ELECTROFORESIS

La mayoría de los polímeros biológicos poseen carga eléctrica, por lo tanto, son capaces de migrar bajo la influencia
de un campo eléctrico. El transporte de partículas a través de un disolvente mediante un campo eléctrico recibe el
nombre de electroforesis. Cuando se hace pasar corriente por la celda, los distintos componentes de la mezcla se
mueven con velocidades que dependen de los siguientes factores:

 La estructura de las partículas (cargas eléctricas, tamaños, distintas formas).

 El campo eléctrico aplicado.
 Medio en el que se produce la migración.
 Al avanzar la electroforesis, los componentes con carga negativa migran hacia el ANODO y los que tienen carga
positiva migran hacia el CATODO. El resultado, es una serie de bandas o líneas separadas que corresponden a los
componentes de la muestra.

Al aplicar un campo eléctrico, aparece sobre las partículas una fuerza eléctrica, que responde a
la ecuación:

En donde la fuerza es igual a la carga de la partícula por el campo eléctrico aplicado.

Las moléculas del disolvente, que pueden estar polarizadas o ionizadas, apantallan parte de la carga de las partículas,
esto se denomina atmosfera iónica. Lo que genera, una carga aparente o prima. Este efecto se describe en la
ecuación:

Donde q’ = es la carga real de la partícula que depende de su estructura y el pH del

medio.

El denominador de la ecuación está compuesto por una constante que depende de la

temperatura, el radio efectivo de la partícula y la fuerza iónica del medio.

De la ecuación dos podemos deducir que la carga aparente es menor que la real, por lo tanto, si reemplazamos en la
ecuación uno la carga real por la aparente obtenemos:

De la cual se desprende que la fuerza eléctrica efectiva es algo menor a la teórica. Además de la
fuerza eléctrica aparece una fuerza de fricción que se opone al movimiento y hace que se alcance
una velocidad de migración como se describe en la ecuación:

Como se observa en la figura, existen tres fuerzas que contribuyen al movimiento de la partícula en un campo
eléctrico:

 La fuerza de atracción electrostática con dirección al polo con carga opuesta.

 La fuerza de fricción provocada por el medio oponiéndose a la fuerza de atracción.
 La fuerza de difusión que es un movimiento aleatorio hacia todas direcciones.

Coeficiente de fricción molecular

Podemos observar que el coeficiente de fricción molecular está determinado por la forma de la
partícula, asumiendo que es esférica. El radio efectivo de la partícula R’ y la viscosidad del medio
N.

La capacidad de la partícula para moverse se representa por la movilidad electroforética (mu) según la ecuación:

La movilidad electroforética se define como la velocidad que toma la partícula por unidad de
intensidad de campo.

Entonces, reemplazando en la ecuación 6 de la velocidad, según la ecuación 4, nos queda que mu

es igual a la carga aparente de la partícula dividida el coeficiente de fricción molecular.
Si reemplazamos en la ecuación 6 el coeficiente de fricción por la ecuación 5, obtenemos la ecuación 7 de la cual
podemos concluir que mu es directamente proporcional a la carga de la partícula e inversamente proporcional a su
forma, tamaño y viscosidad del medio.

Por lo tanto, la electroforesis es una técnica que permite separar moléculas con diferencias en estas características
como, por ejemplo: proteínas, ácidos nucleicos, péptidos, aminoácidos, nucleótidos. Etc.

Tipos de electroforesis
La electroforesis libre fue la primera en desarrollarse, pero actualmente está en desuso por su escasa resolución. Esto
es consecuencia de la mezcla de los analitos por su alta difusión y convección que se produce en un medio líquido.

El primer tipo de electroforesis en zona uso como un soporte al papel (electroforesis en papel). Este tipo de
electroforesis también tuvo una resolución baja, aunque mucho mejor que la anterior. Esta técnica tiene como
desventaja una adsorción elevada debido a los grupos OH de la celulosa que genera elevada tinción de fondo. La
estructura fibrosa del papel, además, provoca una difusión importante y las corridas demandan largos tiempos.

Una mejora en el soporte se obtuvo utilizando electroforesis en acetato de celulosa, que disminuyo la absorción
debido a que los grupos OH se esterificaron con grupos acetatos, que disminuyo la tinción de fondo y aumento la
resolución y las corridas fueron más cortas.

Una mejora sensible se obtuvo al utilizar como soporte a los geles. Estos geles se pueden obtener de distinto tamaño
de poro, haciéndolos apropiados para ácidos nucleicos, proteínas, complejos macromoleculares, virus, etc. Combinan
la migración por la carga y el efecto tamiz. Tienen mayor resolución debido a que la absorción es despreciable y la
difusión es reducida.

