Laboratorio 1: Aporte nutricional de las macromoléculas
OBJETIVOS
 Conocer los principios de la técnica de electroforesis SDS-PAGE.
 Observar el perfil de proteínas de las diferentes fracciones obtenidas durante la purificación de la caseína por
cromatografía de intercambio iónico.
INTRODUCCIÓN
La nutrición es la toma y uso de alimentos por un
organismo. Este es el proceso por el cual, los seres
vivientes obtienen energía de los alimentos y bebidas con
el propósito de crecer y mantenerse. La nutrición es
interpretada como un estudio de los procesos orgánicos
por los cuales un organismo asimila y usa los alimentos
para el funcionamiento normal, crecimiento y
mantenimiento. La nutrición es un proceso de tres partes:
la primera, consumo de comidas y bebidas, la segunda el
rompimiento de esos alimentos o bebidas en nutrientes y
la tercera, el viaje de esos nutrientes a través del torrente
sanguíneo a diferentes partes del cuerpo para ser usados
como “combustible” y para otros propósitos. Para un
organismo obtener una adecuada nutrición, éste debe
comer y beber comidas que contengan nutrientes claves.
Los alimentos pueden ser clasificados con base en su
valor nutritivo, este viene dado por la cantidad de
nutrientes que aportan a un organismo cuando son
consumidos. Estos nutrientes pueden ser lípidos,
glúcidos, proteínas, vitaminas y minerales. El valor
nutritivo es diferente en cada grupo de alimentos,
algunos alimentos poseen más o menos nutrientes que
otros. Es por eso, que para clasificarlos se debe tomar en
cuenta el nutriente que más abunda en su composición.
Los alimentos también cumplen distintas funciones en el
organismo. De acuerdo a su función los alimentos se
clasifican en:
 Energéticos: Estos alimentos son los glúcidos y los
lípidos
 Reparadores: Los alimentos más importantes de este
grupo son las proteínas
 Reguladores: Estos alimentos contienen sustancias
que utiliza el organismo en cantidades muy
pequeñas para asimilar correctamente los alimentos
y así contribuir a coordinar el funcionamiento del
cuerpo. Se considera que estos alimentos no aportan
calorías al organismo. En este grupo se encuentran
las vitaminas; también se incluyen los minerales y el
agua
Uno de los alimentos más importantes que deben estar
en la dieta de un organismo como el ser humano es la
leche que contiene macromoléculas como los glúcidos y
los lípidos que la hacen ser un alimento energético,
adicionalmente cuenta con una cantidad considerable de
proteínas formando parte de los alimentos reparadores.
Se entiende como leche al producto integral del ordeño
total e ininterrumpido, en condiciones de higiene que da
la vaca lechera en buen estado de salud y alimentación.
Esto además, sin aditivos de ninguna especie. Agregado
a esto, se considera leche, a la que se obtiene fuera del
período de parto. La leche de los 10 días anteriores y
posteriores al parto no es leche apta para consumo
humano. Siempre el ordeñe debe ser total, de lo contrario
al quedar leche en la ubre, la composición química de
esta cambiará.
Leche fluida entera
Leche a granel higienizada, enfriada y mantenida a 5°C,
sometida opcionalmente a terminación, pasteurización
y/o estandarización de materia grasa, transportada en
volúmenes de una industria láctea a otra para ser
procesada y envasada bajo normas de higiene.
La leche fluida entera puede ser sometida a
procedimientos de higienización por calor. Procesos de
ultra alta temperatura (UAT ó UHT), que consisten en
llevar la leche homogenizada a temperaturas de 130°C a
150°C durante 2 a 4 segundos, permiten higienizarla de
forma apropiada y de manera que estas puedan llegar en
forma segura al consumidor. Las leches pueden ser
modificadas en su contenido graso.
La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina,
riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K),
minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en
pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo todos los
aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y
lípidos. Los únicos elementos importantes de los que
carece la leche son el hierro y la vitamina C.
Las proteínas se pueden clasificar de manera general en
proteínas globulares y fibrosas. Las proteínas globulares
son aquellas que tienden a agregarse en formas
esferoidales y no establecen interacciones
intermoleculares como son los puentes de hidrógeno
(característicos de las proteínas fibrosas) siendo
solubilizadas en suspensiones coloidales. En la leche hay
tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto
globulinas (todas globulares).
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo
fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación
y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un
grupo de proteínas que están químicamente unidas a una
sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la
mayoría de los grupos fosfato están unidos por los
grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La
caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica
(caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77%
al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2.7%
en composición de la leche líquida.
La caseína está formada por alpha(α1), alpha(α2)–
caseína, β–caseína, y kappa–caseína formando una
micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son
solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la
kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas
