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BBA - Investigación de células moleculares 1864 (2017) 1809–1818

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BBA - Investigación de Células Moleculares

revista Página de inicio:www.elsevier.com/locate/bbamcr

El pepinillon de plantas y levaduras posee un motivo ácido conservado necesario para la

orientación correcta de las cargas de la membrana plasmática

Pablo Rosas-Santiagoun,1, Daniel Lagunas-Gómezun,b,1, Carolina Yáñez-Domínguezun,1,

Rosario Vera Estrellaun, Olga ZimmermannováC, Hana SychrováC, Omar Pantojaun,⁎
unInstituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca, Morelos 62250, México
bInstituto de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Av. Universidad 1001. Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos 62210,
México
CDepartamento de Transporte de Membranas, Instituto de Fisiología, Academia Checa de Ciencias, 142 20 Praga 4, República Checa

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: La exportación de proteínas de membrana a lo largo de la vía secretora se inicia en el retículo endoplásmico después de que las proteínas
Cornichon se pliegan y empaquetan dentro de este orgánulo mediante su reclutamiento en las vesículas del complejo de cubierta COPII. Se propone
Carolina del SurErv14
que los receptores de carga son necesarios para el transporte correcto de proteínas a su membrana objetivo, sin embargo, se sabe poco
Motivo ácido
sobre las señales de exportación de ER para los receptores de carga. Erv14/Cornichon pertenecen a una familia de proteínas bien
Selección de carga
conservada en eucariotas y se ha propuesto que funcionan como receptores de carga para muchas proteínas transmembrana. Amín
ácido el alineamiento de secuencias mostró la presencia de un motivo ácido conservado en los Cnts y
terminal en homólogos f motivopla rom la levadura. Aquí, demostramos que la mutación de la identificación ácida C-terminal no altera
deCarolina del SurErv14 oOs CNIH1, d la localización de estos receptores de carga, sin embargo, modificó la
orientación adecuada de los transportadores de membrana plasmática Nha1p, Pdr12p y Qdr2p. Nuestros resultados sugieren que la
orientación errónea de estas proteínas de la membrana plasmática es consecuencia de una interacción más débil entre el receptor de
carga y las proteínas de carga causada por la mutación del motivo ácido C-terminal.

1. Introducción [7]yCarolina del SurErv14 implicado en el transporte selectivo de proteínas

El tráfico de proteínas a lo largo de la vía secretora es un proceso esencial
para llevar proteínas solubles y de membrana a sus destinos finales y está
mediado por membranas unidas a vesículas que brotan del retículo endoplásmico
(ER) para fusionarse con el Aparato de Golgi (GA) como un paso inicial . Una vez
que las proteínas se pliegan y empaquetan correctamente en el RE, se transportan
selectivamente a vesículas recubiertas de COPII para el transporte a la AG.[1],
aunque también existen pruebas de su entrega en un flujo a granel no controlado
[2]. Se ha demostrado que Sec24, del sistema COPII, posee sitios de unión
exclusivos para la selección de proteínas de membrana específicas[3,4],
imponiendo un punto de control para el correcto tránsito a su membrana de
residencia. Parece que se produce un control adicional sobre la selección de
proteínas solubles y de membrana con la participación de proteínas integrales de
membrana que funcionan como receptores de carga. Entre los receptores de
carga, se han caracterizado varias proteínas del RE, como ERGIC53 y Erv29,
implicadas en la selección y transporte de glicoproteínas secretadas solubles.[5,6],
la familia de proteínas p24 que transportan proteínas ancladas a
glicosilfosfatidilinositol
integrales de membrana[8–10].
Informes recientes sobre el funcionamiento deCarolina del SurErv14 indican
que este receptor de carga selecciona proteínas integrales de membrana a través
de su interacción con dominios transmembrana largos (TMD), característicos de
las proteínas de membrana plasmática.[9]. También se ha demostrado que
algunos Carolina del SurLas cargas específicas de Erv14 se unen al segundo TMD
del receptor, así como a través de la interacción directa con la subunidad Sec24
del sistema COPII para el transporte adecuado en la vía secretora.[10]. Estos
autores también identificaron en Sec24 un nuevo motivo interactivo específico
para Carolina del SurErv14 que se requiere para el tráfico correcto de proteínas de
carga y propuso que esta interacción dual entre Sec24 con ambos, la carga y el
receptor de carga, es necesaria para el transporte exitoso de proteínas de carga
[10].
Trabajo adicional sobre proteínas cornichon (CNIH), homólogos de Carolina
del SurErv14, de células animales y vegetales, ha demostrado que el receptor es
necesario para la orientación correcta de una variedad de proteínas de
membrana. [11–15]. En Drosophila, CNI fue identificado como un interactor del
receptor EGF Gurken para su correcta expresión en la membrana, requerida

⁎Autor correspondiente.
Correos electrónicos:rosp@ibt.unam.mx (P. Rosas-Santiago),lagunas@ibt.unam.mx (D. Lagunas-Gómez),cyanez@ibt.unam.mx (C. Yáñez-Domínguez), rosario@ibt.unam.mx
(R. Vera-Estrella),Olga.Zimmermannova@fgu.cas.cz (O. Zimmermannová),Hana.Sychrova@fgu.cas.cz (H. Sychrová),omar@ibt.unam.mx (O. Pantoja).
1Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

