En la hibridación in situ directa, la molécula informadora fluorescente se une a la sonda de ácido nucleico para que los

híbridos que se han formado puedan visualizarse microscópicamente inmediatamente después de la hibridación in
situ. En los procedimientos indirectos, la sonda contiene un elemento que la hace detectable mediante pasos de
marcado adicionales (por ejemplo, unión a biotina-estreptavidina o inmunocitoquímica); de ahí el término "indirecto".
Se han descrito varias de tales modificaciones de hapteno. Los métodos directos también son susceptibles de
amplificación inmunocitoquímica si los anticuerpos contra las moléculas indicadoras están disponibles.

Los sucedáneos actualmente en uso incluyen biotina, digoxigenina y fluoresceína. La fluoresceína tetra-metil-rodamina,
el ácido amino-metil-cumarina acético (AMCA) y una serie de tintes de cianina se usan ampliamente como
fluorocromos, proporcionando una buena cobertura espectral en las longitudes de onda visuales e infrarrojas. Aunque
existen métodos químicos para el etiquetado de ADN, generalmente los haptenos y fluorocromos se incorporan
enzimáticamente en el ADN recién sintetizado utilizando dUTP modificado con fluorocromo hapteno. El derivado de
alilamina de dUTP se puede fluorocromar o haptenizar, por ejemplo, utilizando ésteres de N-hidroxisuccinimida de
haptenos y fluorocromos.

Su uso para la síntesis enzimática de sondas no radiactivas fue un logro importante porque se ajustaba estrechamente a
los formatos de biología molecular existentes para el marcaje radiactivo de ácidos nucleicos que emplean ADN
polimerasas (p. Ej., Mediante traducción de Nick o marcaje cebado al azar). Este logro condujo a la aplicación
generalizada de sondas no radiactivas en hibridación in situ.

Los métodos FISH han alcanzado altos estándares de sensibilidad, resolución y multiplicidad.

La sensibilidad de un procedimiento FISH se define como el objetivo de secuencia de ácido nucleico más pequeño
detectable. Al analizar la sensibilidad de los FISH, es útil considerar una visión simplificada del genoma humano que
consiste en secuencias únicas y repetidas. Las secuencias repetidas pueden estar agrupadas o dispersas. Los ejemplos
relevantes de repeticiones agrupadas son los ADN alfoides, que se encuentran en los centrómeros cromosómicos, y las
repeticiones satélites simples, que se producen en regiones heterocromáticas. Su naturaleza agrupada les da un alto
grado de especificidad cromosómica, y su alto número de copias los hace fácilmente detectables por FISH. Las
repeticiones Alu y Kpn son ejemplos de repeticiones dispersas. Debido a su naturaleza dispersa, estos no son útiles
como marcadores y aumentarán el fondo cuando estén presentes en las sondas. Casi siempre están presentes en clones
de inserción grande; por lo tanto, un problema técnico importante cuando se realiza FISH con sondas genómicas
grandes es la necesidad de eliminar tales secuencias repetidas que se producen dispersamente de la participación en
la reacción de hibridación in situ. Esto se realiza preanalizando el ADN marcado con ADN no marcado enriquecido para
repeticiones en un proceso conocido como supresión de hibridación in situ.

En los cromosomas de metafase, los objetivos únicos > 30 a 40 kb (tamaño del inserto cósmido) son fácilmente
detectables por microscopía después de FISH indirecta. En general, > 90% de las celdas mostrarán el número de copia 2 ×
2 esperado. La aparición de manchas pareadas en las cromátidas hermanas es un fuerte signo de especificidad, y se
pueden tolerar algunas manchas de fondo inespecíficas. A medida que disminuye el tamaño de la sonda, la eficiencia de
detección cae hasta el punto de que con 1 a 2 kb de objetivo único, la eficiencia de detección de FISH es tal que es
necesario algún análisis estadístico para asignar la sonda a una banda cromosómica. El FISH cromosómico sub-kb exitoso
es raro.

En las células interfásicas, 30 a 40 kb del objetivo también se pueden detectar fácilmente por microscopía, pero el fondo
debe reducirse al mínimo porque, a diferencia del FISH cromosómico, no hay ningún indicador de especificidad
disponible.