por separado se forma un complejo de caseína que es
solubilizado en forma de micela. Esta micela está
estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y
beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de
iones calcio.
La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos
fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella.
También tiene todos sus residuos de serina y treonina
con sus correspondientes grupos hidroxilo, así como los
carbohidratos dispuestos en una sola cara de su
superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente
soluble en agua gracias a los grupos polares que posee.
La otra parte de su superficie se une fácilmente a las alfa
y beta caseína insolubles, lo que da lugar a la formación
de la micela.
La propiedad característica de la caseína es su baja
solubilidad a pH 4.6. El pH de la leche es 6.6
aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada
negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se
añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie
de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se
protonan) y la proteína neutra precipita.
La conformación de la caseína es similar a las proteínas
desnaturalizadas globulares. El alto número de residuos
de prolina en la caseína causa un especial plegamiento
en la cadena de proteína e inhibe la formación de una
fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no
contiene puentes disulfuro. De igual manera la falta de
estructura secundaria es importante para la estabilidad
de la caseína frente a la desnaturalización por calor. La
carencia de estructura terciaria facilita la situación al
exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la
unión entre unidades proteicas y la convierte en
prácticamente insoluble en agua. En cambio es
fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones
salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico.
La función biológica de las micelas de caseína es
transportar grandes cantidades de Ca y P altamente
insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un
coagulo en el estomago para favorecer una nutrición
eficiente. Además de caseína, Ca y P la micela formada
también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas
plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6 – 12%
del volumen total de la leche.
Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante
cuando se precipita la caseína en medio ácido son
proteínas globulares, hidrofílicas y fácilmente solubles en
agua así como susceptibles de desnaturalización por
calor. Las principales son β–lactoglobulina, α-
lactalbumina, bovine serum albumin (BSA), y
inmunoglobulinas (Ig).
La caseína se emplea en la industria para la fabricación
de pinturas especiales y en el apresto de tejidos, la
clarificación de vinos, la elaboración de preparados
farmacéuticos y la fabricación de plásticos. La pintura de
caseína ha sido usada desde la antigüedad por los
egipcios.
Punto isoeléctrico
Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren
una carga cuando se dispersan en agua. Una
característica de las proteínas y otros biopolímeros es
que la carga total que adquieren depende del pH del
medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta
dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y
de los aminoácidos que la componen, así como de las
cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la
proteína de forma covalente (irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína,
los radicales libres pueden existir en tres formas
dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y
aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta
positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente
ácido debido a que los grupos COOH de los aminoacidos
aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero
los grupos amino de arginina y lisina estarían protonados
(–NH3+).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio
con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya
que en este caso los grupos carboxilo estarían
desprotonados (COO–) y los grupos amino estarían en su
forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH
característico al cual su carga neta es cero. A este pH se
le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto
isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas
positivas y negativas por lo que la proteína presenta su
máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su
solubilidad y facilitar su agregación.
Si suponemos una proteína formada únicamente por
aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga neta
de la proteína dependería exclusivamente de la
protonación/desprotonación de los grupos amino y
carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están
formadas por multitud de aminoacidos unidos mediante
enlaces peptídicos y la carga va a depender de los
grupos ionizables que poseen los aminoacidos que la
componen y del pH del medio.
Determinación colorimétrica del contenido de
proteínas en leche de vaca
Con frecuencia se nos presenta el problema de tener que
analizar proteína en una muestra de alimento, como
puede ser la leche de vaca entera. En este tipo de casos
es bueno saber el contenido aproximado de proteína de
la muestra (en el caso de la leche de vaca está en torno
al 2-3% p/v) para hacer las diluciones pertinentes que
nos permitan encajar la muestra en la recta patrón. Lo