 Los geles de agarosa tienen poros de tamaño variable según su concentración. Estos son de gran tamaño y no
homogéneos. El rango de aplicación de estos genes incluye grandes moléculas y complejos supramoleculares
como, por ejemplo, lipoproteínas, complejos enzimáticos, ácidos nucleicos y algunos virus, que exceden por su
tamaño, en general mayor a 200 kDa, el límite del tamaño de los poros de los geles de poliacrilamida. La
poliacrilamida es el medio más efectivo para la electroforesis de proteínas y pequeñas moléculas de ARN. En
cambio, para ácidos nucleicos de mayor tamaño, es más conveniente usar geles de agarosa.
 Los geles de poliacrilamida pueden tener poros de diferentes tamaños de acuerdo a las condiciones de
polimerización. Los poros son de menor tamaño que los de agarosa y son similares al diámetro de las moléculas, y
esto provoca el efecto tamiz.

Los geles también se pueden clasificar en:

 No restrictivos: cuando el tamaño del poro es mayor al tamaño de las moléculas que migran, en este caso no se
produce el efecto tamiz.
 Restrictivos: cuando el tamaño del poro es semejante al tamaño de las moléculas que migran, en este caso si se
produce el efecto tamiz.

Por ejemplo, los geles de agarosa son no restrictivos para las moléculas pequeñas, pero pueden ser restrictivos para
las macromoléculas como, por ejemplo, los ácidos nucleicos. Tanto los geles de agarosa como los de poliacrilamida
pueden ser no restrictivos si disminuimos su concentración.

Geles de poliacrilamida
Los geles se preparan mediante la polimerización de los compuestos, la acrilamida y la bisacrilamida. Este último
compuesto es el responsable del entrecruzamiento.

La polimerización comienza con el agregado de un agente iniciador, como, por ejemplo, persulfato de amonio o
peróxido de hidrogeno. Además, se agrega un compuesto que cumple la función de estabilizador y propagador, como
el TEMED, la riboflavina, etc. Algunas de las características más importantes de estos tipos de geles son:

 Su estabilidad en un rango amplio de pH y temperatura y de fuerza iónica.

 Son mecánicamente estables y resisten la deshidratación.
  Son transparentes que permite la cuantificación por densitometría.
 No presentan efecto electroendosmótico.
 Son resistentes a agentes desnaturalizantes como urea, detergentes, etc.
 Son inertes frente a biomoléculas.
 Tamaño de poro

Tamaño del poro

Los genes de poliacrilamida se caracterizan mediante el tamaño de poro, esto es mediante los parámetros C% t T%.

Ambos controlan el tamaño del poro.

Utilizando la fórmula 1 podemos calcular el valor de T% que representa a la concentración total de monómeros
(acril+bisacrilamida). El cálculo se realiza
sumando la masa de acrilamida A y la masa de
bisacrilamida B, multiplicada por 100 y dividida
por el volumen de la solución V

Con la fórmula 2 podemos calcular el valor de C% que representa la relación de la cantidad de bisacrilamida con
respecto al total de los monómeros. Se realiza calculando la masa de bisacrilamida B x 100 dividido la masa de
acrilamida y bisacrilamida.

En el grafico se observa el efecto del tamaño del poro

caracterizado por T% en distintos geles con respecto
a la migración y resolución de las bandas. Este efecto
está íntimamente relacionado con el tamaño de las
proteínas de la muestra.

Consecuencias del proceso de

electroforesis
Como consecuencia del proceso de electroforesis la potencia generada por el campo eléctrico, en gran parte se disipa
como calor. El calentamiento del gel puede traer como consecuencia efectos indeseables, como, por ejemplo:

 Mayor difusión que provoca mayor ensanchamiento de banda y consecuente de formación.

 Se generan corrientes de convección y esto provoca el mezclado hidrodinámico de los componentes.
 Puede provocar descomposición de la muestra hasta desnaturalización.
 Disminuye la viscosidad del tampón.

Para evitar todos estos problemas, los equipos de electroforesis están provistos por distintos sistemas de
enfriamiento muy eficientes.

Efecto del aumento de la temperatura

El aumento de la temperatura genera una deformación en las bandas que se denomina efecto sonrisa.
Preparación de los geles
Esquema de los pasos a seguir para armar un gel de
electroforesis.