http://dx.doi.org/10.1016/j.bbamcr.2017.07.004
Recibido el 6 de abril de 2017; Recibido en forma revisada el 27 de junio de 2017; Aceptado el 14 de julio de 2017
Disponible en línea el 16 de julio de 2017
0167-4889/ © 2017 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
P. Rosas-Santiago et al.
para el establecimiento del eje dorsal-ventral en el ovocito[11,12]. En
humanos, se ha demostrado el papel de las proteínas cornichon, con CNIH1
controlando el tráfico de TGFα desde el RE hasta la membrana plasmática.
[13], mientras que CNIH2 y 3 controlan el correcto tráfico del receptor de
glutamato tipo AMPA a la membrana plasmática[16,17]. En el caso particular
del receptor AMPA, se ha reportado que las proteínas cornichon también
permanecen asociadas a la proteína AMPA, modulando sus propiedades
electrofisiológicas al enlentecer la desactivación del canal[dieciséis]. En las
plantas, un cornichon de arroz (OsCNIH1) fue identificado como una
proteína que interactúa con el transportador de sodioOsHKT1;3 y requerido
para la correcta ubicación del transportador a la membrana de Golgi
[15]. Similar a lo que se ha observado para la levadura y las células animales,
OsCNIH1 se localizó en las membranas ER y GA[15]. Juntos, estos resultados
indican un papel conservado para la familia Erv14/Cornichon en el control
del tráfico inicial de proteínas de carga de membrana desde el ER al GA, lo
que confirma su papel como receptores de carga.
En un informe anterior, identificamos la presencia de lo que parecía ser un
motivo ácido conservado en el C-terminal de la cornichon vegetal y las proteínas
Erv14.[15], que en vista del papel que juegan los motivos ácidos -expuestos al
citoplasma- en la salida de proteínas del RE[18–22], abrió la pregunta de si este
motivo, expuesto a la luz del RE, jugó un papel particular en el funcionamiento de
los receptores de carga de plantas y levaduras. Además, los homólogos de Erv14/
Cornichon, en contraste con otras proteínas Erv de membrana multiexpansión
como Erv29 o Erv26 que tienen sus terminales N y C expuestos al citoplasma[23],
solo poseen tres TMD con el extremo N-terminal expuesto al citoplasma, dejando
el extremo C-terminal expuesto al lumen[8]. La exposición del extremo C-terminal
a la luz, junto con el motivo ácido presente en las proteínas de plantas y levaduras,
sugiere además un posible papel para este motivo en el funcionamiento de los
receptores de carga Erv14/Cornichon. Aquí demostramos que el motivo ácido es
de hecho un motivo conservado tanto para las plantas como para la levadura, que
es necesario para la unión del receptor de carga a las proteínas de carga y para la
ubicación correcta de esta última en la membrana plasmática.
2. Materiales y métodos
2.1. Cepas y medios de crecimiento
ÉlS. cerevisiae BYT45 (MATa his3Δleu2Δmet15Δura3Δ; nha1Δ::loxP
ena1-5Δ::loxP) yBYT45erv14Δ(MATa
his3Δleu2Δmet15Δura3Δ; Las cepas nha1Δ::loxP ena1-5Δ::loxP erv14Δ::KanMx),
derivadas de células BY4741, que se usaron en este trabajo son altamente
sensibles a los cationes de metales alcalinos por eliminación de los exportadores
de cationesENA1-5yNHA1y el receptor de cargaERV14[15,24]. La cepa BY4741 (
MATa his3Δ leu2Δ met15Δ ura3Δ)se usó para eliminar el QDR2yPDR12genes por
recombinación homóloga usando el gen marcador KanMX y el sistema Cre-loxP y
los oligos descritos en la Tabla complementaria S1, produciendo las cepas BY4741
qdr2Δy BY4741pdr12Δ.Los mutantes dobles BY4741qdr2Δerv14Δy BY4741
pdr12Δerv14Δtambién se generaron. Las células se cultivaron aeróbicamente a 30
°C en YPD completo estándar (extracto de levadura, peptona, glucosa al 2 %) para
preparar células competentes para la transformación; o YNB mínimo (base de
nitrógeno de levadura sin aminoácidos) con glucosa al 2%, suplementos
auxotróficos apropiados y sales cuando esté indicado. Para la identificación de los
fenotipos se registró el crecimiento celular durante 5 d. Para elmetrocomiendo-b
ased SdividirtubiquitinaSsistema (mbSUS)ensayo[25,26], los medios de levadura se
prepararon como se describió anteriormente[27]. El THY.AP4 (MATa ura3 leu2
lexA::LacZ::trp1 lexA::HIS3 lexA::ADE2)y THY.AP5 (MATα URA3 leu2 trp1, his3
loxP::ade2)las cepas de levadura se transformaron con los vectores pMETYC_GW y
pNX32_GW, respectivamente[28]. Los clones de Cub fueron preseleccionados para
identificar candidatos falsos positivos y falsos negativos como se informó.[27]. Los
cebadores utilizados se enumeran en la Tabla S2 complementaria. Las células de
levadura se transformaron por electroporación[29]o por el tratamiento LiAc[27].
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2.2. Construcción de plásmidos
El plásmido de origen pGRU1 pNHA1-985GFP utilizado en este trabajo se
obtuvo anteriormente[30,31]. Para las mutaciones E133A, D136A y D137A en
Carolina del SurErv14, el ORF deERV14se mutó en los nucleótidos A398C,
A407C y A410C para obtener los mutantes triple, doble y simple Erv14AAA,
Erv14EAA y Erv14EAD, respectivamente, mediante el uso de los cebadores
específicos descritos en la Tabla S2 complementaria. los genes ERV14AAA,
ERV14EAA, ERV14EADyOsCNIH1EEDEΔfueron clonados en el vector
pDONR221 del sistema Gateway. Los clones de entrada se generaron
siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen). La integridad de la
inserción del gen se confirmó mediante secuenciación y digestión conPVUII
(Roche). Proteínas de fusión marcadas con GFP deCarolina del SurErv14 de
tipo salvaje (denominado Erv14EDD), Erv14AAA, Qdr2 y Pdr12 se
construyeron amplificando los productos de PCR empleando los cebadores
descritos en la Tabla S2 complementaria y los amplicones se construyeron
mediante recombinación homóloga enS. cerevisiaeBW31a (MATa leu2-3/122
ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 mal10 ena1- 4Δ::HIS3
nha1::LEU2)detrás delNHA1promotor en pNHA1-985GFP (previamente
digerido conPVUyo)[30], dando como resultado los vectores pER-V14EDD-
GFP, pERV14AAA-GFP, pQDR2-GFP y pPDR12-GFP.Escherichia coliSe usó
DH5α como huésped para la amplificación del plásmido.E. coliLos
transformantes se cultivaron en medio estándar Luria-Bertani (LB)
suplementado con ampicilina (100 μg mL−1). Las construcciones se
confirmaron sin mutaciones mediante la secuenciación y el uso de los oligos
descritos en la Tabla S2 complementaria. Se empleó la clonasa LR
(Invitrogen) para transferir los fragmentos de ADNERV14EDD, ERV14AAA,
OsCNIH1 yOsCNIH1EEDEΔen el vector pXN32_GW (clones Nub); y los
fragmentosScQDR2yOsHKT1;3al vector pMETYC_GW (Cub clon) que se
usaron en el mbSUS, generando los pNub-ERV14EDD, pNub-ERV14AAA,
pNub-OsCNIH1 y pNub-Osclones CNIH1EEDEΔ o pQDR2-Cub y pOsClones
HKT1;3-Cub. Para complementar la falta de ERV14en BYT45erv14Δo BY4741
erv14Δcélulas, laERV14EDD, ERV14AAA, ERV14EAA, ERV14EADyOsCNIH1Los
genes se clonaron en pDR-F1 mediante una reacción de clonasa LR
(Invitrogen) generando las construcciones pDR-F1-ERV14EDD, pDR-F1-
ERV14AAA, pDR-F1ERV14EA-A, pDR-F1ERV14EAD y pDR-F1-OsCNIH1. Se
realizó la reacción de clonasa LR para transferir cada versión del gen al
vector pAG426GDP-EGFP para generar el pEGFP-ERV14EDD, pEGFP-
ERV14AAA, pEGFP- OsCNIH1 y pEGFP-OsConstrucciones CNIH1EEDEΔ.
2.3. Microscopía de fluorescencia confocal
La microscopía de fluorescencia confocal se realizó utilizando un microscopio
confocal multifotónico invertido Olympus FV1000 equipado con un objetivo de
inmersión en aceite de 60x (Olympus). La GFP se visualizó mediante excitación con
un láser de argón multilínea a 488 nm y el detector espectral se fijó entre 515/30
nm para la emisión. La fluorescencia de EYFP se visualizó mediante excitación con
un láser de argón a 514 nm con el detector espectral ajustado entre 540/30 nm
para la emisión. Las longitudes de onda empleadas para mCherry fueron 543 nm
(excitación) y 630/60 nm (emisión). Peelings epidérmicos abaxiales de hojas
transformadas deNicotiana benthamianalas plantas se colocaron en portaobjetos
de microscopio en agua y se cubrieron con un cubreobjetos. Los resultados son
imágenes representativas de > 10 células de tabaco de al menos cuatro
transformaciones independientes diferentes.
2.4. Preparación de fracciones de membrana microsomal
Las fracciones de membrana se prepararon a partir de células de levadura
según Nakanishi et al.[32]con algunas modificaciones. Las células de levadura se
precultivaron a 30 °C durante 1 día en medio YNB. Una alícuota de esta
suspensión celular se cultivó en 500 mL durante 12 h hasta alcanzar la fase
exponencial. Las células se recogieron por centrifugación a 4000 ×gramodurante 5
min. Después de 20 min de incubación en Tris 0,1 M, DTT 10 mM, glucosa 0,1 M a
pH 9,5, las células se sedimentaron a 4000 ×gramodurante 5 min y se trató con un
tampón de digestión que contenía glucosa 0,1 M, sorbitol 0,9 M, Tris- 50 mM
P. Rosas-Santiago et al.
Figura 1.Los homólogos de Cornichon de plantas y hongos poseen un motivo ácido conservado en el C-terminal. Representaciones de logotipos de los últimos 60 residuos de aminoácidos de (A) plantas, (B) hongos, (C)
artrópodos y (D) vertebrados (panel izquierdo). El panel derecho muestra los últimos seis aminoácidos conservados de cada grupo. Los resultados se derivaron de > 250 secuencias. La altura del LOGO representa la
frecuencia relativa de los aminoácidos. (E) Topología de membrana deCarolina del SurErv14 que muestra los aminoácidos ácidos expuestos a la luz del RE.
mes pH 7,6, 0,043% (Virginia Occidental)YNB sin aa, 0,25 × caída mezcla-His y
- Met, Zymolyase al 0,05% y DTT 5 mM durante 3 h a 30 °C en un agitador. Los
esferoplastos se recolectaron por centrifugación a 4000 ×gramodurante 10 min a
4 °C y resuspendido en Glicerol 1,1 M, PVP 40 000 1,5 %, Tris-Mes 50 mM pH 7,6,
EGTA 5 mM, BSA 0,2 %, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, BHT 0,5 mM y 1 mg L−1leupeptina,
y luego se homogeneizó en un homogeneizador de vidrio. Después de la
centrifugación a 4000 ×gramodurante 10 min para eliminar los restos celulares, la
fracción sobrenadante se centrifugó a 13.000 ×gramodurante 15 min obteniendo
la fracción P13 del sedimento. El sobrenadante se centrifugó a 100.000 ×gramo
durante 1 hy las membranas recogidas del sedimento se denominaron P100. Las
fracciones P13 y P100 se resuspendieron en tampón de suspensión que contenía
sorbitol 0,3 M, Tris-Mes 5 mM, pH 7,6, DTT 1 mM, PMSF 1 mM y 1 mg L−1leupeptina
y se almacenó a -80 °C hasta su uso.
2.5. SDS-PAGE e inmunotransferencia de proteínas
Las muestras se prepararon de acuerdo con el método de Parry et al.[33]. La
proteína se precipitó por dilución de las muestras 50 veces en 1:1 (v/v) etanol:acetona e
incubar durante la noche a -30 °C. A continuación, las muestras se centrifugaron a 13.000
×gramodurante 20 min a 4 ° C usando un rotor F2402 en una centrífuga de mesa GS-15R
(Beckman). Los pellets se secaron al aire, se resuspendieron con Laemmli[34]tampón de
muestra (concentración final de SDS al 2,5 %) y se calentó a 60 °C durante 2 min antes de
cargarlo en 12,5 %- (Virginia Occidental)mini-geles de acrilamida lineal. A menos que se
indique en las leyendas de las figuras, se cargaron 12 mg de proteína por carril. Las
proteínas separadas por SDS-PAGE se transfirieron electroforéticamente a membranas
de nitrocelulosa (Millipore) mediante métodos estándar. Después de la transferencia, las
proteínas se tiñeron con tinción de proteína Ponceau S (0,1%Virginia OccidentalEn 1%v/v
ácido acético durante 30 s) para comprobar la igualdad de carga/transferencia de
proteínas. A continuación, las membranas se bloquearon con TBS (Tris 100 mM, NaCl 150
mM) que contenía 0,02% (Virginia Occidental)Na-azida, y 5% (Virginia Occidental)leche en
polvo sin grasa durante 2 h a temperatura ambiente. Las membranas bloqueadas se
