavada,
junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las
posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro
resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía

7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales

En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas

diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la
radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una
segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando
cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una misma transferencia de Southern se
conoce como un "perfil de ADN"

Descripción del experimento:

El Southern Blot tiene muchas aplicaciones ya mencionadas anteriormente, y para que sea algo más
didáctico y práctico de entender, en este caso se utilizará como herramienta para una prueba de “DNA
fingerprintinf” (huella genética) en un caso hipotético de determinación de paternidad.
Para lo cual haremos uso de DNA de 2 posibles padres, esas muestras de DNA fueron digeridos con el
mismo enzima de restricción en reacciones separadas. El objetivo de la prueba es determinar quién es
el padre del hijo mediante el análisis y emparejar el patrón de fragmentación del ADN después de la
electroforesis en gel de agarosa.
El experimento constará de 3 partes:
1. Electroforesis gel de agarosa.
2. Transferencia Southern Blot.
3. Detección del ADN.

ESQUEMA DEL PROCESO

1. Electroforesis del gel de agarosa

a) Preparar el gel Preparar un gel de agarosa al 0,8% para la electroforesis de las muestras lista para
ser sembradas. Utilizar un gel de 7x7 cm o 7x10 cm. Se necesitan 6 pocillos con una capacidad de 40
µl.

b) Antes de la siembra de las muestras En un baño calentar un vaso a 65ºC para calentar las muestras
que contienen el ADN antes de su siembra. A 65ºC las agregaciones no específicas que se pueden
generar por los extremos cohesivos generados por los enzimas de restricción son eliminadas. Calentar
las muestras A-E a 65ºC durante 2 minutos. Permitir enfriar las muestras otros 2 minutos.
 c) Sembrar las muestras Sembrar las muestras A-E en pocillos consecutivos. La cantidad de muestra a
siembra debe ser de 35-38 µl.

d) Correr el gel Después de la siembra, configurar la fuente de electroforesis al voltaje requerido. Una
vez terminada la electroforesis proceder con el análisis de Soutern Blot. La electroforesis debería
pararse cuando el colorante naranja de carga haya migrado aproximadamente 4,5 cm desde el pocillo
de siembra del gel de agarosa.

2. Análisis de Southern Blot

Este proceso consta en transferir fragmentos de ADN desde el gel de agarosa a la membrana de nylon:
La membrana será incubada, después de la transferencia, durante un corto periodo de tiempo para fijar
el ADN a la membrana.

a) Despurinización/Desnaturalización

El gel es secuencialmente tratado con HCl (ácido clorhídrico) y NaOH (hidróxido de sodio) después de
haberse concluido la electroforesis.

El HCl introduce sitios apurínicos en el ADN lo cual produce uniones fosfodiéster e introduce “nicks”
(discontinuidad en una molécula de ADN) en el ADN de doble cadena.

1. Se debe colocar el gel de agarosa en una cubeta con 100 ml de 0,25 N HCl. Luego se incuba a
temperatura ambiente durante 8 minutos.

El gel debe estar completamente cubierto con la solución y agitar periódicamente. Eliminar con cuidado
la solución. Lavar el gel con diversos cambios de 100 ml de agua destilada.

2. Luego se procede a colocar el gel durante 15 minutos en la solución de desnaturalización del

ADN. El gel debe estar completamente cubierto con la solución y agitar periódicamente. Eliminar la
solución.

3. Utilizar otros 100 ml de solución de desnaturalización e incubar otros 15 minutos. Conservar

está solución para luego.

b) Configurar la transferencia del Southern Blot

4. Colocar unas hojas de papel de plástico o de aluminio en una superficie plana. Después se debe
sacar el gel y se coloca la superficie lisa de forma que quede en contacto con la membrana de
transferencia.

5. Ajustar la membrana al tamaño del gel y recoger con mucho cuidado la membrana por los
extremos con 2 pinzas y ligeramente doblada en el centro y lentamente humedecer con la solución de
desnaturalización.

6. Liberar la membrana y sumergir suavemente durante 5 minutos en la solución de

desnaturalización. Luego colocarla encima del gel de agarosa.

7. Recorte el papel de filtro de “blotting” del mismo tamaño del gel y la membrana de nylon. Colocar
el papel de filtro encima de la membrana. Luego se procede a poner mucho papel absorbente 4-5 cm de
grosor encima del filtro de “blotting”.

Colocar una bandeja o placa de cristal y colocar por ejemplo un vaso de 400 ml vacío como peso.

8. Permitir que la transferencia progrese durante 4 horas o toda la noche.

9. Eliminar la placa de vidrio, vaso y papeles absorbentes.

 10. Con guantes enjuagados y pinzas voltear el conjunto (gel-membrana-papel de filtro) de forma
que descanse sobre el papel de filtro.

11. Utilizando pinzas retirar el gel de la membrana. El gel puede ser descartado y se observará que
está deshidratado

12. Poner la membrana encima de un montón de papel seco con el ADN hacía arriba (el lado que
estuvo en contacto con el gel).

13. Para unos resultados óptimos, secar y fijar el ADN completamente a la membrana. Para ello
colocar la membrana entre dos hojas de papel de filtro y colocar a 80ºC durante 30 minutos.

3. Detección no-isotópica del ADN

Durante este proceso se podrá visualizar el ADN en la membrana. El “Blue Blot DNA Stain” es un reactivo
no-isotópico desarrollado para su uso, que elimina los problemas asociados al uso de isótopos radiactivos.

1. Colocar la membrana con el ADN en 100 ml de la solución diluida de “Blue Blot DNA Stain” durante
10-15 minutos.

2. Sacar la membrana con pinzas y colocar en 200 ml de agua destilada.

3. Cambiar el agua destilada 3 o 4 veces hasta que la membrana está desteñida y las bandas de
ADN son claramente visibles.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES

Esta técnica puede proveer información que puede ser usada para el diagnóstico molecular de algunas
enfermedades génicas, por ejemplo:

• Síndrome de Angelman
• Síndrome de Prader-Willi
• Síndrome X frágil

Esta técnica resulta ser la más sensible para el diagnóstico de algunas patologías como es el caso del
Síndrome Angelman y el Síndrome de Prader-Willi.

El diagnóstico consiste en la realización de un test de metilación mediante PCR por tratamiento con
bisulfito, basándose en el ADN por medio del estudio de la metilación del locus PW71.

BIBLIOGRAFÍA

1. National Human Genome Research Institute. [Online]; 2020. Acceso 27 de Noviembre de 2021.
Disponible en: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Southern-Blot.

2. BIOTED. [Online]; 2019. Acceso 27 de Noviembrede 2021. Disponible en:

https://bioted.es/protocolos/SOUTHERN-BLOT-ANALISIS.pdf.

3. Dermatología Peruana. [Online]; 1999. Acceso 27 de Noviembrede 2021. Disponible en:

https://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v09_sup1/tecnicas.htm.

4. Wikipedia La enciclopedia libre. [Online]; 2021. Acceso 26 de Noviembrede 2021. Disponible en:
https://es.wikipedia.org/wiki/Southern_blot.

5. Stacie Loftus PD. National Human Genome Research Institute. [Online].Acceso 27 de Noviembre
de 2021. Disponible en: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Southern-Blot.