1) Inicialmente se colocan los espaciadores entre dos

placas de vidrio, se posicionan y ajustan las grampas
denominadas Clamp como se observan en la figura.
Estos espaciadores son los que le van a dar el espesor al
gel.
2) Una vez armado, se colocan las placas en forma vertical
sobre una base que esta provista de una bomba, de
manera que el extremo inferior quede totalmente
sellado para evitar fugas de la solución del gel.
3) Una vez montadas las placas, se termina de preparar la
solución del gel agregando el compuesto iniciador de la polimerización. Se agita y en este momento comienza el
proceso de gelificación.
4) Rápidamente se rellena con esta solución el espacio formado por las dos placas de vidrio, evitando que se formen
burbujas.
5) Inmediatamente, se coloca el peine en la parte superior antes que se produzca la polimerización del gel.
6) Una vez polimerizado el gel, el peine se remueve cuidadosamente para evitar la rotura de los pocillos. Antes de
sembrar la muestra, estos huecos se deben lavar con buffer para eliminar los componentes exudados en la
polimerización.
7) La aplicación de la muestra debe ser rápida y se debe evitar que difunda en el buffer que rellena los pocillos.

En el esquema siguiente se muestra el equipamiento básico para realizar una electroforesis en gel:

a- Se distingue una cuba horizontal

electroforética.
b- Una fuente de poder.
c- Dos reservorios para el buffer.
d- Sistema refrigerante.
e- Soporte.

Distintos tipos de electroforesis

Se pueden clasificar en:

 Sistemas continuos: cuya característica principal es que la concentración del gel es constante en toda su
extensión y el pH del buffer de los reservorios y los constituyentes del gel, también se mantienen constantes.

 Sistemas discontinuos: en este caso los geles están divididos en dos áreas, la superior de apilamiento y otra de
separación. El gel de apilamiento tiene mayor tamaño de poro que el gel de separación, y ambas tienen distinto
pH. El gel de apilamiento le da mejor resolución al sistema.

 Electroforesis en gradiente: el tamaño del poro varia a lo largo del gel, esto permite separar tanto las proteínas
pequeñas como las grandes entre sí en una misma muestra.

 Electroforesis nativa y desnaturalizante (conservan la muestra con la estructura original y la última no (SDS-
PAGE)).

 Isoelectroenfoque.
 Electroforesis bidimensional.

 Inmunoelectroforesis.

SDS-PAGE
Es ampliamente utilizada para separar proteínas según su PM, y, en consecuencia, podemos determinar los pesos
moleculares de la mayoría de las proteínas comparando su movilidad electroforética con estándares de peso
molecular conocido, construyendo una curva de calibrado en las mismas condiciones que muestras incógnitas.

Los geles de poliacrilamida se preparan con el agregado de un detergente aniónico llamado SDS y un agente
desnaturalizante como 2-mercaptoetanol. Los puentes disulfuro se disocian por el 2-mercaptoetanol por lo que
pierden su estructura cuaternaria, terciaria y secundaria y las proteínas multicatenarias se disocian.

Los monómeros formados se unen al SDS en una relación constante por

unidad de peso, esto proporciona las proteínas una carga negativa
proporcional a su peso molecular, dando como resultado que la movilidad
electroforética este únicamente relacionada al PM.

Como estudiamos inicialmente, la movilidad electroforética de una partícula

está relacionada a su carga, forma y tamaño. Sin embargo, en este tipo de
electroforesis la carga intrínseca de la proteína es despreciable frente a la gran
densidad de carga negativa proporcionada por el SDS. Y la forma no influye
dado que todas las proteínas pierden su estructura espacial original para
transformarse en monómeros linealizados. Por lo tanto, el único parámetro
diferencial de migración es el PM.

Isoelectroenfoque
Es una técnica altamente resolutiva donde las moléculas se separan según sus puntos isoeléctricos en un gradiente de
pH continuo. El punto isoeléctrico es igual al pH al cual la carga neta de la molécula es nula.

Se utiliza para compuestos anfotéricos, esencialmente se aplica al análisis de proteínas. Por lo tanto, la carga de la
proteína depende del pH del medio, es decir:

 Presentan carga neta + a valores de pH inferiores a su punto isoeléctrico.

 Presentan carga neta – a valores de pH superiores a su punto isoeléctrico.

En su punto isoeléctrico, la proteína no se moverá si es que se la somete a un campo eléctrico.

Curva de titulación

Una aplicación de esta técnica es la curva de titulación de proteínas, que es de mucha utilidad para la selección de la
carga del intercambiador en intercambio iónico y para establecer el pH más adecuado para la siembra y cuál va a ser
la estrategia de elución. Si se coloca una mezcla de proteínas en un gradiente de pH, las moléculas se situarán en
aquel punto donde el pH sea igual a su punto isoeléctrico.
Una vez concluido el Isoelectroenfoque se hace una electroforesis en un gel nativo, en sentido perpendicular al
Isoelectroenfoque. Las proteínas a lo largo del gradiente de pH, tendrán una carga que les permitirá migrar a mayor
distancia cuanto mayor sea su intensidad.