que se pide en este caso es que el alumno haga
precisamente eso y obtenga un valor exacto del
contenido proteico de una muestra de leche de vaca.
Electroforesis
La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de
poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis
en poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel
electrophoresis) es sin duda alguna una de las técnicas
más ampliamente usada para caracterizar mezclas
complejas de proteínas. La electroforesis en
poliacrilamida es un método conveniente, rápido y
económico a nivel de muestra pues se requieren sólo
cantidades del orden de microgramos de proteína.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se
encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de
su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de
desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La
velocidad de migración es proporcional a la relación entre
las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga
por unidad de masa más rápida será la migración.
Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y
aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a
los electrodos se pueden determinar diferencias de carga
neta (carga total/masa) entre proteínas. Este método se
denomina electroforesis zonal. La matriz de
poliacrilamida no es un buen soporte para este método
pues la migración de las proteínas en su seno no sólo es
proporcional a la carga neta sino también al tamaño y
forma de las proteínas.
Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es
que son químicamente inertes, transparentes y estables
en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica.
Algunas características destacables de la electroforesis
en geles de poliacrilamida son:
Los geles de poliacrilamida se forman por la
polimerización de la acrilamida por acción de un agente
entrecruzador (cross – linking), la bis-acrilamida en
presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador MATERIALES Y REACTIVOS
se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y Los siguientes materiales y reactivos son de uso general:
como catalizador el ión persulfato (S2O8 –) que se añade
en forma de persulfato amónico. En algunas situaciones,  Soluciones buffer pH 4.0 y 7.0 para calibrar el
como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la potenciómetro
presencia de persulfato puede interferir con la  Potenciómetro
electroforesis se emplean riboflavina y TEMED.  Espectrofotómetro
 Leche entera corriente (1 litro)
Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el  Cámara de electroforesis
oxígeno es un inhibidor de la polimerización. Además,  Fuente de poder
durante la polimerización se libera calor que podría  Reactivo de Bradford
provocar la formación de burbujas en el seno del gel. La  Patrón de albúmina de huevo 0.02 mg/ml
velocidad de polimerización viene determinada por la  Un juego de micropipetas
concentración de persulfato (catalizador) y TEMED
(iniciador).
MATERIAL
CANTIDAD TIPO
REACTIVOS
La porosidad del gel la determina las proporciones
relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo menor Vaso de precipitado
10 Agua destilada
el poro cuanta más bisacrilamida vs acrilamida se use. de 25 ml
Vaso de precipitado
2 Acetato sódico 0.1 N
El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina de 50 ml
el rango de separación del gel. Habitualmente los geles vaso de precipitado
1 Ácido acético 0.01 N
se denominan en función del % de de 250ml
acrilamida/bisacrilamida que contienen. Así, la mayoría 10 tubos de ensayo Ácido acético 0.1 N
de las proteínas se separan bien en el rango 5 a 10%. Un 1 Probeta de 50ml Ácido acético 1.0 N
menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para Matraz aforado de 50
1 NaOH 1N
separar proteínas de gran tamaño. ml
pipeta graduada de
1 Éter etílico
En función del estado de las proteínas (nativo o 5.0 ml
desnaturalizado) a lo largo del proceso electroforético pipeta graduada de
1 Etanol al 70%
éstas se clasifican en electroforesis nativas o 1.0 ml
desnaturalizantes. pipeta graduada de
1
10.0 ml
Una electroforesis desnaturalizante, la más común, es la Embudo de vidrio
que somete a las proteínas a migración asegurando la 1
mediano
completa desnaturalización (pérdida de la estructura 1 Termómetro
tridimensional). En esta situación la migración es Papel de filtro
proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero
no a su forma. El agente desnaturalizante más empleado Nota: Las soluciones que se requieren para la
es el sodiododecilsulfato o SDS, un detergente. electroforesis se adjuntan en el Anexo 1, estas
soluciones ya han sido previamente preparadas para la
Una electroforesis nativa es la que somete a las práctica en el laboratorio
proteínas a migración sin desnaturalización. En esta
situación las proteínas migran en función de su carga, de PROCEDIMIENTO
su tamaño y de su forma. Además se mantienen en Aislamiento de caseína
ciertos casos las interacciones entre subunidades y entre Calentar en un vaso de precipitado 100mL de agua
proteínas, separándose los complejos. Los sistemas destilada a 38°C, añadir 50mL de leche. Luego agregar
tampón empleados en estos caso son: tris-glicina (rango gota a gota con bureta y con agitación ácido acético 1N,
de pH 8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris- hasta que se observe un precipitado, es decir, la leche se
acetato (rango de pH 7.2 a 8.5). corte.

