DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL Y DE CASEÍNA EN LA LECHE I. OBJETIVO: • La cantidad de proteína en la leche puede determinarse mediante distintos métodos.

El más exacto es el método Kjedahl, sin embargo es largo y dificultoso y para realizarlo se necesitan condiciones de laboratorio. En la práctica para evaluar la leche de vacas según su valor proteico es necesario utilizar métodos como: Titulación con formalina, Método refractométrico, Método colorimétrico. II. FUNDAMENTO TEÓRICO: Como otras proteínas de origen animal las proteínas de la leche se caracterizan por un elevado valor biológico, ellas contienen todos los aminoácidos esenciales, necesarios para nuestro organismo. La asimilación de las proteínas de la leche y de los productos lácteos es más elevada en comparación con las proteínas de productos de origen vegetal. Es bueno señalar que con un trabajo adecuada para crear condiciones satisfactorias de alimentación en el ganado vacuno no sólo se aumenta la cantidad de leche en el ordeño, sino que también el contenido de grasa y proteínas de la leche. El contenido de proteínas en la leche es variable y depende de factores genéticos y externos. Elevado contenido en proteínas poseen las razas Holstein, Brown Swiss con 3.9% ; 3,7% ; 3.6% . Otras tan sólo alcanzan a 3.3 y 3.2% . El contenido de proteína en la leche varía según el período de lactancia. En el primer día (calostro) alcanza a 15.5%, hacia el quinto día baja hasta 3.6 % y luego hasta el tercer mes disminuye un poco, pero al final de la lactancia la cantidad de proteína en la leche vuelve a aumentar.

En la leche las proteínas se encuentran en estado coloidal. Sus partículas son 10 veces más pequeñas que los glóbulos de grasa, sólo se pueden observar en un ultramicroscopio. Las proteínas de la leche se forman de los aminoácidos, polipéptidos y proteínas de la sangre de la vaca, para la formación de los cuales se utilizan sustancias nitrogenadas del alimento del ganado. Si esto mejora en ración alimenticia aumentará la proteína en la leche. Las principales proteínas de la leche son: la caseína, la albúmina y la globulina. Estas se diferencian por sus propiedades químicas fisiológicas y por su valor biológico La caseína es el 80% de todas las proteínas, o el 2,7 - 2,8 % de la masa total de la leche. Son conocidas algunas fracciones de la caseína: α, β , γ , que se diferencian por su contenido en nitrógeno, fósforo y azufre. La caseína se utiliza para la elaboración de quesos, requesón y otros. Su principal característica es el de coagularse por acción del cuajo, sin embargo esta varía: así α - caseína se coagula bien, β- caseína en menor grado y γ- caseína no se coagula. Por eso la calidad de la leche para la elaboración de quesos no será igual a pesar de las mismas condiciones externas. Durante el calentamiento de la leche la caseína no se coagula, pero si se agrega ácidos o si se forman durante la conservación de la leche la caseína se coagulará. Esta propiedad de la caseína se utiliza para la elaboración de productos ácido - lácticos. Un esquema simple del complejo calcio - caseína es el sgte. : (COOH)4 NH2 --- R (COO)2 Ca

Los grupos carboxílicos (ácidos) en la caseína son mayores que los grupos aminos, por eso su reacción en sustancias de sales neutras es ácida. Para neutralizar 1 gramo de caseína es necesario 9 ml. de 0,1N de una solución de soda. En esto se basa el método de determinación de caseína en la leche mediante el método de titulación. La albúmina viene a ser el 15% de todas las proteínas o el 0,4% de la masa total de la leche. Se diferencia de la caseína porque no contiene fósforo, pero el azufre en ella es 2,5 veces mayor. Durante el calentamiento de la leche la albúmina se coagula y cae como precipitado. En el proceso de elaboración de quesos la albúmina pasa al suero. En ella existen gran cantidad de aminoácidos esenciales, se utiliza la albúmina para la elaboración consistencia delicada, suave. En menor cantidad en la leche se encuentra la globulina (0,1 % del total de la leche), pero esta proteína tiene gran importancia porque posee sustancias inmunológicas que tienen la propiedad de eliminar y evitar el desarrollo de Mos. Patógenos. Además de estas proteínas, un rol fisiológico importante poseen las proteínas de la envoltura de los glóbulos de grasa. De 100 gr. de grasa se obtiene 0,1 gr. de estas proteínas, de alto valor biológico. Están relacionadas a las lipoproteínas ya que en ellas se encuentra la sustancia lecitina, necesaria para la buena marcha de los procesos fisiológicos en el organismo. En la producción de mantequilla los glóbulos grasos pierden su envoltura lipoproteíca la cual pasa al suero. Por esto el suero de la mantequilla no sólo es nutritivo sino posee propiedades que pueden mejorar la salud. de requesones, pastas, cremas de

