Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia

Escuela de Química Biológica
Depto. de Bioquímica
QF y Biología 2023
Yessica Amarilis Orellana Gómez QF 201701238
sección B

Pre laboratorio No. 5 -Métodos de Separación de Aminoácidos y Proteínas

DIAGRAMA DE FLUJO

Diagrama no.1 - Cromatografía de capa fina

Diagrama no.2 - Cromatografía exclusión molecular
.
Diagrama no.3 - Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina (por grupo de

trabajo)
Diagrama no.4 - Separación de proteínas por cromatografía en columna (filtración en gel o
intercambio iónico)
Diagrama no.5 - Electroforesis de proteínas SDS-PAGE
CUESTIONARIO

Cromatografía en capa fina

1. ¿Qué variantes de cromatografía en capa fina existen? Enumérelas.

- Cromatografía en gel de sílice
- Cromatografía en celulosa
- Cromatografía en poliaminas
- Cromatografía por partición
- Cromatografía de absorción
(Walton, 2005).

2. ¿Qué factores son utilizados para la determinación del valor Rf?

La relación de frentes Rf se calcula para cada componente midiendo las distancias desde la
línea de siembra hasta el centro de la mancha correspondiente a cada analito y desde la línea de
siembra hasta el frente del solvente (Harold y Reyes,2005, p.323).

3. ¿Por qué es necesario que la cámara cromatográfica esté saturada antes de colocar la
cromatoplaca?
La cámara debe de estar saturada porque el método que se utiliza es por capilaridad y se debe
de conseguir una saturación máxima de la atmósfera de la cámara para poder obtener los
resultados esperados (Harold y Reyes, 2005).

4. En cromatografía en capa fina, ¿qué significa el término revelado?

El relevado es un procedimientos químicos, físicos o biológicos aplicados a la placa para hacer
visibles los depósitos (manchas) de las sustancias separadas por cromatografía (Villaverde,
Gaitan, Mendoza y Ramirez, 2005)

5. ¿Por qué razón no se debe tocar la cromatoplaca directamente con los dedos?
Se busca obtener una fase móvil uniforme por lo que al tocar la cromatoplaca con las manos se
podría dañar la capa de sílica gel y fracturar la columna, la cual nos diaria una fase móvil no
uniforme (Cifuentes, 2013).

6. ¿Por qué razón es necesario marcar el punto de origen a partir del cual se colocan las
muestras en la cromatoplaca?
La distancia de migración del soluto se puede medir desde el punto de origen hasta el centro
geométrico de la mancha o punto de máximo ascenso de la mancha o a los límites de la mancha
principal o a los de su cola. Lo que importa es la constancia en la forma de medir las distancias.
(Cardona, 2010)

7. ¿Por qué se hace más de una aplicación por cada muestra?

Para evaluar la variabilidad que puede presentar dicha sustancia y disminuir el margen de error
de la muestra (UAM, S. f).

8. ¿Cuál es la razón por la cual el diámetro de la mancha debe ser pequeño?

En toda la cromatografía, se intenta conseguir una buena resolución o separación de los
componentes de una mezcla. Es decir, que no se superpongan las manchas de cada componente,
que estas manchas sean lo más compactas posible y que, con un control mínimo, sean
reproducibles las velocidades con que se mueven las sustancias y el frente del disolvente
(Cardona, 2010).
Cromatografía en columna

9. Describa las características químicas (estructura, descripción, usos) del gel empleado por
su grupo en la electroforesis en columna.
Poliacrilamida:
● Son polímeros sintéticos formados a partir de monómeros de acrilamida. En función
del número de monómeros diferentes que forman el polímero, tenemos:
homopolímeros, copolímeros, terpolímeros, etc.
● Los geles de poliacrilamida actúan a modo de tamiz molecular retardando el
movimiento de macromoléculas grandes mientras que permiten a moléculas más
pequeñas moverse libremente, potenciando de esta forma la separación.