Precipitar, centrifugar y guardar para utilizar en
procedimiento de electroforesis (solución A). Lavar el
precipitado con 20mL de etanol y centrifugar nuevamente
(solución B).
Pesar un vaso de precipitados pequeño y colocar el
precipitado en él, volver a pesar el vaso; a continuación,
adicionar 10 mL de éter etílico, centrifugar y recoger
centrifugador (solución C).
Añadir 1mL de la solución de caseína a cada vaso. (Para
esto usted gastara 10ml de la solución de caseína). La
fracción sobrante, se debe guardar como solución D.
Agitar suavemente y esperar aproximadamente 3
minutos, luego medir la absorbancia de cada muestra a
640nm con cubetas de colorimetría de 1cm de paso
óptico. Anotar los resultados a fin de representar la
absorbancia frente al pH y determinar el pI aproximado
de la caseína.

Al finalizar queda un precipitado blanco de fácil Cuantificación de proteínas de la leche

manipulación, el cual es la caseína. Preparar las siguientes reacciones en 10 tubos de
ensayo:
Preparación de solución de caseína
Colocar aproximadamente 250mg de caseína en un vaso

Leche (ml)

Biuret (ml)
Agua (ml)

Albumina

Extracto
de precipitado de 50mL. Agregar 20mL de agua destilada

Tubo

(ml)

(ml)
y 5mL de NaOH 1N, agitar hasta completar la disolución
total de la caseína.

Una vez disuelta la caseína se vierte a un matraz aforado B 1,8 - - - 1,2

de 50mL, adicionar 5mL de ácido acético 1N y diluir con 1 1,6 0,2 - - 1,2
agua destilada hasta 50mL. La solución debe ser clara y 2 1,4 0,4 - - 1,2
limpia. 3 1,2 0,6 - - 1,2
4 1,0 0,8 - - 1,2
Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína 5 0,8 1,0 - - 1,2
Colocar en 10 vasos limpios y secos los siguientes Leche 1,6 - 0,01 - 1,2
volúmenes de los reactivos: Sln A - - - 1,8 1,2
Sln B - - - 1,8 1,2
Sln C - - - 1,8 1,2
Ácido pH
Acetato Ácido
acético resultante Sln D - - - 1,8 1,2
Tubo sódico acético Tabla 2: Volúmenes a utilizar de cada una de las soluciones en la
0,01N aproximado
0,1N (ml) 0,1N (ml) cuantificación de proteínas
(ml)
1 0,5 9,5 - 3,2
Agitar suavemente y esperar 15min a que se desarrolle el
2 1,0 9,0 - 3,6
color en la oscuridad y medir la absorbancia de cada tubo
3 1,5 8,5 - 3,8
a 595nm.
4 2,0 8,0 - 4,0
5 3,0 7,0 - 4,2 Electroforesis de las proteínas de la leche
6 4,0 6,0 - 4,5 Geles de corrida y apilamiento
7 6,0 4,0 - 4,7 La técnica de separación comúnmente utilizada se
8 8,0 2,0 - 5,1 denomina electroforesis discontinua. En esta se preparan
9 6,0 - 4,0 5,5 2 geles, el de corrida, donde se separan las proteína y el
10 8,0 - 2,0 6,1 de apilamiento o concentrado, que como su nombre lo
Tabla 1: Volúmenes a utilizar de cada uno de los mreactivos para
indica, concentra la mezcla.
determinación del pI