El método que se utilizará para determinar la cantidad total de proteína será el de Titulación con formalina, éste método se basa en que, una solución acuosa neutra de aminoácidos en presencia de formalina neutra es capaz de aumentar su acidez con la formación de compuestos, en los cuales ambos átomos de hidrógeno del grupo amino son reemplazados por un grupo metílico. H R – CH – COOH + O – C ------NH2 H NH2 grupo metílico RCHCOOH + H2O

Grupo amino

El grupo libre COOH se titula con solución NaOH. R – CH – COOH + NaOH --------N=CH2 RCHCOONa + H2O N=CH2

El segundo método es refractométrico y se basa en establecer la diferencia de los índices de refracción del rayo de luz que pasa a través de la leche y del suero (después de precipitar la caseína con el cloruro de Calcio). Las caseínas (fosfoproteínas) representan el 80% de las proteínas de la leche de vaca; el resto está constituido por Beta-lactoglobulina (alrededor del 10% de las proteínas totales), Alfa-lactoalbúmina (en torno al 2% de las proteínas totales) y pequeñas cantidades de diversas proteínas (enzimas, inmunoglobulinas, etc.). Cuando se coagulan las caseínas, quedan en solución las otras proteínas; conjuntamente con la lactosa y sales minerales para constituir el llamado lactosuero.

La fracción caseínica Comprende varios tipos de moléculas de las cuales el 50% aproximadamente es de alfa-caseínas, 30% de beta-caseína, 15% de k-caseína y 5% de gama-caseína. separarse por ultracentrifugación, Estos compuestos pueden la fracción caseínica total se

precipita por descenso del pH de la leche hasta 4,7 aproximadamente. A pH 7 y aisladamente, la alfa-caseína está bajo la forma de pequeños polímeros, la beta-caseína al estado de monómero y la k-caseína al estado de polímeros mayores. A pH 7 y 37°C, el agregado de iones Ca ++ no afecta a la k-caseína, en cambio la beta-caseína precipita y la alfa-caseína coagula. Los complejos de alfa y k se asocian con la caseína para formar micelas. Durante el cuajado de la leche, el cuajo ataca a la caseína k, escindiendo el enlace peptídico fenilalanina-metionina. La paracaseína k así formada ya no estabiliza más el complejo con la caseína alfa, y en presencia de calcio, los conjuntos micelares coagulan, formando un gel, la cuajada, que expulsa al líquido llamado lactosuero, por sinéresis. La velocidad de coagulación y sinéresis aumentan cuanto mayor sean los contenidos de caseínas, calcio y acidez de la leche. Beta-lactoglobulina No se encuentra en la leche humana. Es la proteína más abundante en el lactosuero de la leche de vaca. La composición en aminoácidos es bien conocida y se sabe que hay por lo menos 4 variantes genéticas, que se distinguen por la sustitución de ciertos aminoácidos en la cadena proteica. Incide en los tratamientos tecnológicos de la leche, en efecto, su desnaturalización por calentamiento reduce el riesgo de coagulación de la leche durante la esterilización. Alfa-lactoalbúmina Es una de las proteínas del sistema lactosa-sintetasa, presente en las células de las glándulas mamarias.

En conjunto provocan la unión de la glucosa con la galactosa, asegurando la síntesis de la lactosa. Es insoluble a pH entre 4 y 5,5, a un lado y a otro lado de esta zona, la molécula sufre modificaciones de conformación, rápida o lenta, reversibles o no, que conducen a diversas formas polimerizadas. Lactoferrina, la proteína roja de la leche Esta proteína tiene como principal propiedad la de unir fuertemente al hierro, que es el que le da su color rojo. En condiciones fisiológicas tiene muy poco hierro unido, y es capaz de fijar el que se encuentra en el medio, de tal forma, que los microorganismos no disponen de él para su proliferación. También se ha comprobado que puede tener un efecto bactericida al interaccionar con la pared de los microorganismos, desestabilizándola y causando su muerte. A través de estos dos mecanismos, la lactoferrina puede desempeñar un papel esencial en la protección del recién nacido frente a infecciones gastrointestinales. Lactoperoxidasa, la importancia del H2O2 La lactoperoxidasa es una enzima muy abundante en la leche de vaca, pero su presencia es casi indetectable en la leche humana. Forma parte de un sistema defensivo que permite la formación, en la propia leche o en el tuvo digestivo, de sustancias con gran poder antimicrobiano. La lactoperoxidasa cataliza la formación de estas sustancias en presencia de trazas de H2O2. Esta H2O2 es incluso formada por los propios microorganismos, que luego sufrirán los efectos de los productos formados por la lactoperoxidasa. Esta enzima, al igual que la lactoferrina puede ser aislada del lactosuero para su aplicación como conservante natural de algunos productos alimenticios.