La agarosa:
● Polímero natural, polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de las
algas de los géneros Gellidium y Gracillaria; es soluble en agua a temperaturas
superiores a los 65ºC, dependiendo del grado de sustituciones hidroxietílicas de sus
cadenas laterales.
● Se utiliza comúnmente para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma.
Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas
como el ADN, el ARN y las proteínas (EDVOEK, 2016)

10. Explique el principio de separación que corresponde a la cromatografía en columna

empleado por su grupo.
La cromatografía en columna es un método en donde se utiliza una columna de vidrio vertical
que es llenada con un soporte sólido adsorbente como lo es el gel de sílice o alúmina, esta parte
es conocida como la fase estacionaria. La muestra que será utilizada para separarla , es
depositada en la parte superior de este soporte y el resto de la columna es llenado con un
disolvente el cual constituye la fase móvil, esta fase es dirigida por el efecto de la gravedad, la
cual hace que que la muestra se mueva a través de la columna. Durante el proceso se llega a un
equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente fluye por
toda la columna debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá
interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, estos serán transportados a
diferentes velocidades y asi se podra obtener la separación (Durst y Gokel, 2007)

11. Tomando en consideración que se requiere de 10 mL de agua para hidratar 1 g de

Sephadex G-50, indique cuál sería el volumen de agua dentro de las partículas de gel (Vi)
en una columna preparada a partir de 3 g de este Sephadex.
10𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 − −> 1𝑔 𝑠𝑒𝑝ℎ𝑎𝑑𝑒𝑥 𝐺 − 50
𝑋 − −> 3𝑔 𝑠𝑒𝑝ℎ𝑎𝑑𝑒𝑥 𝐺 − 50
10𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 ∗ 3𝑔 𝑠𝑒𝑝ℎ𝑎𝑑𝑒𝑥 𝐺 − 50
𝑋= = 30𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎
1𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑝ℎ𝑎𝑑𝑒𝑥

12. ¿Qué diferencia existe entre el Sephadex G-100 y el G-150, con respecto a su capacidad
de separación de mezclas de proteínas y de polisacáridos?
Cada tipo de Sephadex tiene un rango distinto de pesos moleculares que puede fraccionar. Las
moléculas con pesos moleculares mayores a ese rango, denominado “límite de exclusión”, son
totalmente excluidas del gel y eluyen la columna con el volumen muerto (Vo). Las moléculas
más pequeñas que el límite de exclusión mínimo son generalmente eluidas a un volumen
aproximadamente igual al volumen total del lecho (Vt).

Sephade x: tipo grado Rango de Fraccionamiento (PM) Volumen de

Péptidos y Proteínas Dextranos lecho (ml/ g de
Globulares Sephadex seco

G-100 4 000 - 150 000 15-20

 1 000 - 100 000

G-150 5 000 - 300 20-30

1 000 - 150
(Harris,2007)

13. Investigue composición, características generales y función que cumple cada uno de los
siguientes geles empleados en cromatografía en columna: superdex 200, sephacryl 100,
CM celulosa, DEAE celulosa, ConA sepharose 4B.
Superdex 200: permiten el uso de altas velocidades de flujo como con las perlas de agarosa
reticuladas. Consisten en perlas de agarosa reticuladas modificadas con dextrano para obtener
la selectividad deseada. El tamaño medio de partícula es ca. 33 μm (30–36 μm) y una altura de
placa reducida de ca.2.0. Los medios son químicamente estables a un pH de 3 a 14 y se pueden
utilizar con una amplia variedad de eluyentes (Kågedal et.al, 1991)

Sephacryl 100: Matriz hidrofílica de diextrán/bisacrilamida de alilo rígido para la purificación

rápida y reproducible de proteínas, polisacáridos y otras macromoléculas. Estabilidad del pH
De 3 a 11 (a largo plazo y en funcionamiento), De 2 hasta 13 (corto plazo). Permiten la
purificación rápida y reproducible de péptidos y proteínas pequeñas por filtración en gel a
escala industrial y de laboratorio (Kågedal et.al, 1991).

CM celulosa: La carboximetilcelulosa o CM-celulosa es un intercambiador de cationes que

tiene los grupos -CH2OH de la celulosa modificados como -CH2OCH2COOH. La CM-
celulosa es, debido a la presencia de restos carboxilo ionizados a pH neutro y básico, una resina
intercambiadora de cationes. A pH 10, la lisozima es prácticamente la única proteína que puede
unirse a la CM-celulosa (Universidad del país vasco, 2017).