Una vez concluida la segunda dimensión, las proteínas se pondrán en evidencia

mediante una tinción y de esta forma se visualizarán las curvas
correspondientes a cada proteína.

El Isoelectroenfoque es una técnica muy poderosa:

 Capaz de separar proteínas que difieran en 0,001 unidades de pH en su

punto isoeléctrico.
 El fenómeno de difusión es mínimo porque se ejerce un efecto
focalizante.
 La resolución aumenta al reducir el intervalo de pH.

Gradiente de pH

El gradiente de pH puede generarse por una mezcla de polianfolitos, que cuando se someten a un campo eléctrico,
comienzan a migrar hasta alcanzar el pH de su punto isoeléctrico y de esta manera se genera un gradiente de pH
estable. Estos polianfolitos son compuestos anfotéricos, son poliaminas de ácidos policarboxílicos con una gran
cantidad de grupos ácidos y básicos.

 El rango de pH que se puede generar abarca un rango que se extiende entre 2,5 y 11 unidades.
 Los polianfolitos acídicos migran hacia el ánodo y los básicos hacia el cátodo.
 Tienen una gran capacidad tampón aun en su punto isoeléctrico.
 Son de baja masa molecular, menor a 700 Da, muy inferior a las proteínas.
 Ejercen una mínima interacción con las proteínas.
 Lamentablemente, el gradiente del pH se desestabiliza con el tiempo y provoca un desplazamiento de las
proteínas.

Una mejora a estos gradientes son los gradientes inmovilizados, que son generados mediante las denominadas
inmovilinas, que son compuestos químicos que polimerizan con la acrilamida. La preparación del gel se realiza igual
que para los geles en gradiente, mediante vasos comunicantes. Se utilizan dos soluciones con distinta densidad y
características acido-base.

 Estos gradientes de pH son muy estables y no tienen deriva como en el caso de los anteriores.
 Utilizan voltajes mucho más altos.
 Pueden alcanzar una mayor resolución (diferencias de puntos isoeléctricos de 0,001 unidades).
 Tienen mayor reproducibilidad.
 Se pueden obtener comercialmente geles deshidratados
con gradientes inmovilizados preformados.

En la figura se observa la comparación de geles de

Isoelectroenfoque usando como generadores de gradiente a
los anfolitos portadores y a las inmovilinas. Se aprecia
claramente la mejor resolución y menor difusión cuando se
utilizan inmovilinas.

 El uso de Isoelectroenfoque se puede realizar en cubas

horizontales, verticales o en tubo.
 Los geles son no restrictivos, los más utilizados son los de poliacrilamida de baja concentración y para moléculas
muy grandes de agarosa.
 Se pueden utilizar en condiciones desnaturalizantes, pero con detergentes no iónicos, o en general, en
condiciones no desnaturalizantes.
 La muestra debe estar completamente solubilizada.
 El instrumental básico consta de una fuente de poder con capacidad de generar altos voltajes, una cuba
electroforética y un baño termostático.

Inmunoelectroforesis
Como dijimos anteriormente, otra variante de la electroforesis es la Inmunoelectroforesis. En esta técnica los
antígenos primero son separados por electroforesis en un gel de agarosa, libre de anticuerpos como se representa en
la figura A.

Luego el gel se corta en tiras y cada tira es combinada con otro gel que contiene anticuerpos contra todos los
antígenos de la muestra, por medio de la electroforesis, los antígenos migran hacia el gel que contiene los anticuerpos
como se observa en la figura B.

Cuando un antígeno y su anticuerpo especifico se encuentran en concentraciones equivalentes, se forma un

precipitado en forma de pico como se muestra en la figura C. El área del pico es proporcional a la concentración del
antígeno presente, y la posición identifica al antígeno.

Transferencia (Blotting)
La electroforesis no comprende solo una técnica de separación muy poderosa y de alta resolución, sino que también
cuenta con un amplio rango de métodos de detección general y específicos, basados en tinciones, reacciones
enzimáticas e inmunológicas, arcadores y sondas fluorescentes.

Solo un número limitado de procedimientos pueden ser llevados a cabo directamente sobre el gel, debido a que las
moléculas quedan atrapadas en la matriz del gel luego de la reaccion electroforética.

Para que las proteínas y los ácidos nucleicos estén disponibles para su visualización, es necesario la transferencia de
estas moléculas a membranas inmovilizadas especiales. Las distintas bandas de los geles, ya sean proteínas o ácidos
nucleicos, se pueden detectar in situ mediante el empleo de colorantes específicos como por ejemplo acid-blue,
amino black, bromuro de etidio con posterior exposición a luz UV, etc.