La digestibilidad real de las proteínas de la leche es muy alta en adultos (0.97 igual a las del huevo) y algo menor en los niños, según sus edades entre 0.90 y 0.93. Tiene gran riqueza de aminoácidos esenciales, y su NPU (utilización neta proteica) para niños de 3 a 7 años, cuando forma el 3% de la energía total de la dieta, es de 0.81. La leche es el alimento de todos los mamíferos durante las primeras etapas del nacimiento. Su composición resulta muy notable, ya que la mayoría de sus componentes se sintetiza especialmente para formar parte de ella, y no se encuentra en ninguna parte del organismo. Así, la lactosa no se halla en cantidades significativas en ningún otro tejido animal o vegetal. Por lo que respecta a las proteínas, sucede lo mismo; las más abundantes son también exclusivas de la leche. PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS PROTEÍNAS DE LA LECHE: 1. Solubilidad y estabilidad de las soluciones: Todas las proteínas contienen grupos polares que poseen una gran atracción por las moléculas de agua, pero no todas son igualmente solubles en ésta. Aparte de la proporción relativa de los grupos polares y de los grupos no polares, intervienen en la solubilidad de las proteínas la fuerza de los enlaces intramoleculares y las posibilidades de enlace con los cationes y los aniones. La afinidad de las proteínas por el agua depende mucho de las condiciones fisicoquímicas. Sus soluciones no poseen la estabilidad de las soluciones de sustancias de moléculas pequeñas, como la lactosa. El pH tiene una gran influencia; en el punto isoeléctrico cesa la repulsión de las moléculas, con tendencia a agregarse y a flocular. En las condiciones de concentración en que se hallan las proteínas y las sales de la leche, solamente las proteínas que forman la caseína precipitan por un cambio de pH, hacia 4,6. Las sales añadidas a las soluciones de proteínas tienen efectos variables según su naturaleza y concentración. Si la concentración es débil, las sales no desnaturalizantes se disocian

en iones, que se ligan a la molécula proteica, aumentándose así su afinidad por el agua. Por el contrario, una fuerte concentración de sal cuyo anión se encuentra fuertemente cargado (sulfato, cloruro) orienta las moléculas de agua; de ello resulta una competición entre estos iones y los grupos polares de las proteínas, lo que provoca la floculación. La floculación puede lograrse también por la adición de un solvente miscible con el agua (alcohol, acetona) pues disminuye la constante dieléctrica y reduce la atracción de los grupos polares por el agua. Estas propiedades se utilizan para separar y purificar las proteínas de la leche. 2. Densidad : La densidad de las proteínas de la leche es cercana a 1,3. Debido a la carga de las moléculas, hay una contracción de volumen en el curso de la disolución, que varía del 5 al 8%. Para la caseína, el volumen específico pasa de 0,774 a 0,731; lo que corresponde a densidades de 1,292(sólida) y 1,367(solución). Para la beta -lactoglobulina el volumen específico pasa de 0,802 a 0,751 y la densidad de 1,247 a 1,331. El volumen específico de una proteína se encuentra en relación con su composición en aminoácidos. 3. Índice de Refracción: El índice de refracción de una proteína pura se deduce de las determinaciones del índice de sus soluciones; pero se puede calcular también según su composición en aminoácidos, ya que es un valor característico. Las diferentes proteínas de la leche no tienen el mismo índice de refracción( es más elevado cuanto más bajo es el volumen específico). En solución el índice de refracción varía proporcionalmente a la concentración, pero el incremento difiere muy poco de una proteína a otra.

4. Propiedades espectrofotométricas: Las proteínas de la leche no muestran bandas de adsorción en el espectro visible ya que son incoloras, salvo un componente menor, la lactoferrina. Por el contrario, originan bandas características en los espectros ultravioletas e infrarrojo. Una de las más interesantes es aquella cuyo punto máximo se sitúa hacia 280 mu, y se debe a los aminoácidos de la serie aromática, tirosina y triptófano. Esta propiedad permite valorar las proteínas por espectrofotometría en el ultravioleta; pero es preciso anotar que el coeficiente de extinción varía según la composición en aminoácidos. Por la misma razón (presencia de aminoácidos aromáticos) las proteínas de la leche son fluorescentes; con una activación a 280mu. III. MATERIALES Y REACTIVOS: • • • • • • • • • • • • Muestra de leche Bureta de 10 ml Soporte universal Dos matraces erlenmeyer 100 ml. Solución de hidróxido de Na 0,1 N. Fenolftaleína al 1%( solución alcohólica). Formalina neutra. Solución de cloruro de calcio al 4%. Cocinilla eléctrica. Vaso de precipitado. Pipeta. Refractómetro ABBE.