incubaron durante un mínimo de 3 h a temperatura ambiente con los anticuerpos
primarios apropiados con anti-GFP (Sigma-Aldrich, G1544, Lote 025M4754V), anti-
Dolichol-Phosphate-Mannose Synthase (Molecular Probes, A-6429, Lot .71E2-1)
1811
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y anti-Vps10 (Molecular Probes, A-21274, Lote. 71E1-1) seguido de la adición
de una dilución 1:2000 de anticuerpos secundarios (anticonejo de cabra o
anti-ratón) conjugados con rábano picante (Armoracia lapathifolia)
peroxidasa (Biotecnología Santa Cruz). La inmunodetección se llevó a cabo
utilizando el Luminata quimioluminiscente™Procedimiento Crescendo
(Millipore). Las imágenes fueron capturadas usando Gel DOC™SISTEMA XR+
(BIORAD).
2.6. Ensayo de inmunoprecipitación
La interacción entre el receptor de carga y las proteínas de carga se confirmó
mediante ensayos de coinmunoprecipitación, empleando 30 μg de proteína de la
fracción de membrana P13 de BYT45erv14Δqdr2Δcélulas que se incubaron con 500
μL de tampón de gel NET (Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet P-40 al
0,1 %, EDTA 1 mM y gelatina al 0,25 %) durante 1 h. Después de esto, la mezcla de
membranas se incubó con 1 μg de anticuerpo anti-GFP (Sigma-Aldrich G-1544)
durante la noche a 4 °C en una mesa giratoria. Para recuperar las proteínas co-
inmunoprecipitadas, la mezcla de la fracción P13 con el anticuerpo anti-GFP se
expuso a Proteína A Sepharose CL-4B (20 μL; Amersham), y la suspensión se agitó
durante otras 2 h a 4 °C. Luego, las muestras se centrifugaron a 12000 ×g durante
30 s y el sedimento se lavó dos veces con tampón de gel NET seguido de un
enjuague final con tampón de lavado (Tris/HCl 10 mM, pH 7,5, Nonidet P-40 al 0,1
%) y se centrifugó a 12 000 ×gramodurante 20 s. Luego, el sedimento se
resuspendió con 20 μL de tampón de muestra Laemmli al 2,5 %.[34]y se calentó a
95 °C durante 3 min. Las muestras se centrifugaron a 10.000 ×gramodurante 1
min antes de cargar en un gel de acrilamida lineal al 12,5 % para SDS-PAGE y la
posterior transferencia de proteínas.
3. Resultados
3.1. Los homólogos de cornichon de hongos y plantas poseen un motivo ácido
conservado en el terminal C luminal
En un trabajo anterior, identificamos que los homólogos de cornichon de plantas y
hongos, en contraste con los organismos de taxones superiores, poseen un ácido
P. Rosas-Santiago et al.
motivo en el C-terminal[15]. Para corroborar esta primera impresión, se procedió a
realizar un análisis BLAST utilizando la secuencia del cornichon de arroz o la del
Saccharomyces cerevisiaehomólogo,Carolina del SurErv14. Empleando la
secuencia deOsCNIH1, los primeros 500 aciertos correspondieron a plantas
seguidas de secuencias de hongos que mostraron un consenso en el Cterminal
con cuatro a cinco aminoácidos ácidos (Figura 1UN). Análisis similar usando el
Carolina del SurSecuencia Erv14 deS. cerevisiaeidentificó aproximadamente 450
secuencias de hongos con las 50 restantes correspondientes a secuencias de
animales, observando nuevamente un consenso en el extremo C-terminal de tres
a cuatro residuos correspondientes a Asp o Glu (Figura 1B). Es importante
mencionar que este consenso se derivó exclusivamente de las proteínas de los
hongos; pocas secuencias de proteína animal solo presentaron un residuo ácido
en el extremo C-terminal (datos no mostrados). La confirmación de que el motivo
ácido es exclusivo para plantas y hongos se obtuvo al contrastar la secuencia del
arroz con la de Arthropoda y Vertebrata. Para Arthropoda, se observó que a partir
de 200, solo dos secuencias presentaron dos aminoácidos ácidos en el C-terminal
y otras 15 poseen solo uno (Figura 1C). En proteínas de Vertebrata, solo un
aminoácido ácido estaba presente en tres secuencias diferentes de 500 (Figura 1
D). Con base en este análisis, definimos el motivo ácido como una región ubicada
en el Cterminal de las proteínas que contienen al menos tres aminoácidos ácidos.
Juntas, estas observaciones indican que el terminal C (expuesto a la luz del RE,
Figura 1E) Los homólogos de hongos y plantas difieren de los de otros eucariotas y
poseen un C-terminal ácido.
3.2. La localización subcelular de OsCNIH1 o ScErv14 no se modifica por
eliminación o mutación del motivo ácido C-terminal
OsCNIH1 yCarolina del SurErv14 han sido reportados como receptores
de carga que transitan entre el ER y el GA[15,35], que junto con la evidencia
sobre el papel de los motivos ácidos en el tráfico de proteínas[36–38], abrió
la pregunta de si el motivo ácido C-terminal en estos receptores de carga
regulaba o controlaba su movimiento entre estos dos compartimentos. Para
responder a esta pregunta, las fusiones C-terminal de Erv14EDD yOsCNIH1,
o los mutantes Erv14AAA oOsSe generaron CNIH1ΔEEDE a GFP o mCherry, y
la localización de las proteínas wt y mutantes se identificó mediante
microscopía confocal. Como se demuestra enFigura 2A, el patrón de
localización deCarolina del SurErv14 en células de levadura no cambió ya
que la fluorescencia asociada a Erv14EDD o Erv14AAA fue similar. Es
importante mencionar queCarolina del SurErv14-GFP fue funcional, como se
demuestra en Supl. Figura S1. Estas observaciones fueron corroboradas por
análisis de transferencia Western de proteínas separadas en las fracciones
P100 y P13 correspondientes a GA/PM y ER, respectivamente, como lo
indican los marcadores de organelos Vps10 (GA) y Dpm1 (ER) (Figura 2B).
Esta figura muestra que la abundancia de Erv14EDD o Erv14AAA fue similar
en los dos compartimentos subcelulares (44 kDa). En las fracciones
obtenidas a partir de células de levadura transformadas con el vector vacío
(pGRU), el anticuerpo anti-GFP no reconoció ninguna banda, lo que indica la
especificidad del anticuerpo (Figura 2B, recuadro). Para el homólogo de
cornichon vegetal, transformación transitoria deN. benthamianacélulas
epidérmicas de las hojas conOsCNIH1 (Figura 2c) oOsCNIH1ΔEEDE (Figura 2
D) mostró claramente que la localización de las dos proteínas también era
similar, colocalizando con ambas, el marcador EREnWAK2 y el marcador GA
gmHOMBRE (Figura 2C y D, superposición). Juntos, estos resultados indican
que la mutación del motivo ácido del hongo Erv14 o la eliminación de la
planta cornichonOsCNIH1 C-terminal no modificó su localización subcelular.
3.3. La ausencia del motivo ácido C-terminal en ScErv14 afecta la localización de
proteínas PM
En la levadura, el Na+-K+/h+antiportador Nha1 y el PM H+-ATPasa, Pma1,
son los principales mecanismos que regulan el K intracelular+, N / A+
y pH. En un trabajo anterior, demostramos que la orientación de Nha1 al PM requiere la
presencia deCarolina del SurErv14 para lograr la tolerancia a la sal[39]. Además,Carolina
del SurErv14 ha sido reconocido como un importante receptor de carga
1812
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para un gran grupo de proteínas de membrana[9,10]. En vista de los
resultados deFigura 2que demostró que el motivo ácido no modificaba la
localización de los receptores cargo, evaluamos si este motivo influía en el
reconocimiento del cargo Nha1[39]. Empleando la cepa sensible a la sal
BYT45erv14Δ[39], la coexpresión de Nha1-GFP con Erv14EDD demostró que
el antiportador se localiza principalmente en la membrana plasmática (Fig. 3
A, pNHA1-GFP + pDR-F1-ERV14EDD). Por el contrario, Nha1 permaneció en la
sala de emergencias tras la coexpresión con el mutante Erv14AAA (Fig. 3A,
pNHA1-GFP + pDR-F1-ERV14AAA). Las mismas células de levadura
transformadas con el vector vacío pDR-F1 no modificaron la ubicación de
Nha1 en el RE en ausencia deCarolina del SurErv14 (Fig. 3A, pNHA1- GFP +
pDR-F1-Vacío). Estos datos sugieren que el motivo ácido es importante para
el correcto tránsito de Nha1 a la membrana plasmática. Para confirmar estas
observaciones, analizamos la localización de la membrana del antiportador
por Western blot. Como se demuestra enFig. 3B, las formas mono y dímera
de Nha1[40], localizado en las fracciones de membrana plasmática (P100) y
ER (P13) en células cotransformadas con pDR-F1-ERV14EDD. Por el contrario,
las dos formas del antiportador se localizaron más abundantemente en la
fracción de RE cuando las células se cotransformaron con el mutante pDR-
F1-ERV14AAA (Fig. 3B), lo que confirma que el motivo ácido es importante
para que el receptor de carga controle la localización adecuada de su carga.
Estas observaciones fueron corroboradas cuantificando la intensidad de las
bandas, lo que mostró que la abundancia de dímero (250 kDa) fue mayor en
la fracción PM (P100) que en el ER (P13) de células cotransformadas con
Nha1-GFP y Erv14EDD, con una abundancia similar del monómero en ambas
fracciones de membrana (Suppl. Fig. S2A-B). Un resultado diferente se
obtuvo con las células transformadas con Nha1-GFP/ Erv14AA, donde se
cuantificó una menor abundancia tanto del monómero como del dímero en
la fracción P100, mientras que se observó una mayor abundancia de ambas
formas en la fracción P13, particularmente la forma monómera.
(Suplemento Fig. S2B). Evidencia adicional sobre la importancia del motivo
ácido deCarolina del SurErv14 para entregar Nha1 a la membrana
plasmática se recopiló analizando la sensibilidad del BYT45erv14Δ células a
NaCl. Los ensayos de prueba de caída demostraron que la coexpresión de
NHA1yERV14EDDconfirió a las células la capacidad de crecer a altas
concentraciones de NaCl, en comparación con la sensibilidad observada
para las células cotransformadas con plásmidos que alberganNHA1y el
mutante ERV14AAA (Fig. 3C). Co-transformación de BYT45erv14Δceldas con
los vectores vacíos o solo conNHA1tampoco logró conferir tolerancia a la sal
a las células transformadas (Fig. 3C).
Hace poco,Carolina del SurErv14 se ha identificado como un receptor de carga
responsable de la orientación adecuada de muchas proteínas de membrana, en
particular, a la membrana plasmática.[9,10]. Para confirmar la importancia del
motivo ácido C-terminal enCarolina del SurErv14, analizamos si la ubicación de
otros dos transportadores de PM de diferentes familias estaba influenciada por la
mutación del C-terminal deCarolina del SurErv14. Qdr2, un antiportador de
fármaco/protones (familia MFS), y Pdr12, una ATPasa de salida de ácido débil
(familia ABC), se ubicaron inicialmente en la membrana plasmática.[41,42], y más
tarde demostró ser dependiente deCarolina del SurErv14 para su correcta
ubicación a la membrana plasmática[9,10]. Co-transformación de BY4741
pdr12Δerv14Δcélulas con los vectores pPDR12-GFP y pDR-F1-ERV14EDD
condujeron a la correcta localización del transportador ABC Pdr12 en la membrana
plasmática (Figura 4A, paneles intermedios). Se obtuvieron resultados similares
con la cotransformación de BY4741qdr2Δerv14Δcélulas con los vectores pQDR2-
GFP y pDR-F1-ERV14EDD, observándose la fluorescencia asociada a Qdr2 en la
membrana plasmática de las células (Figura 4B, paneles intermedios). Se
obtuvieron resultados opuestos cuando el BY4741pdr12Δerv14ΔLas células se
transformaron con el vector mutante pDR-F1-ERV14AAA y pPDR12-GFP,
observándose la fluorescencia asociada al transportador principalmente en el RE (
Figura 4A, paneles inferiores), como el observado para las células transformadas
con el vector vacío pDR-F1 (Figura 4A, paneles superiores). Del mismo modo,
cuando el BY4741qdr2Δerv14ΔLas células se cotransformaron con los vectores
pDR-F1-ERV14AAA y pQDR2-GFP, se observó Qdr2 en el ER (Figura 4B, paneles
inferiores), al igual que en las células transformadas con el vector vacío pDR-F1 (
Figura 4B, paneles superiores). Estos resultados refuerzan la opinión de que el
motivo ácido C-terminal deCarolina del SurErv14 es
P. Rosas-Santiago et al. BBA - Investigación de células moleculares 1864 (2017) 1809–1818