Con FISH de fibra de ADN (Wiegant et al., 1992), que utiliza ADN desnudo inmovilizado en portaobjetos de vidrio, la
sensibilidad es mucho mejor, probablemente como consecuencia de la alta accesibilidad del ADN desnudo a las
sondas y los reactivos de detección inmunológica. Los plásmidos genómicos de 1 a 2 kb de tamaño se visualizan
fácilmente, aunque la sensibilidad es mejor cuando se hibrida con clones genómicos más grandes (por ejemplo,
cósmidos). Recientemente, se han detectado objetivos únicos de 200 pb de tamaño, proporcionando los medios para el
mapeo de exones (grandes). La imagen digital se recomienda en tales casos. Los métodos indirectos de FISH son más
sensibles que los directos. Los métodos directos generalmente se recomiendan para objetivos repetidos, como los ADN
satelitales. Sin embargo, también es factible FISH cromosómico e interfásico utilizando cósmidos y YAC directamente
marcados como sondas. Recientemente se han logrado mejoras en la sensibilidad de FISH mediante el uso de
tirámides marcadas con hapteno o fluorocromo y peroxidasa de rábano picante. Este enfoque en realidad combina los
potenciales de sensibilidad de la fluorescencia y los esquemas de detección basados en enzimas. Es de particular valor
en situaciones donde la relación señal-fondo es subóptima… TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR, Raap, 1997,
Países bajos.

La automatización y la alta sensibilidad han llevado a la masificación del PCR en el diagnóstico y monitoreo de
neoplasias.

La metodología de RT-PCR amplifica el ARN y consta de: primero, emplea una enzima, la transcriptasa inversa, que
convierte el ARN en ADN complementario monocatenario (transcripción reversa), que en el segundo paso sirve como
plantilla para la PCR convencional (reacción en cadena). El ARN original es degradado por RNasa. Se realiza en tejido
fresco o fijo. Es ampliamente utilizado en el diagnóstico de genopatías, ya que hace que sea más fácil detectar la
presencia de aberraciones específicas al detectar directamente el ARNm, ejemplo: transcripciones de fusión codificadas
por las translocaciones. Además, es muy útil para controlar el tratamiento en algunas neoplasias hematológicas, ya
que permite la cuantificación de los productos analizados. Esta PCR cualitativa no puede detectar cambios específicos en
el monitoreo de pacientes con enfermedad mínima residual. Esto a menudo se asocia con una mala calidad de ARN.

La PCR cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR; qRT-PCR; qPCR) se convirtió en una herramienta más poderosa para
monitorear pacientes, brindando mejor oportunidad de detectar las primeras etapas de la recaída molecular. Esta
técnica permite la amplificación y detección simultánea de productos de PCR en un solo tubo de reacción. Ésta se
monitorea en tiempo real después de cada ciclo de amplificación mediante software que permite la detección y
cuantificación de productos de PCR. Después de cada ciclo de amplificación, se libera un tinte y su cantidad se mide en
tiempo real para garantizar que la cuantificación del ADN se produzca en la fase exponencial. Los resultados se
presentan en forma de un gráfico que traza el tinte (correspondiente a la cantidad de la plantilla inicial) frente al
número de ciclos de PCR (Figura 1.31). La cuantificación se basa en el número de ciclos necesarios para alcanzar un
umbral designado (cuanto menor es el número de ciclos para alcanzar el umbral, mayor es la expresión del número de
copia de ARNm o ADN), utilizando los métodos de enfriamiento basados en fluorescencia (energía de resonancia de
fluorescencia transferencia; FRET). Los sistemas más utilizados para qRT-PCR incluyen el sistema Taq Man, balizas
moleculares, escorpiones y SYBR green. Las sondas Taq Man dependen de la actividad nucleasa 5' de la ADN polimerasa
utilizada para la PCR para hidrolizar un oligonucleótido que se hibrida con el amplicón diana. Los fluorocromos
utilizados en Taq Man (reporteros) incluyen FAM, HEX/JOE/VIC y TET. La señal de fluorescencia es apagada por
TAMRA o DABCYL (atenuadores). La figura 1.32 ilustra la química de la metodología Taq Man. En el estado no
hibridado, el fluorocromo (indicador) y el interruptor están cerca uno del otro, lo que permite FRET (no hay señal
fluorescente de la sonda porque la fluorescencia del colorante indicador se está apagando). Durante la PCR, cuando la
polimerasa Taq replica una plantilla y la actividad exonucleasa 5' de la polimerasa degrada la sonda, el indicador y el
desactivador se desvinculan y ya no se produce FRET. Por lo tanto, la fluorescencia aumenta en cada ciclo,
proporcional a la cantidad de escisión de la sonda.