DEAE celulosa: es un adsorbente de intercambio iónico de celulosa que se utiliza en la

cromatografía de intercambio iónico y para separar los lípidos que se encuentran en los sitios
de microdominios de la membrana plasmática (Universidad del país vasco, 2017).

Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

14. Explique el principio de separación de proteínas por electroforesis SDS-PAGE.

La base de la técnica SDS-PAGE es hacer que el movimiento de la proteína en el soporte sólido
(gel) por acción del campo eléctrico sea exclusivamente proporcional a su peso molecular.
Separa a las macromoléculas en el orden de sus masas moleculares por los efectos de filtración
por geles, donde los geles se forman por polimerización de la acrilamida y la N,N’-metilen
bisacrilamida inducida por radicales libres en un buffer (Alberts, et al.,2006, p.163).

15. Describa las características químicas de la poliacrilamida.

Poliacrilamida son geles neutros en el sentido de que no existen grupos cargados en las fibras
de polímero si la disolución de acrilamida ha sido preparada recientemente. Los geles de
poliacrilamida son estables excepto a valores de pH extremos; a pH muy básico aumentan de
volumen y terminan descomponiéndose. El grado de hidratación del gel depende en parte del
pH y de la fuerza iónica del medio (Pérez, et al., 2015).

16. Investigue la toxicidad de la poliacrilamida e indique las condiciones de bioseguridad

relacionadas con su uso.

Identificación de riesgos o efectos a la salud

- Ingestión accidental: Puede causar ligera irritación.
- Inhalación: Ninguno.
 - Piel (contacto y absorción): Ninguno.
- Ojos: Puede causar ligera irritación.

Emergencia y primeros auxilios

- Contacto con los ojos: Enjuague inmediatamente con abundante agua por lo menos durante 15
minutos.
- Contacto con la piel: Lave inmediatamente con suficiente agua y jabón.
- Ingestión: No se anticipa que el material se nocivo por ingestión. No son necesariaS medidas
especiales de primeros auxilios
- Inhalación: No se anticipa que el material sea lesivo por inhalación. Retirar a la víctima al aire
libre.

Controles de exposición
- Ojos: Usar protección ocular/ facial.
- Piel y cuerpo: Evitar contacto con la piel
- Manos: Usar guantes impermeables
- Respiratoria: No se recomienda ninguno
(Kemira, 2002).

17. ¿Qué función cumple el SDS en la electroforesis? Explique.

La electroforesis en gel de poliacrilamida con desnaturalización, empleando dodecilsulfato de
sodio (SDS-PAGE), es la técnica electroforética más empleada para la evaluación de la calidad
deproductos proteicos.De modo general, laelectroforesis analítica de proteínas se realiza en
geles de poliacrilamida en condiciones en las que se asegure la disociación de las proteínas en
sus subunidades polipeptídicas individuales,limitándose los procesos de agregación. Se emplea
frecuentemente para disociar las proteínas antes dela aplicación en el gel, el dodecilsulfato de
sodio(SDS), un detergente aniónico fuerte, en combinación con calor.Los polipéptidos
desnaturalizados se unen al SDS, adquieren carga negativa y presentan una relación carga/masa
constante, independientemente del tipo de proteína considerada. La cantidad de SDS es casi
siempre proporcional al peso molecular del polipéptido y es independiente de su secuencia ya
que los complejos SDS-polipéptido migran a través de los geles de poliacrilamida con
movilidades que dependen del tamaño del polipéptido (Voet y Voet, 2004).

18. En algunos protocolos empleados en SDS-PAGE, se utilizan agentes reductores (β

mercaptoetanol, por ejemplo), mezclados con la muestra y el colorante (buffer de carga).
¿Qué función cumple el agente reductor en el proceso de separación de proteínas?
Cumple la función de desnaturalizar las proteínas reduciendo los enlaces disulfuro, desplegando
así algunas formas de plegamiento terciario y rompiendo la estructura cuaternaria (subunidades
oligoméricas), esto es lo que se conoce como SDS-PAGE reductora (Voet y Voet, 2004).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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