Figura 2.La mutación del motivo ácido C-terminal conservado no modifica la ubicación subcelular de los homólogos de cornichon. (A) Retículo endoplásmico y ubicación del aparato de Golgi del receptor
de carga Erv14EDD de levadura y su versión mutada Erv14AAA. Las micrografías se muestran bajo Nomarski (derecha) y microscopía de fluorescencia (izquierda). (B) Ambas versiones del receptor de
carga de levadura mostraron una distribución de membrana similar. (Recuadro) Western blot de la línea parental BYT45erv14Δmostrando la ausencia de cualquier banda reconocida anti-GFP
inespecífica. (CD) Cornichon de arroz o su versión truncada localizada en ER y GA, como lo indica la co-localización conEnWAK2 ygmMarcadores MAN1 del ER y GA, respectivamente. Las barras son de 5
μm para (A y B) y de 25 μm para (C y D). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos diferentes.

Fig. 3.La orientación del intercambiador Nha1 a la membrana plasmática depende de la presencia del motivo ácido enCarolina del SurErv14. (A) Localización incorrecta del antiportador PM Nha1-GFP en el BYT45erv14ΔLas
células (arriba) se corrigieron mediante la transformación con ERV14EDD wt (centro), pero se evitaron cuando el motivo ácido estaba mutado en ERV14AAA (abajo). Las micrografías se muestran bajo Nomarski (derecha) y
microscopía de fluorescencia (izquierda). (B) Corroboración de la orientación adecuada de Nha1 al PM por Erv14EDD, pero no por Erv14AAA. (C) Tolerancia a la sal según BYT45erv14Δlas células se confirieron solo por
cotransformación con pNHA1-GFP y pDR-F1-ERV14EDD. Las barras son de 5 μm para (A). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos diferentes.