El gel de corrida que separará las muestras debe tener

Medir los pH de los vasos, los cuales debían cubrir un mayor concentración de Acrilamida (10%) y pH más
rango aproximado entre 3,0 y 6,5. Anotar los valores, que básico (8.3) de manera que ofrezca mayor resistencia en
deben ser semejantes a los expresados anteriormente. la corrida a los polipeptidos.
 Gel de apilamiento
El gel de apilamiento posee baja concentración de Luego de polimerizado el gel de corrida, descargar el
acrilamida (4%) en tampón ligeramente ácido (Tris/HCl agua de la superficie del mismo y preparar 4ml del gel de
1M pH 6.8), de forma que ofrezca poca resistencia a la apilamiento (4%) según se muestra a continuación:
mezcla de proteínas sometidas a electroforesis por tanto
lo atraviesan con relativa rapidez. Solución Volumen
Agua destilada 2.7mL
Una vez preparado y polimerizado el gel de corrida, se Acrilamida-bisacrilamida 30% 0.67mL
prepara, en la parte superior de este el gel de Tris/HCl 1M pH 6.8 0.5mL
apilamiento. Bajo la acción del campo eléctrico, la mezcla SDS 10% 40µL
proteica, colocada sobre el gel de apilamiento, comienza Persulfato de amonio 10% 40µL
a migrar hacia el polo positivo. TEMED 4µL
Cuando las proteínas atraviesan el gel de apilamiento, se Tabla 4: Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del
encuentran con la resistencia ejercida por el gel de gel de apilamiento
corrida de manera que aquellas proteínas retardadas
puedan alcanzar al resto y todas inicien la separación Verter suavemente el contenido del gel de apilamiento
desde el mismo punto, mejorando así la calidad de la sobre el gel de corrida polimerizado y colocar el peine
corrida. El gel de apilamiento se prepara siempre a una cuidadosamente para que no se formen burbujas.
concentración de acrilamida 4%, mientras que el gel de Esperar unos 10min hasta que polimerice la acrilamida.
separación o gel de corrida se prepara según el rango
óptimo de resolución: Colocación de las muestras
Cuando el gel de apilamiento haya polimerizado, colocar
Gel de corrida el cassette en el tanque de electroforesis con
Ensamblar, según instrucciones, el cassette que consta aproximadamente 500mL del tapón de corrida en el cual
de soportes, vidrios y separadores. Preparar el gel de se encuentran los electrodos sumergidos. Quitar
corrida. El volumen del gel de corrida deberá calcularse cuidadosamente el peine para que quedaran libres los
dependiendo del grosor del gel. Por lo general se pocillos del gel. Se colocaron cuidadosamente las
preparan 10ml de acrilamida 10% así: muestras con una micropipeta.

Solución Volumen Muestras:

Agua destilada 4mL  Leche 2µL
Acrilamida-bisacrilamida 30% 3.3mL Colorín 18µL (Solución con Azul de Coomassie)
Tris/HCl 1.5 M pH 8.8 2.5mL  Solución A 10µL
SDS 10% 100µL Colorín 10µL
Persulfato de amonio 10% 100µL  Solución B 10µL
TEMED 4µL Colorín 10µL
Tabla 3: Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del
gel de corrida
 Solución D 10µL
Colorín 10µL
Verter cuidadosamente la solución de acrilamida con una  Suero de sangre humana 20µL (En el caso de la
pipeta Pasteur en el contenedor representado por 2 sangre, después de extraída del cuerpo, se
vidrios sujetos al cassette y distanciados por unos centrifugo y de ahí se tomó el suero)
separadores. Dejar aproximadamente 1,5cm de distancia
entre la solución de acrilamida y el vidrio frontal. Someterlas a calentamiento (100°C) por 5 minutos e
inmediatamente sacarlas a hielo, luego sembrar 20µL de
Luego de añadido el gel de corrida y previo a la las muestra en los pocillos de los geles de la
polimerización, añadir suavemente agua destilada para electroforesis. Incluir un estándar de peso molecular en
evitar que el borde del gel polimerice de manera irregular. uno de los pocillos (10µL).
Esperar unos 15min para una polimerización total del gel.
Someter las muestras a electroforesis aplicando una
corriente de 100mA y observar la corrida por 40 minutos.
Finalizada la corrida extraer los vidrios del cassette
cuidadosamente y separarlos de manera tal que el gel
quedara posado sobre uno de los vidrios. Sumergir el gel
en una solución colorante (1g de azul de Coomassie,
459ml de metanol, 450ml de agua destilada y 100ml de
ácido acético glacial) por 3 horas. Transcurrido el tiempo,
sumergir el gel en una solución decolorante (100ml
metanol, 100ml de ácido acético glacial, 800ml de agua
destilada) para eliminar las asociaciones inespecíficas
del gel al colorante. Observar las bandas proteicas.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia
para la determinación del punto isoeléctrico de la
caseína?
2. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína?
Determínelo con los datos de su experimento y
compárelo con el obtenido por bioinformática.
3. ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en
el pI?
4. ¿Cuál es el peso aproximado de las proteínas de la
caseína?
5. ¿Cuál es la concentración de la solución de caseína?
BIBLIOGRAFÍA
Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de
Laboratorio. Limusa Wiley, México
Bollag D.M., Edelstein S.J., (1.994) “Protein methods”.
WileyLiss Publications. USA. 229 pp
Cooper T. (1.984) “Instrumentos y Técnicas
Bioquímicas”. Editorial Reverté. España. 442p
ANEXO
1. Tris/HCl 1,5M pH 8.8, 100 ml:
Pesar 18,15 g de Tris, disolver el Tris en 50ml de agua
destilada, añadir gota a gota HCl concentrado hasta que
el pH baje a 8.8, completar con agua destilada hasta el
volumen final (100ml)
2. Tris/HCl 1 M pH 6.8, 100ml:
Pesar 12,1 g de Tris, disolver el Tris en 50ml de agua
destilada, añadir gota a gota HCl concentrado hasta que
el pH baje a 6.8, completar con agua destilada hasta el
volumen final (100ml)
3. SDS 10% (p/v), 100ml:
Pesar 10 g de SDS, añadir agua destilada hasta
completar el volumen de 100ml, información de
seguridad: El SDS es un polvo fino neurotóxico, por lo
tanto se debe usar máscara, guantes y lentes de
protección para su manipulación.
4. Glicerol 50% (v/v), 100 ml:
Tomar un volumen de 50ml de glicerol al 100%, añadir
50ml de agua destilada
5. Azul de Bromofenol 1% (p/v), 10ml:
Pesar 100mg de azul de bromofenol, completar con agua
destilada hasta 10ml y mezclar hasta disolver, filtrar la
solución en papel Whatman No 1 (o cualquier papel de
filtro) para eliminar el colorante no disuelto
6. Acrilamida 30% (100ml):
La solución de acrilamida al 30% (p/v) es una mezcla de
acrilamida (29,2g) y Bisacrilamida (0,8g), pesar ambos
reactivos y añadir agua destilada hasta 100ml, filtrar en
papel de filtro Whatman No.1
Información de seguridad: La acrilamida en polvo y en
solución es neurotóxica, por lo tanto se debe usar
máscara, guantes y lentes de protección para su
manipulación.
7. Persulfato de amonio al 10% (p/v), 5 ml:
Pesar 0,5g de persulfato de amonio, disolver en 5ml de
agua destilada
8. Solución Tampón de corrida, 1 L:
Pesar 3 g de Tris (25mM), pesar 14,4g de glicina
(192mM), pesar 1g de SDS (0,1%), añadir agua destilada
hasta completar 1 litro
NOTA: El pH debería ser de aproximadamente 8,3. Se
puede preparar una solución 10 veces concentrada y
diluir el volumen necesario en el momento de la corrida
electroforética. Esta solución puede almacenarse
indefinidamente a Temperatura ambiente.
9. Tampón muestra 5X, 10 ml:
0,6ml de Tris/HCl 1M pH 6,8 (solución 2) 60mM , 5ml de
Glicerol 50% (solución 4) 25%, 2ml de SDS 10%
(solución 3) 2%, 0.5ml de 2 mercaptoetanol 14.4mM, 1ml
de azul de bromofenol (solución 5) 0,1% 0.9ml de agua
destilada

NOTA:
Las soluciones 1, 2 y 6 son estables por meses a 4°C.
Las soluciones 7 y 9 deben ser almacenadas a –20°C. El
resto a temperatura ambiente.

Corregido por: Diana Ximena Hurtado Varela