Otro método de detección altamente sensible utiliza material radiactivo como parte de las moléculas a separar, ya
sean proteínas o ácidos nucleicos. Este método implica una posterior autoradiografía del gel. En el caso de los ácidos
nucleicos también se pueden usar sondas complementarias radiactivas, esta técnica necesita de un paso intermedio
de la transferencia de banda a un papel de nitrocelulosa.

Los anticuerpos pueden ser utilizados como herramientas altamente específicas para la detección de las bandas
correspondientes a determinadas proteínas, esta técnica también necesita de un paso previo de transferencia a papel.
Los anticuerpos pueden estar marcados radiactivamente con moléculas fluorescentes o enzimas, que catalicen alguna
reaccion de color.

Tradicionalmente, los ácidos nucleicos han sido transferidos desde los geles de agarosa a las membranas por
transferencia capilar. Este método tiene la ventaja de ser simple y nada costoso, pero tiene como desventaja el largo
tiempo que demanda su concreción. Esto último puede producir resultados de calidad variable.
Actualmente, se utiliza una técnica de transferencia activa denominada transferencia electroforética. Esta técnica
tiene la ventaja de ser rápida, eficiente, sensible y versátil. En la transferencia electroforética el gel que contiene a la
muestra se coloca sobre una membrana inmovilizada y se hace un sándwich con hojas de papel de filtro. Al aplicar un
campo eléctrico al sándwich las bandas son transferidas desde el gel a la membrana donde quedan permanentemente
unidas y de fácil acceso para análisis posteriores. Esta técnica se aplica tanto a proteínas como a ácidos nucleicos.

Electroforesis bidimensional
La electroforesis bidimensional comprende la sucesión de dos electroforesis distintas o en distintas condiciones, sobre
una misma muestra, lo que le da una mayor resolución como a todos los métodos bidimensionales.

 La primera dimensión consiste en la separación de los componentes según un criterio basado en las propiedades
fisicoquímicas diferenciales (carga, forma, tamaño o punto isoeléctrico).
 La segunda dimensión consiste en la separación de los componentes según un parámetro distinto al primero.

Esta combinación de modos de separación electroforéticos en bases a distintas propiedades de la muestra, resulta en
una máxima resolución.

Algunos ejemplos de estas combinaciones son:

 Primera dimensión condiciones no desnaturalizantes y segunda dimensión con condiciones desnaturalizantes.

 Primera dimensión con gel discontinuo y segunda dimensión con gel continuo (proteínas ribosomales).
 Primera dimensión con gel con urea y segunda dimensión con gel con tritón/ acido o urea (histonas).
 Primera dimensión utilizando Isoelectroenfoque y segunda dimensión con SDS-PAGE. Esta opción es la más
ampliamente utilizada.

Existen algunos procedimientos de identificación específica, pero para esto se necesita la transferencia de las bandas
a un papel de nitrocelulosa denominada Blotting. Una vez transferidas las bandas, la detección se realiza con
anticuerpos específicos marcados.

Otra estrategia que se puede utilizar es la extracción y digestión a partir de los geles. Luego se realiza la secuenciación
o el análisis por espectroscopia de masas.

Aplicaciones

Las aplicaciones de la electroforesis bidimensional son:

 Separación de mezclas proteínas muy complejas.

 Determinación de la composición proteica de una organela. Tipo celular, tejido, etc. (proteomica).
 Comparación de la composición proteína de distintas situaciones experimentales:
a- Tejidos sanos y enfermos
b- Distintas condiciones de cultivo.
c- Líneas celulares normales y tumorales.
d- Tratamientos con fármacos o tóxicos.
e- Estudio de las modificaciones postraduccionales.

En la figura se observa los distintos pasos para

llevar a cabo la composición proteica
de distintas situaciones experimentales
mediante la electroforesis
bidimensional.
Electroforesis capilar
Puede tener diferentes denominaciones HPCE, CZE, FSCE. Los compuestos que puede separar esta metodología son:
aminoácidos, péptidos, proteínas, oligonucleótidos, iones, moléculas orgánicas. Básicamente los mismos compuestos
que se pueden separar por HPLC.

El aparato básico de electroforesis capilar consta de un capilar conectado a dos reservorios de buffer, uno que
constituye el ánodo y el otro el cátodo. El equipo de detección está acoplado al capilar y a un sistema de adquisición
de datos. El capilar es de sílica fundida y tiene dimensiones típicas que varían entre 25 y 100 micras. La constitución es
semejante a las columnas capilares de CG. El uso de estos capilares evita los problemas de calentamiento.

Es una técnica en solución libre, la muestra se siembra en un extremo del capilar y migra hacia el otro extremo. Los
resultados se denominan electroferogramas y tienen un aspecto similar a un cromatograma. Estos aportan
información cuali y cuantitativa.