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P. Rosas-Santiago et al. BBA - Investigación de células moleculares 1864 (2017) 1809–1818

Figura 4.La localización de los transportadores de membrana plasmática de levadura requería el motivo ácido C-terminal deCarolina del SurErv14. La ubicación de la membrana plasmática del transportador ABC Pdr12 y la
proteína MFS Qdr2 solo se observaron en BYT45pdr12Δerv14Δ (A) o BYT45qdr2Δerv14Δ (B) células cuando se transforman con el receptor de carga de tipo salvaje (pDR-F1-ERV14EDD) pero no con el receptor vacío (pDR-F1-
Empty) o mutado (pDR-F1-ERV14AAA). Las micrografías se muestran bajo Nomarski (derecha) y microscopía de fluorescencia (izquierda). Las barras son de 5 μm para (A y B). Los resultados son representativos de al menos
tres experimentos diferentes.

importante para el correcto direccionamiento de las proteínas residentes en la
membrana plasmática. Además, observamos que en el mutante BY4741erv14Δla
localización del transportador de glicerolZrStl1-GFP o el deCarolina del SurPma1
(Nakanishi et al., 2007) a la membrana plasmática no se vio afectada, descartando
un posible efecto pleiotrópico de la eliminación de ERV14 (Fig. S3 complementaria
y datos no mostrados).
3.4. El papel del motivo ácido C-terminal se conserva en los homólogos de la
planta cornichon
Como se ha descrito enFigura 1, hongos y plantas, a diferencia de los animales
en general, comparten la presencia del motivo ácido en el Cterminal de las
proteínas. Buscando evidencia adicional sobre la importancia de dicho motivo,
utilizamos el homólogo del arrozOsCNIH1 con el C-terminal MIWTVLLEEDE, para
evaluar si podría complementar el papel de Carolina del SurErv14 en células de
levadura. Transformación de BYT45erv14Δcélulas con OsCNIH1 complementó la
orientación del antiportador Nha1 al

