PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA 2
CUANTIFICACION DE PROTEÍNAS Y SDS PAGE: Análisis Cuantitativo y Cualitativo de
fracciones de proteínas obtenidas a partir del fraccionamiento de núcleos y
citoplasma y el fraccionamiento por columnas de exclusión de lisados de K562

Alfonso Barreto MSc, PhD

Grupo de Inmunobiología y Biología Molecular

OBJETIVO

Realizar una caracterización cuantitativa y cualitativa de las fracciones obtenidas a

partir del fraccionamiento de núcleos y citoplasma y del fraccionamiento por las
columnas de exclusión.

DESCRIPCION GENERAL

En esta práctica las muestras extraídas y fraccionadas en la práctica anterior se van a

analizar de forma cuantitativa y cualitativa por medio de la cuantificación de proteínas
y la separación en geles de poliacrilamida SDS-PAGE, respectivamente. A cada
integrante de cada grupo se le ha asignado un rol definido. Cada estudiante trabajará
de forma separada pero su labor dependerá de la labor realizada por sus demás
compañeros.
- Uno de los integrantes estará encargado de preparar las diluciones y muestras
tanto para la cuantificación de proteínas, como para la electroforesis.
- Otro de los integrantes del grupo llevará a cabo la cuantificación de las
proteínas de las diluciones de las fracciones de citoplasma y núcleo, como de
las fracciones de la cromatografía de exclusión.
- Y el otro integrante se encargará de preparar los geles para la electroforesis,
así como de sembrar las muestras de su grupo en los geles para proceder a
correr las electroforesis.
- TODOS los estudiantes deben hacer tanto los cálculos de determinación de
proteínas como la construcción del cromatograma a partir de los datos
obtenidos para las fracciones recuperadas de la columna de exclusión de la
práctica pasada. ENTREGAR ESTOS ANALISIS Y CALCULOS EN PAPEL
MILIMETRADO AL FINAL DE LA CLASE

PROTOCOLO
PREPARACION DE MUESTRAS

Acá se van a preparar las muestras que se van a usar tanto para la cuantificación de
proteínas como para la separación en geles SDS PAGE.
PREPARACION DILUCIONES MUESTRAS PARA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Para la cuantificación de proteínas se deben preparar diluciones 1 en 10 de las

muestras de citoplasma y núcleos. Preparar en tubos Ependorf marcado
adecuadamente, 50 ul de cada dilución (5 ul de la muestra correspondiente + 45 ul de
agua destilada como diluyente). Las fracciones de las columnas de exclusión no se
deben diluir para la cuantificación de proteínas. Una vez preparadas las diluciones de
las muestras de citoplasma y núcleos entregar a su compañero encargado de realizar
la cuantificación de proteínas.

PREPARACION MUESTRAS PARA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS SDS PAGE

- Preparación muestras fracciones de proteínas columnas de exclusión:

Seleccione de su grupo las fracciones que presentaron mayor concentración
de proteínas. Marque tubos Ependorf indicando el # fracción y grupo y
agréguele a ese tubo 8 ul del Buffer carga y agréguele 32 ul de la fracción
correspondiente. Hierba en baño maría todos los tubos durante al menos 5
minutos en ebullición, centrifugue por unos 30 segundos para que la muestra
preparada se siente en el fondo del tubo y entregue los tubos a su compañero
encargado de la electroforesis de proteínas.
- Preparación muestras fracciones núcleos y citoplasma:
De acuerdo con el análisis de cuantificación de proteínas usando los datos de
densidad óptica de su compañero de la cuantificación de proteínas seleccione
las muestras no tratadas o las tratadas y prepare una muestra de citoplasma y
una muestra de núcleos. Haga los cálculos correspondientes para preparar 40
ul de muestra en Buffer carga de la siguiente manera:
- Marque un tubo Ependorf citoplasma y # grupo y el otro núcleo y citoplasma
y agregue 8 ul de Buffer carga + el volumen de muestra adecuada donde estén
60 ug totales de proteínas + diluyente necesario para completar el volumen
final de 40 ul. Use como diluyente Buffer Tris 6.8. Hierba en baño maría los 2
tubos durante al menos 5 minutos en ebullición, centrifugue por unos 30
segundos para que la muestra preparada se siente en el fondo del tubo y
entregue los tubos a su compañero encargado de la electroforesis de
proteínas.

PROTOCOLO
CUANTIFICACION DE PROTEÍNAS

PROCEDIMIENTO ESTANDARD PARA DETECTAR CONCENTRACIONES SUPERIORES AL RANGO

DE 0.05 mg/mL a 0.5 mg/mL

- Se prepara inicialmente 5 diluciones de un estándar de proteínas a partir de una

solución Stock de albúmina: se preparan diluciones seriadas de 500, 250, 125, 62.5
y 31.25 g/mL. Preparar 50 ul de cada dilución en la fila D de la placa de 96 pozos.
- Colocar 10 ul de cada dilución del patrón en la fila A de la placa de 96 pozos del
pozo A1 al pozo A5, en el pozo A12 coloque 10 ul de agua destilada como blanco
de la prueba. En las filas B y C agregue 10 ul de cada una de las fracciones de la
cromatografía de exclusión así como de cada dilución de las muestras de núcleos
y citoplasma que su compañero de preparación de muestras le entrego. En
seguida, colocar 200 ul del colorante de Bradford, y dejar estabilizar por unos 5
minutos a temperatura ambiente.