IV. PROCEDIMIENTO Determinación de Proteína total y caseína en la leche mediante el método de Titulación con formalina: - Preparación de formalina neutra: a 5 ml. de formaldehído (C= 35 – 40%) se agrega 0.1ml de fenolftaleína y se titula con NaOH 1N hasta rosado claro bajo (no debe desaparecer). - Usando una pipeta se tomo 10ml leche, más 12 gotas de fenolftaleína y se neutralizó con NaOH 0,1N. - Luego se midió 2ml de la primera titulación que es formalina neutra, y se agregó al segundo titulado. - El color rosado desapareció debido a que el grupo amino reaccionó con la formalina. - Luego se volvió a titular hasta rosado claro tomando nota del gasto de soda utilizado. - Después se determina la cantidad de solución de NaOH 0,1 N que pasó en la segunda titulación después de haber agregado la formalina. - El gasto de NaOH fue de 1,8ml - Este valor se multiplica por el coeficiente 1,92, y se determina el contenido total de proteínas en la leche en %. Y para hallar el % de caseína se multiplica por 1,51. Determinación de proteína en la leche por el método refractométrico: En el refractómetro se miden los sólidos de la leche no grasos. Anotar (S L). Se prepara el suero de la siguiente manera: En un vaso de precipitado grande se vierten 60 ml de leche y se agregan 60 gotas de solución de cloruro de calcio al 4%. Luego se calienta en una cocinilla por 10 minutos. Al calentarse la leche con cloruro de calcio las proteínas precipitan.

Se enfría el recipiente y luego se extraen unas cuantas gotas de suero con ayuda de una pipeta. En el refractómetro se miden los sólidos del suero no grasos. Anotar (S S). Para hallar el % de proteínas, se realiza la siguiente resta: S L - SS . Factores que influyen en la exactitud del análisis: - Limpieza de los prismas. - Precipitación incompleta de la proteína. - Condiciones iguales al medir los sólidos de la leche y del suero. - El tiempo entre las 2 mediciones debe ser lo más corto posible. Determinación aproximada de proteína en la leche por fórmula Se puede utilizar la siguiente fórmula utilizando una relación estable entre la grasa y la proteína en al leche.
Pr oteína % = 1,0 + (0,65 x grasa %)

V. RESULTADOS:

Muestra: leche fresca Gasto: 1.4ml Factor de proteína: 1.92 Factor de caseína: 1.51 %Proteína total = Gasto x Factor %Proteína total = 1.4 x 1.92 %Proteína total = 2,688 % %Caseína = %Proteína total x Factor %Caseína = 2,688x 1.51 %Caseína = 4,059%

VI. CONCLUSIONES: La caseína (y todas las sustancias nitrogenadas) se hallan en la leche en forma de micelas, dispersas en suspensión coloidal. Cuando el grupo amino reaccionó con la formalina el color de la titulación rosada cambió a un color blanco,(esto quiere decir entonces que otra vez se volvió {ácida). El calcio favorece la formación de micelas cuando esta presente en pequeñas proporciones como en la leche. Las propiedades físicoquímicas más importantes de presencia de proteínas. El análisis de determinación de proteínas es fundamental para la elaboración de quesos y otros productos lácteos. Una leche con bajo porcentaje de proteínas indica adulteración. Trabajar con muestras de leche fresca. Verificar el estado de los reactivos que se van a utilizar., al igual que los equipos. VII. BIBLIOGRAFÍA: Charles Alais; Ciencia de la leche, Editorial reverte S.A, México 1988. la leche,

especialmente las relacionadas con su estabilidad, derivan de la

ALAN H. VARMANN, JANE P. SUTHERLAND, Leche y Productos Lácteos Tecnología Química y Microbiológica, Editorial ACRIBIA S.A., España, 1995.

UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE BASADRE GROHMANN”

FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
INFORME DE LABORATORIO

TEMA

:

“DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA CASEÍNA EN LA LECHE”

TOTAL

Y

DE

CURSO

:

TECNOLOGIA DE LACTEOS

DOCENTE

:

ING. AMELIA CASTRO

ESTUDIANTE

:

EDER J. RODRIGUEZ LUQUE

02 - 23102

AÑO

:

QUINTO

TACNA – PERÚ 2009

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