Figura 5.Un homólogo de cornichon vegetal con un motivo ácido C-terminal dirige correctamente el intercambiador Nha1 a la membrana plasmática. (A) El intercambiador Nha1 estaba correctamente ubicado en la
membrana plasmática de BYT45erv14Δcélulas por cornichon de arroz que poseen el motivo ácido (OsCNIH1) pero no por su mutante que carece de dicho motivo (OsCNIHΔEEDE). (B) Análisis de transferencia Western de
fracciones de membrana que muestran las formas mono y dímera de Nha1-GFP en las fracciones PM (P100) y ER (P13) de BYT45erv14Δcélulas cotransformadas con pNHA1-GFP y pDR-F1- OsCNIH1. En las mismas células de
levadura transformadas con el pDR-F1-OsCNIHΔEEDEvector, Nha1 solo se ubicó en la fracción ER (P13). (C) Asociado al correcto direccionamiento del cotransportador, se observó tolerancia a la sal en células que expresan
OsCNIH1 pero no en aquellos que expresanOsCNIHΔEEDE.Las micrografías se muestran bajo Nomarski (derecha) y microscopía de fluorescencia (izquierda); las barras son de 5 μm para (A). Los resultados son
representativos de al menos tres experimentos diferentes.

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P. Rosas-Santiago et al.
membrana plasmática, como lo indica la fluorescencia que rodea las células de
levadura, aunque también se observó una señal más débil en el ER (Figura 5A,
paneles intermedios). Transformación con el cornichon de arroz mutante (Os
CNIH1ΔEEDE) en el que se eliminaron los últimos cuatro aminoácidos ácidos, no
pudo dirigir Nha1 a la membrana plasmática que permaneció ubicada
principalmente en la sala de emergencias (Figura 5A, paneles inferiores). BYT45
erv14Δlas células transformadas con el vector vacío pDR-F1 también fallaron en
dirigir Nha1 a la membrana plasmática, dejando el antiportador en el RE (Figura 5
A, paneles superiores). Estos resultados indican que el motivo ácido en el C-
terminal de homólogos de cornichon en plantas parece desempeñar un papel
similar en la unión de proteínas de membrana plasmática de levadura. La
corroboración de estas observaciones se derivó del análisis de transferencia
Western de fracciones de membrana. Las formas mono (100 kDa) y dímero (250
kDa) de Nha1-GFP estaban claramente ubicadas en la fracción PM (P100) de BYT45
erv14Δcélulas cotransformadas con pNHA1-GFP y pDR-F1-OsCNIH1 (Figura 5B),
con menor abundancia en el RE (P13). En las mismas células de levadura
transformadas con el pDR-F1-OsEl vector CNIH1ΔEEDE, Nha1 se ubicó
mayoritariamente en la fracción ER (P13) sin observarse una presencia clara en la
PM (P100) (Figura 5B). Un análisis cuantitativo de estos resultados se presenta en
Supl. Fig. S2C-D. La evidencia funcional que ayudó a confirmar la importancia del
motivo ácido en la dirección de Nha1 a la membrana plasmática se derivó de
ensayos de prueba de caída con NaCl extracelular alto. Como se muestra enFigura
5C, BYT45erv14Δlas células solo pudieron crecer a altas concentraciones de NaCl
cuando se cotransformaron con pNHA1-GFP y pDR-F1-Osvectores CNIH1; ni pDR-
F1-OsCNIH1ΔEEDE ni pDR-F1-vacío, en combinación con pNHA1-GFP, confirieron
esta capacidad a las células mutantes de levadura (Figura 5C).
En vista de estos resultados, también probamos cómo se controló la
orientación de Pdr12 y Qdr2 mediante la cotransformación de los mutantes
dobles. pdr12Δerv14Δyqdr2Δerv14Δlíneas con el homólogo de arroz y su mutante.
De manera similar a lo que se observó para el antiportador Nha1, solo la
cotransformación con el homólogo de arroz condujo a la ubicación correcta de los
dos transportadores en la membrana plasmática (Figura 6AB, paneles
intermedios). Ubicación de los transportadores en células cotransformadas con
pDR-F1-vacío (paneles superiores) o pDR-F1-OsCNIH1ΔEEDE, se observó dentro de
las células, rodeando el núcleo, indicativo de una residencia ER (Figura 6AB,
paneles inferiores).
Figura 6.OsCNIH1 pero noOsCNIHΔEEDEse dirige correctamente a los transportadores de la membrana plasmática de la levadura. Pdr12 (A) y Qdr2 (B) se ubicaron correctamente en la membrana plasmática (paneles
centrales) por transformación con el motivo ácido que contiene pepinillon de arroz pDR-F1-OsCNIH1, pero no por el mutanteOsCNIHΔEEDEque carece del motivo ácido C-terminal (AB, abajo), o el vector pDR-F1 vacío
(paneles superiores). Las barras son de 5 μm para (A y B) y las micrografías se muestran bajo Nomarski (derecha) y microscopía de fluorescencia (izquierda). Los resultados son representativos de al menos tres
experimentos diferentes.
1815
BBA - Investigación de células moleculares 1864 (2017) 1809–1818
3.5. La presencia del motivo ácido del extremo C en los homólogos de cornichon es
necesaria para la unión a las proteínas de carga.
Todos los resultados anteriores indicaron que la entrega de proteínas ubicadas en la
membrana plasmática debe unirse directa o indirectamente a los receptores de carga
para su ubicación correcta en la membrana, lo que nos llevó a investigar esta posibilidad
empleando el ensayo mbSUS restringido a la membrana. [25,26]. Utilizando las proteínas
de la membrana cargo como cebo (fusiones Cub) y los receptores cargo o sus mutantes
como presa (fusiones Nub), se observó el crecimiento celular en el medio de selección (
Figura 7Un trompo, Ura−, trp−, Leu−, ade−, Su−), indicativo de la interacción de las dos
proteínas. Además, aún se observó crecimiento celular en presencia de diferentes
concentraciones de metionina, observándose un crecimiento disminuido a
concentraciones más altas debido a la represión gradual de la metionina.MET25promotor
[43](Figura 7una tapa; 5–500 μM Met). Estos resultados confirmaron las
interacciones entre los receptores de carga y las proteínas de carga, y el
crecimiento reducido en presencia de metionina indicó que las interacciones
Qdr2/ Erv14AAA yOsHKT1;3/OsCNIH1ΔEEDE (Figura 7A, arriba), eran más débiles
que aquellos con los receptores de carga de tipo salvaje, particularmente el que se
encuentra entre las proteínas vegetales (Figura 7A, Met 500 µM). Se obtuvo
información adicional sobre la fuerza de la interacción entre los receptores de
carga y las cargas a partir de la activación delLacZgen, según lo revelado por el
ensayo de β-galactosidasa (Figura 7Fondo). De acuerdo con la intensidad del color
azul dado por la hidrólisis de X-gal, las interacciones Qdr2/Erv14EDD yOsHKT1;3/
OsCNIH1 (Figura 7A, abajo) fueron más fuertes que las que se encuentran entre
Qdr2/Erv14AAA y OsHKT1;3/ OsCNIH1ΔEEDE, confirmando los resultados
obtenidos en presencia de metionina (Figura 7Una parte superior, 5–500 μM Met)
y refuerza la conclusión de que el motivo ácido del C-terminal de los receptores de
carga es importante en la interacción con sus proteínas de carga.
Se obtuvo evidencia adicional que respalda la participación del motivo
ácido de los receptores de carga de hongos y plantas en la interacción con
sus cargas mediante ensayos de coinmunoprecipitación. Empleando Qdr2-
GFP como cebo contra la fracción de membrana P13 de BY4741erv14Δqdr2Δ
células complementadas con pQDR2-GFP, y pERV14EDD-HA o pERV14AAA-
HA (marcadas con hemaglutinina), se detectó la presencia de Erv14-HA en
las primeras (Figura 7B, carril2), pero no en este último (Figura 7B carril 3)
con el anticuerpo anti-HA, como lo indica el
P. Rosas-Santiago et al. BBA - Investigación de células moleculares 1864 (2017) 1809–1818