Ventajas sobre la electroforesis convencional

 En la electroforesis capilar debido a los diseños de los capilares se disipa mejor el calor. Esto transmite aplicar
mayores voltajes sin que se deteriore la eficiencia del método.
 Los tiempos de análisis en electroforesis capilar son mucho más cortos.
 La detección online evita ensanchamiento de los picos.
 Debido a que la electroforesis capilar está totalmente automatizada le da exactitud y reproducibilidad al método.

Características principales de la técnica

 Rapidez
 Alta eficiencia.
 Uso de volúmenes pequeños de muestras (nanolitros).
 Amplio rango de aplicaciones.
 Detección on column, a través de una ventana que se genera en el capilar.
 Automatización.

Mecanismos de separación
Existen dos fenómenos electrocinéticos que gobiernan los mecanismos de separación: la electromigración (depende
de la carga del analito) y la electroósmosis. La movilidad electroforética es específica para cada analito y depende de
la relación carga-masa.

 Los cationes migran hacia el cátodo.

 Los aniones migran hacia el ánodo.
 Los compuestos neutros no se ven afectados por el campo eléctrico.

En cuanto al flujo electroendosmótico vemos que es el movimiento generalizado de todo lo que llena el interior del
capilar, esto es como consecuencia de la aplicación de un campo eléctrico. En condiciones normales este flujo va en
dirección hacia el cátodo, su componente de movilidad es mayor que los componentes de movilidad electroforéticas
de cualquiera de los analitos. Por lo tanto, todos los analitos sin importar la carga, migraran hacia el cátodo.

Como podemos deducir, el flujo electroendosmótico es un componente muy importante de la migración de los
analitos y tiene lugar debido a los grupos silanoles libres de la pared del capilar que están cargados negativamente a
valores de pH superiores a 3. Estos grupos ionizados crean una doble capa eléctrica formada por los iones positivos
del buffer, una interna fija asociada a la pared del capilar y una segunda capa móvil. Cuando se aplica un voltaje, los
cationes de la segunda capa migran hacia el cátodo arrastrando consigo la solución del electrolito. Este fenómeno
genera un flujo neto hacia el cátodo denominado flujo electroendosmótico que es muy fuerte y arrastra moléculas a
una velocidad mayor que la electroforética. Por lo tanto, todas las moléculas independientemente de su carga serán
transportadas hacia el cátodo.

 Las moléculas positivamente cargadas alcanzan el cátodo primero por combinación de la migración
electroforética y del efecto electroendosmótico.
 Las moléculas cargadas negativamente llegan más retardadas porque la migración electroforética se le opone
al efecto electroendosmótico.
 Las moléculas neutras migran entre ambas, por tener solamente la componente del efecto
electroendosmótico.

A medida que las moléculas son separadas, y en su camino al cátodo, pasan por una ventana donde son detectadas
por un detector que transmite la señal a una computadora. Las corridas tipo duran unos pocos minutos.

En algunos casos, el efecto electroendosmótico no es deseable en las corridas, por lo tanto, se debe eliminar. Existen
estrategias para lograrlo como, por ejemplo:

 Uso de capilares recubiertos.

 Adición de polímeros neutros hidrofílicos en el buffer.
 Adición de pequeñas cantidades de detergentes cationes (surfactantes).
 Trabajar en medios ácidos debajo de 3 para evitar ionización de los grupos silanoles.

Otra estrategia es invertir la dirección del efecto electroendosmótico, que se logra a través de capilares modificados
químicamente o adicionando detergentes catiónicos (surfactantes) en elevadas concentraciones.

Se observa esquematizado el efecto del agregado de pequeñas

cantidades de detergente en la figura del medio. Podemos ver como
el detergente se asocia a las paredes del capilar a través de sus
cabezas polares positivas y expone hacia el interior del capilar las
colas apolares, de esta manera se eliminan las cargas negativas de
los grupos silanoles.

En la figura inferior se observa la estrategia para invertir el flujo

electroendosmótico. Se agrega una alta concentración de detergente
catiónico y las cadenas asociadas en el caso anterior se asocian a
nuevas cadenas, pero interaccionando con las colas apolares entre sí,
y exponiendo hacia el interior del capilar las cabezas polares cargadas positivamente. De esta manera, se reemplazan
las cargas negativas de los grupos OH por las cargas positivas del detergente.

En esta técnica también podemos calcular la eficiencia calculando los platos teóricos N alcanzados por el capilar.

Las dos primeras ecuaciones son las utilizadas en cromatografía, y la

última es la que se utiliza para calcular la eficiencia en la electroforesis
capilar.

De esta última ecuación podemos concluir que el uso de altos voltajes

proporciona un mayor número de platos teóricos

Un analito con una gran movilidad produce un número elevado de platos

teórico. Esto se debe a que elevadas velocidades de migración minimizan
el tiempo de difusión.