- Leer la absorbancia 595 nm. Entregue los datos a sus compañeros de grupo.

- Construya una curva de absorbancia vs concentración de proteínas y calcule la

cantidad de proteína para cada fracción y muestra analizada.

- Con los datos de las fracciones de cromatografía de exclusión construya un

cromatograma.

PROTOCOLO
ELECTROFORESIS SDS-PAGE

PREPARACIÓN DE GELES:

- Realizar el montaje de los dos vidrios en los soportes de ensamblaje de geles

- Preparar un gel de corrido o también llamado gel de resolución agregando los

reactivos en el siguiente orden en un vaso de precipitado de 50 ml:

Gel de Corrido
10%

Agua desionizada 2.0 ml

Buffer Tris-HCl pH 8.8 1.25 ml
Acrilamida/Bisacrilamida 1.65 ml
SDS 10% 50 ul
*Persulfato de Amonio 50 ul
*Temed 5 ul

*Una vez agregados sembrar en los vidrios correspondientes.

- Con ayuda una pipeta Pasteur de plástico adicione lentamente la solución

preparada hasta la marca señalada. Luego agregue con mucho cuidado unos 300
ul de agua desionizada sobre la superficie con el fin de crear una barrera que evite
la entrada de oxígeno. Deje polimerizar unos 30 minutos.
- Preparar el gel concentrador (“stacking”) agregando los reactivos en el siguiente
orden en un vaso de precipitado de 50 ml:

Gel concentrador (“Stacking”)

Agua desionizada 3.4 ml

Buffer Tris-HCl pH 6.8 0.630 ml
Acrilamida/Bisacrilamida 0.830 ml
SDS 10% 50 ul
*Persulfato de Amonio 50 ul
*Temed 5 ul

- Descarte sobre una toalla de papel el agua sobre la superficie del gel de corrido
polimerizado y usando una pipeta Pasteur de plástico agregar la solución de gel
concentrador sobre el gel de corrido e inmediatamente colocar los peines para
formar los pozos. Dejar gelificar por 10 min.

- Retirar el sistema con los vidrios y el gel solidificado del soporte y ensamblarlos en
la cámara con ayuda del Tutor. Cubrir la cámara superior con el buffer de corrido
1X y llenar la cámara inferior con el mismo buffer hasta la señal. Retirar el peine y
colocar el soporte de sembrado. Con cuidado con una ayuda de una pipeta de 0.5
a 10 ul sembrar con cuidado 20 ul por carril de cada muestra entregada por su
compañero de preparación de muestras.

- Colocar la tapa y conectar la cámara en la fuente de poder. Correr a 200 Voltios

constantes.

- Una vez finalizada la electroforesis, desensamblar el sistema y separar los vidrios

con ayuda de uno de los separadores. Retirar el gel levantándolo, pero no halarlo
para no romperlo.

- Realizar tinción de azul de Comassie.

APENDICE

SOLUCIONES

1. ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA

Archilamida 29.1 g
Bisacrilamida 1.0 g
Agua desionizada 100 ml
Almacenar en frasco ámbar a 4C.

2. BUFFER Tris-HCl pH 8.8 1.5M

Tris Base 9.075 g

Agua desionizada 40 ml
Ajustar pH a 8.8 con HCl
Completar con Agua desionizada a 50 ml y almacenar en frasco ámbar a 4C.

3. BUFFER Tris-HCl pH 6.8 0.5M

Tris Base 3g
Agua desionizada 40 ml
Ajustar Ph a 6.8 con HCl
Completar con Agua desionizada a 50 ml y almacenar en frasco ámbar a 4C.

4. SDS 10%

SDS 2.5 gr
Agua desionizada 25 ml

5. PERSULFATO DE AMONIO (PSA)

PSA 0.05 gr
Agua desionizada 500 ul
Preparar en el momento de hacer el gel

6. Gel de Corrido (A)

10%

Agua desionizada 4.0 ml

Buffer Tris-HCl pH 8.8 2.5 ml
Acrilamida/Bisacrilamida 3.3 ml
SDS 10% 0.1 ml
*Persulfato de Amonio 50 l
*Temed 5 l

*se agregan al final.

Nota: Estas cantidades corresponde a la preparación de 2 geles de poliacrilamida

 7. Gel concentrador (B) (“Stacking”)

Agua desionizada 3.4 ml

Buffer Tris-HCl pH 6.8 0.630 ml
Acrilamida/Bisacrilamida 0.830 ml
SDS 10% 50 l
*Persulfato de Amonio 50 l
*Temed 5 l

8. Solución colorante Azul de Coomasie

Metanol 30 ml
Agua desionizada 60 ml
Ácido acético 10 ml
Azul de coomasie 0.25 gr
Filtrar con papel whatman y guardar en frasco ámbar a temperatura ambiente

9. Solución decolorante

Metanol 30 ml
Agua desionizada 60 ml
Ácido acético 10 ml

10. Buffer de Corrido 5X

Glicina 72 gr
Tris Base 15.1 gr
SDS 2.5 gr
Agua desionizada 1000 ml
Guardar en frasco ámbar a 40C.

11. Buffer de Corrido 1X

Buffer de Corrido 5X 200 ml

Agua desionizada 800 ml