Figura 7.Las proteínas de la membrana plasmática de carga establecen una interacción proteína-proteína más fuerte con los receptores que contienen un motivo ácido C-terminal. (A, arriba) Interacciones entreCarolina del
SurErv14 y Qdr2 oOsCNIH1 yOsHKT1;3 se redujeron tras la mutación del motivo ácido C-terminal (Qdr2/Erv14AAA yOsHKT1;3/OsCNIHΔEEDE),como consecuencia del aumento de las concentraciones de Met. NubG y NubWT
se utilizaron como controles para las interacciones de falsos positivos y falsos negativos, respectivamente. Crecimiento en presencia de Ade y His (Ura−TRP−, Leu−) corresponde a las condiciones de crecimiento del control.
(A, abajo) Actividad de LacZ revelada por la hidrólisis de X-Gal como resultado de la interacción entre las proteínas de la levadura (izquierda) y la planta (derecha). (B) Inmunoprecipitación de Qdr2-GFP de BY4741
erv14Δqdr2Δlas células complementadas con pQDR2-GFP y pERV14EDD-HA condujeron al aislamiento de Erv14EDD-HA (carril 2) pero no en la cotransformación con pERV14AAA-HA (carril 3; obsérvese la mayor abundancia
de Qdr2-GFP en este último). En las células transformadas con pQDR2 (sin etiquetar; carril 1), los anticuerpos anti-HA o anti-GFP no reconocieron ninguna proteína. Como control, se analizó el 3 % o el 10 % (entrada) de la
fracción de proteína de membrana P13 para detectar la presencia de Erv14-HA o Qdr2-GFP (carriles 4–5).

banda de 19 kDa. La presencia de Qdr2-GFP en las dos muestras se confirmó 4. Discusión

mediante el reconocimiento de la banda de 86 kDa por el anticuerpo anti-
GFP (Figura 7B, carriles 2 y 3) que, curiosamente, indicaron una mayor
abundancia de Qdr2-GFP en las células cotransformadas con pERV14-AAA-
HA. La banda de 23 kDa presente en las muestras co-inmunoprecipitadas
parece ser una señal inespecífica ya que también se observó en membranas
de BY-T45erv14Δqdr2Δcélulas cotransformadas con pQDR2 y pER-V14EDD-
HA no marcados (Figura 7B, carril 1). Presencia de Erv14-HA en BY4741
erv14Δqdr2Δcélulas cotransformadas con pQDR2-GFP y pER-V14EDD-HA se
demostró sondeando la fracción de membrana P13 correspondiente al 3 % o
al 10 % de los 30 μg de proteína utilizados en los ensayos de
coinmunoprecipitación, con el anticuerpo anti-HA, y observando una banda
de 19 kDa que fue más abundante en la muestra al 10% (Figura 7B, carril 5).
Presencia de Erv14AAA-HA en BY4741erv14Δqdr2Δlas células
cotransformadas con pQDR2-GFP se confirmaron mediante análisis de
inmunotransferencia de las proteínas de membrana con el anticuerpo anti-
HA (Supl. Fig. S4A). Cuando estas muestras se probaron con el anticuerpo
anti-GFP, no se observó señal en el rango de 86 kDa, lo que indica la baja
abundancia de Qdr2-GFP, que se correlacionó con la baja fluorescencia de
GFP observada en estas células (datos no mostrados). Sin embargo, se
observó la presencia de Qdr2-GFP en la fracción de membrana (Supl. Fig.
S4A). La inmunoprecipitación de Qdr2-GFP no provocó la reducción
inespecífica de las proteínas de la membrana del ER, como lo indica la
ausencia de Dpm1 en las fracciones inmunoprecipitadas (Supl. Fig. S4B).
El tráfico de proteínas a lo largo de la vía secretora es un proceso
estrictamente controlado que asegura la liberación de proteínas debidamente
plegadas que se inicia en el RE. El plegamiento correcto de proteínas conduce a la
exposición de motivos críticos que se ha identificado que desempeñan un papel
fundamental para la salida/recuperación de algunas proteínas desde/hacia el RE,
como motivos diácidos, difenilalanina o hidrofóbicos ubicados en el lado
citoplasmático. [44–46]. En vista de esta evidencia, junto con la aparente presencia
exclusiva de un motivo ácido en el C-terminal de los homólogos Erv14/cornichon
de hongos y plantas (Figura 1), se procedió a analizar la posibilidad de que este
motivo pudiera modificar el funcionamiento de los receptores de carga.
La conservación del C-terminal ácido abrió la posibilidad de que este
motivo pudiera estar involucrado en dos tipos diferentes de interacción, lo
que lleva al control del transporte de carga. Es decir, una interacción directa
del terminal C con la carga, o como una señal para el tráfico del receptor de
carga entre ER y GA. El truncamiento o mutación del motivo ácido en los
homólogos de la planta y la levadura, respectivamente, no modificó la
ubicación subcelular de los receptores.Figura 2A y C), descartando la
posibilidad de que el motivo ácido funcione como señal para su correcto
tránsito entre el RE y el GA. Para excluir la posible influencia de la GFP en la
localización de C-terminal etiquetadoCarolina del SurErv14 yOsCNIH1 o sus
mutantes, también fusionamos GFP con el N-terminal y observamos que los
receptores de carga y los mutantes se ubicaron principalmente en ER y GA
(Supl. Fig. S5), lo que indica que la etiqueta GFP no modificó