Analitos con bajo coeficiente de difusión también dan altos N, dado a que minimizan el solapamiento debido a la
difusión longitudinal.
Podemos observar que la longitud del capilar no influye en la eficiencia, pero si determina los tiempos de corrida.

Factores que afectan la separación

 Dispersión de los analitos (a menor dispersión mayor resolución).
 Adsorción de los analitos a las paredes del capilar (puede ser importante cuando los analitos de la muestra
son proteínas con carga positiva al pH de corrida).
 Efecto térmico o efecto Joule (a mayor temperatura mayor difusión del analito y menor resolución).

Instrumentación
Consta de:

 Capilar (donde se lleva a cabo la separación).

 Sistema de introducción de la muestra.
 Detector.
 Fuente de voltaje.
 Sistema de refrigeración.

Características más importantes de los capilares

 Si bien el capilar tiene la misma estructura que una columna capilar en CG debemos aclarar que no contiene una
FE.
 El diámetro interno es menor: entre 2 y 100 micras.
 La longitud es menor: 100 cm.
 Al igual que las columnas de CG están cubiertas por una poliimida que les da resistencia y flexibilidad a las paredes
de sílica.
 Para la detección online se hace una ventana en un extremo eliminando la cubierta de poliimida, para que el
detector pueda incidir sobre el analito.
 Requieren acondicionamiento previo.
 Deben ser permeables a la luz UV y visible.
 La separación de los analitos se produce en disolución, no interacciona con el capilar.
 Pero el capilar no es un tubo inerte, sino que es el componente crítico de la separación debido a que el efecto
electroendosmótico se produce por las cargas de la pared del capilar.

Efecto de la temperatura
Uno de los problemas que más afecta la eficiencia es la temperatura. Los objetivos del enfriamiento de los capilares
son:

 El pequeño diámetro de los capilares y los sistemas de refrigeración eficientes eliminan la temperatura
generada por el proceso electroforético (disipan el calor generado).
 Además, la disminución de la temperatura puede evitar la descomposición de la muestra.
 También permite aplicar voltajes más altos que mejoran la eficiencia del capilar.
 Mejora la reproducibilidad de los análisis.

Si disminuye la temperatura, aumenta el voltaje y se generan separaciones mas rápidas y eficaces.

Sistema de introducción de la muestra

La cantidad de muestra inyectada es solo de unos cuantos nanolitros y se puede introducir en el capilar por inyección
hidrodinámica ya sea por gravedad, presión o vacío; o por electromigración.
En la introducción por gravedad el extremo del capilar donde ingresa la muestra se sumerge en ella, y se eleva
durante un tiempo muy corto predeterminado para permitir que la muestra entre al capilar. Otra forma es insertar el
capilar en un frasco a presión para forzar la entrada de la muestra al capilar.

También puede solucionarse desde el otro extremo. Después de la inyección el frasco de la muestra se sustituye por
un frasco de buffer, en forma alternativa, el extremo de la muestra se puede sumergir en la solución de la muestra y
se aplica un voltaje. Por lo tanto, los analitos ingresan al capilar en función de su carga. Debemos tener en cuenta que
este método genera discriminación.

Detector

El detector se coloca en el extremo catódico del capilar o cerca de este. El detector que se emplea con mayor
frecuencia es el de absorbancia UV. Se pasa un haz enfocado a través del capilar donde se remueve una porción de la
cubierta protectora que se denomina ventana.

Para los analitos que fluorescen se utiliza la detección de fluorescencia. El uso de fuentes de laser (fluorescencia
inducida por láser) ha llevado los límites de detección a niveles muy bajos.

Entre otros detectores, están los electroquímicos, ya sean conductimétricos o amperométricos.

También la detección por espectrometría de masas se ha difundido bastante, usando una interfase del tipo de electro
spray para introducir la muestra en un espectrómetro de masas cualipolar, parecido al que se usa en HPLC. El intenso
campo eléctrico en el extremo del capilar forma un aerosol de microgotas cargadas, el disolvente se evapora y deja
iones gaseosos que ingresan al detector.

Electroforesis capilar zonal

Es la más simple, en resumen, podemos decir que en este modo un capilar se rellena con una solución buffer y la
muestra se carga por uno de los extremos. Luego se aplica un campo eléctrico y en condiciones normales los analitos
migran hacia el cátodo. El orden de migración es el siguiente:

 Los cationes primero según su relación carga-masa.

 Los compuestos neutros migran juntos.
 Los aniones son los últimos también en función de su carga-masa.

Representación gráfica del orden de migración:

Isoelectroenfoque capilar
Otro modo de separación muy utilizado y que se aplica para compuestos con diferencia en su punto isoeléctrico es el
Isoelectroenfoque capilar (CIEF).

 Su aplicación está restringida a moléculas anfotéricas como las proteínas.

 Los principios de separación son los mismos que los vistos en la técnica de Isoelectroenfoque en gel.
 Los anfolitos carrier se agregan al buffer, se mezclan con la muestra y se distribuyen uniformemente en el capilar.
 El capilar se llena con la muestra-reactivo.
 El pH inicialmente es uniforme y se debe a la combinación de todos los anfolitos presentes.
 Los anfolitos individualmente pueden ser catiónicos o aniónicos.

Al aplicar un campo eléctrico los anfolitos carrier tienden a separarse, pero la separación de anfolitos adyacentes
nunca se alcanza porque ello causaría una discontinuidad en el gradiente de pH. Esto migran generando un gradiente
de pH a lo largo del capilar. Los analitos migran hasta alcanzar el pH igual a su punto isoeléctrico, y se alcanza el
equilibrio caracterizado por un gradiente continuo y lineal de pH a lo largo del capilar.

Electroforesis capilar en gel

Es una variante de la electroforesis en gel, que ha sido un instrumento primario en bioquímica durante 4 décadas.
Este modo se utiliza principalmente para la separación de proteínas, péptidos y ácidos nucleicos.

Los geles son matrices porosas compuestas de materiales poliméricos disueltos en un disolvente, generalmente agua,
que generan el efecto tamiz que permite separar a las partículas por su tamaño, y, además, reduce la dispersión por
convección y difusión. El poro del gel viene determinado por la concentración del material polimérico y la estructura
tridimensional.

Para separar macromoléculas según su tamaño han sido habitualmente usados geles químicos que tienen enlaces
químicos entre las cadenas. Los geles químicos son difíciles de desalojar de los capilares cuando se presenta un
problema a diferencia de los genes físicos que son polímeros lineales simplemente enredados unos con otros y que
son comunes en la actualidad.

Los geles físicos se pueden extraer y volver a cargar para generar un nuevo capilar en cada separación. Las
macromoléculas se separan a través de un gel por clivado, debido a que las moléculas más pequeñas migran más
rápidamente que las moléculas grandes a través de una red de polímeros entrelazados.

 Las partículas lipofilicas coloidales se separan con poliacrilamida.

 Los materiales coloidales (soles) se separan con agarosa.
 Otros compuestos pueden ser separados por metilcelulosa, dextranos (geles físicos).

Electroforesis capilar micela electrocinética (MEKC)

La electroforesis capilar en zona no es capaz de separar analitos neutros, para ello se utiliza la MEKC. Este tipo de
electroforesis se pueden lograr incluyendo un agente surfactante, como el SDS, en el buffer. Por encima de una
determinada concentración, algunos detergentes forman micelas con un interior muy apolar y una cubierta cargada
muy polar que interacciona con el buffer. Estas micelas, por efecto del campo eléctrico aplicado, migran hacia el
cátodo debido a que la componente del flujo electroendosmótico es mayor a su componente electrocinética, aunque
es muy retrasada por su carga negativa.

Los solutos neutros se peticionan y se mueven junto con las micelas. Si el soluto es muy apolar, interactúa
fuertemente con las micelas y se moverá más lentamente
que aquel que se particione en menor grado.

En la imagen se observa un diagrama del orden de migración

de los distintos analitos.

Aplicaciones de la electroforesis capilar

Se cubre un amplio rango de posibilidades gracias a los distintos tipos de electroforesis capilar.

La resolución de las muestras se puede llevar a cabo en base a diferencias en la relación carga-masa, punto
isoeléctrico, tamaño molecular, carácter hidrofóbico y quiralidad.

a) Compuestos cuya relación carga/tamaño sea diferente, separados por CZE.

b) Compuestos neutros con diferente hidrofobicidad separados por MEKC.
c) Compuestos de tamaño diferente con misma relación carga/tamaño, separados por CGE.
d) Biomoléculas de tamaño similar y similar relación carga/tamaño, con diferentes puntos isoeléctricos,
separados por CIEF.

Comparación con otras técnicas de separación

 En relación a la eficiencia, en la electroforesis capilar se logra el mayor número de platos teóricos y en orden
decreciente tenemos: cromatografía gaseosa y luego la HPLC.

 El tipo de muestra al que se puede aplicar se superpone con el ámbito de la aplicación de la HPLC.

 Los volúmenes son de unos pocos nanolitros, contra microlitros de la GC y la liquida.

 Los límites de detección son 100 veces inferiores a los de GC y HPLC.

 Las tres metodologías son altamente automatizadas.

 La electroforesis capilar es la que menor cantidad de reactivos requiere con el consecuente ahorro de tiempo,
dinero y cuidado del medio ambiente.