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P. Rosas-Santiago et al.
la localización celular de los receptores o de los mutantes. En vista de esto, el
mecanismo que podría explicar el destino erróneo de las proteínas de carga
de la membrana plasmática (higos. 3-6) es la prevención de su interacción
con los receptores. Un punto de vista que está respaldado por los resultados
de los ensayos mbSUS que indicaron la proximidad entre los receptores
intactos con sus proteínas de carga, que disminuyó claramente cuando el
motivo ácido del C-terminal fue mutado enCarolina del SurErv14 o eliminado
de OsCNIH1 (Figura 7UN). A partir de los resultados de mbSUS, en particular
aquellos en presencia de diferentes concentraciones de metionina, se puede
concluir que la interacción entreOsHKT1;3 yOsCNIH1ΔEEDEse vio más
gravemente afectado que entre Qdr2 y Erv14AAA, como sugiere el
crecimiento celular deficiente causado por la represión de laMET25promotor
(Figura 7A, arriba)[43]. Una conclusión también respaldada por la menor
intensidad de la hidrólisis de X-Gal de las células diploides que expresan los
receptores mutados y los transportadores (Figura 7Fondo). Este punto de
vista se vio reforzado por la asociación entre Erv14-HA y Qdr2-GFP como lo
demuestra el ensayo de co-inmunoprecipitación (Figura 7B), asociación que
se perdió en ausencia del motivo ácido (Erv14AAA-HA). Estas observaciones
se ven reforzadas por informes anteriores en los que se ha demostrado la
estrecha proximidad entre Erv14 con Nha1 o Qdr2 mediante ensayos de
coinmunoprecipitación.[9,15].
El fracaso del cornichon de arroz truncado proporcionó un refuerzo a la
importancia del motivo ácido en el reconocimiento de las cargas de proteína de
membrana por parte de los receptores.OsCNIH1ΔEEDE)en la orientación de los
transportadores de levadura a la membrana plasmática (higos. 5 y 6). Por el
contrario, el homólogo de arroz de tipo salvaje condujo a la ubicación correcta de
las proteínas de levadura (higos. 5 y 6). Juntos, nuestros resultados indican que el
motivo ácido es necesario para la interacción de los receptores de carga de
plantas y levaduras con algunas proteínas de membrana de carga y, en
consecuencia, para la ubicación correcta de estas últimas en la membrana
plasmática. Es importante mencionar que los resultados adicionales que
emplearon el mutante Erv14 Erv14EAD, con la mutación D137A, o el mutante
Erv14EAA, con la doble mutación D136A-D137A, modificaron el direccionamiento
de los tres transportadores en aproximadamente el 50 % de los cotransformados.
(Supl. Fig. 6), lo que indica que un dominio funcional parece requerir la presencia
de los tres aminoácidos ácidos (E133, D136 y D137) en Erv14 para la orientación
correcta de las cargas de la membrana plasmática.
Las interacciones proteína-proteína entre homólogos de cornichon de
plantas o levaduras con proteínas de membrana, con participación del
motivo ácido, pueden ser importantes para la liberación controlada de las
cargas a lo largo de la vía secretora donde el pH podría influir en este
proceso. Está bien establecido que a medida que la vía secretora avanza
desde el RE hasta el MP o la vacuola, la luz del orgánulo se vuelve más ácida.
[47], abriendo la posibilidad de que la interacción entre las dos proteínas se
debilite, liberando la carga en el orgánulo correcto según el pH luminal,
junto con la participación de las proteínas SNARE correspondientes
directamente involucradas en la fusión de membranas[48]Sin embargo, este
mecanismo queda por demostrar. Se ha demostrado un mecanismo similar
para el transporte de glicoproteínas desde el RE hasta el ERGIC de células de
mamíferos mediante el receptor de carga ERGIC-53, donde se postula que la
protonación de un residuo de histidina favorece la liberación de carga en el
ERGIC.[49]. La identificación del motivo ácido como un sitio para la
interacción con los cargamentos, se suma al motivo FLN recientemente
identificado ubicado en el segundo TMD deCarolina del SurErv14[10], y abre
la posibilidad de que se requiera la participación de múltiples sitios de
interacción entre los receptores de carga con sus cargas para establecer
interacciones más estrechas en vista del entorno abarrotado que parece ser
el sistema COPII, como lo indica la presencia de las subunidades Sec
comunes, los receptores cargo y SNAREs, entre otras proteínas que son
necesarias para la correcta estructuración de las vesículas COPII.
Alternativamente, la existencia de múltiples sitios de unión puede servir para
la selección de cargamentos, confiriendo a los homólogos cornichon/Erv14
un papel adicional en el sistema COPII.
En vista de la aparente ausencia del motivo ácido, se puede concluir
que los homólogos de cornichon animal deben emplear alternativas
1817
BBA - Investigación de células moleculares 1864 (2017) 1809–1818
mecanismos para la selección de cargas de membrana, y abre la posibilidad
de que la asociación dehsCNIH2 yhsCNIH3 con el receptor de glutamato tipo
AMPA en la membrana plasmática[dieciséis]puede ocurrir como resultado.
5. Conclusiones
Los homólogos de plantas y hongos de la familia de receptores de carga
de proteínas Erv14/cornichon se diferencian de otros eucariotas al presentar
un motivo ácido en el C-terminal expuesto a la luz del RE. La mutación del
motivo ácido no modifica la ubicación de los receptores de carga en el ER y
GA, sin embargo, sí afecta la ubicación final de las proteínas de carga al
evitar su tránsito hacia la membrana plasmática. El apilamiento de proteínas
de carga en el RE ocurre debido a una interacción más débil entre el
receptor de carga y las proteínas de carga por mutación del motivo ácido.
Contribuciones de autor
Experimentos Concebidos y Diseñados: OP, P. RS; Realizó los
experimentos, analizó los datos: PR-SD LG, C. YD, R. VE, OZ; Redactó el
artículo: OP; Redacción - revisión y edición: PR-SD LG, C. YD, R. VE, OZ,
HS; Prepararon las Imágenes Digitales: PR-SD LG, C. YD, OP
Documento de Transparencia
ÉlDocumento de transparenciaasociados con este artículo se pueden
encontrar, en versión en línea.
Conflicto de intereses
Todos los autores declaran no tener conflicto de interés con el contenido
de este artículo.
Agradecimientos
Asistencia del Dr. Arturo Pimentel y M.Sc. Se reconoce a Andres
Saralegui con microscopía confocal y al Laboratorio Nacional de
Microscopia Avanzada (UNAM, México). También se reconoce la
asistencia en el laboratorio de María Guadalupe Muñoz García.
También agradecemos a Pavla Herynková por su ayuda. PR-SD LG, y C.
YD fueron apoyados por becas CONACYT-México.
Fondos
Esta investigación fue apoyada por una Beca del Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología- México 220085; una Beca de la Dirección General de
Apoyo al personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México
IN203817 y una Beca Bilateral del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología-
México-República Checa 210123 a OP El trabajo en el laboratorio de HS fue
apoyado por LQ1604 NPU II provisto por MEYS , CZ.1.05/1.1.00/02.0109
BIOCEV aportado por FEDER y MEYS, y el proyecto de cooperación Bilateral
CAS-CONACyT 14/005. OZ recibió el apoyo de Grant GACR 17-01953S.
Apéndice A. Datos complementarios
Los datos complementarios a este artículo se pueden encontrar en línea enhttp://dx.
doi.org/10.1016/j.bbamcr.2017.07.004.
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