Práctica 3 : Proteínas: Extracción, cuantificación y análisis de las proteínas de la leche
OBJETIVOS
 Determinar experimentalmente el punto isoeléctrico de la caseína
 Calcular la concentración de proteínas en muestra problema utilizando espectrofotometría
 Conocer los principios de la técnica de electroforesis SDS-PAGE.
INTRODUCCIÓN
La nutrición es la toma y uso de alimentos por un
organismo. Este es el proceso por el cual, los seres
vivientes obtienen energía de los alimentos y
bebidas con el propósito de crecer y mantenerse. La
nutrición es interpretada como un estudio de los
procesos orgánicos por los cuales un organismo
asimila y usa los alimentos para el funcionamiento
normal, crecimiento y mantenimiento. La nutrición
es un proceso de tres partes: la primera, consumo de
comidas y bebidas, la segunda el rompimiento de
esos alimentos o bebidas en nutrientes y la tercera,
el viaje de esos nutrientes a través del torrente
sanguíneo a diferentes partes del cuerpo para ser
usados como “combustible” y para otros propósitos.
Para un organismo obtener una adecuada nutrición,
éste debe comer y beber comidas que contengan
nutrientes claves.
Los alimentos pueden ser clasificados con base en
su valor nutritivo, este viene dado por la cantidad de
nutrientes que aportan a un organismo cuando son
consumidos. Estos nutrientes pueden ser lípidos,
glúcidos, proteínas, vitaminas y minerales. El valor
nutritivo es diferente en cada grupo de alimentos,
algunos alimentos poseen más o menos nutrientes
que otros. Es por eso, que para clasificarlos se debe
tomar en cuenta el nutriente que más abunda en su
composición.
Los alimentos también cumplen distintas funciones
en el organismo. De acuerdo a su función los
alimentos se clasifican en:
 Energéticos: Estos alimentos son los glúcidos y
los lípidos
 Reparadores: Los alimentos más importantes de
este grupo son las proteínas
 Reguladores: Estos alimentos contienen
sustancias que utiliza el organismo en
cantidades muy pequeñas para asimilar
correctamente los alimentos y así contribuir a
coordinar el funcionamiento del cuerpo. Se
considera que estos alimentos no aportan
calorías al organismo. En este grupo se
encuentran las vitaminas; también se incluyen
los minerales y el agua
Uno de los alimentos más importantes que deben
estar en la dieta de un organismo como el ser
humano es la leche que contiene macromoléculas
como los glúcidos y los lípidos que la hacen ser un
alimento energético, adicionalmente cuenta con una
cantidad considerable de proteínas formando parte
de los alimentos reparadores.
Se entiende como leche al producto integral del
ordeño total e ininterrumpido, en condiciones de
higiene que da la vaca lechera en buen estado de
salud y alimentación. Esto además, sin aditivos de
ninguna especie. Agregado a esto, se considera
leche, a la que se obtiene fuera del período de parto.
La leche de los 10 días anteriores y posteriores al
parto no es leche apta para consumo humano.
Siempre el ordeñe debe ser total, de lo contrario al
quedar leche en la ubre, la composición química de
esta cambiará.
Leche fluida entera
Leche a granel higienizada, enfriada y mantenida a
5°C, sometida opcionalmente a terminación,
pasteurización y/o estandarización de materia grasa,
transportada en volúmenes de una industria láctea a
otra para ser procesada y envasada bajo normas de
higiene.
La leche fluida entera puede ser sometida a
procedimientos de higienización por calor. Procesos
de ultra alta temperatura (UAT ó UHT), que
consisten en llevar la leche homogenizada a
temperaturas de 130°C a 150°C durante 2 a 4
segundos, permiten higienizarla de forma apropiada
y de manera que estas puedan llegar en forma
segura al consumidor. Las leches pueden ser
modificadas en su contenido graso.
La leche contiene vitaminas (principalmente
tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas
A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo
y metales en pequeñas cantidades), proteínas
(incluyendo todos los aminoácidos esenciales),
carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos
elementos importantes de los que carece la leche
son el hierro y la vitamina C.
Las proteínas se pueden clasificar de manera
general en proteínas globulares y fibrosas. Las
proteínas globulares son aquellas que tienden a
agregarse en formas esferoidales y no establecen
interacciones intermoleculares como son los puentes
de hidrógeno (característicos de las proteínas
fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones
coloidales. En la leche hay tres clases de proteínas:
caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas
globulares).
La caseína es una proteína conjugada de la leche del
tipo fosfoproteína que se separa de la leche por
acidificación y forma una masa blanca. Las
fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están
químicamente unidas a una sustancia que contiene
ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los
grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo
de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en
la leche se encuentra en forma de sal cálcica
(caseinato cálcico). La caseína representa cerca del
77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y
el 2.7% en composición de la leche líquida.
La caseína está formada por alpha(α 1), alpha(α2)–
caseína, β–caseína, y kappa–caseína formando una
micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína
son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se
añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada
una de ellas por separado se forma un complejo de
caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta
micela está estabilizada por la kappa caseína
mientras que las alfa y beta son fosfoproteínas que
precipitan en presencia de iones calcio.
La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos
fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos
a ella. También tiene todos sus residuos de serina y
treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo,
así como los carbohidratos dispuestos en una sola
cara de su superficie por lo que esta parte exterior es
fácilmente soluble en agua gracias a los grupos
polares que posee. La otra parte de su superficie se
une fácilmente a las alfa y beta caseína insolubles,
lo que da lugar a la formación de la micela.
La propiedad característica de la caseína es su baja
solubilidad a pH 4.6. El pH de la leche es 6.6
aproximadamente, estando a ese pH la caseína
cargada negativamente y solubilizada como sal
cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga
negativa de la superficie de la micela se neutraliza
(los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra
precipita.
La conformación de la caseína es similar a las
proteínas desnaturalizadas globulares. El alto
número de residuos de prolina en la caseína causa
un especial plegamiento en la cadena de proteína e
inhibe la formación de una fuerte y ordenada
estructura secundaria. La caseína no contiene
puentes disulfuro. De igual manera la falta de
estructura secundaria es importante para la
estabilidad de la caseína frente a la
desnaturalización por calor. La carencia de
estructura terciaria facilita la situación al exterior de
los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión
entre unidades proteicas y la convierte en
prácticamente insoluble en agua. En cambio es
fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en
soluciones salinas tales como oxalato sódico y
acetato sódico.
La función biológica de las micelas de caseína es
transportar grandes cantidades de Ca y P altamente
insoluble en forma líquida a los lactantes y formar
un coagulo en el estómago para favorecer una
nutrición eficiente. Además de caseína, Ca y P la
micela formada también contiene citrato, iones,
lipasa, enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas
ocupan del 6 – 12% del volumen total de la leche.
Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante
cuando se precipita la caseína en medio ácido son
proteínas globulares, hidrofílicas y fácilmente
solubles en agua así como susceptibles de
desnaturalización por calor. Las principales son β–
lactoglobulina, α-lactalbumina, bovine serum
albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig).
La caseína se emplea en la industria para la
fabricación de pinturas especiales y en el apresto de
tejidos, la clarificación de vinos, la elaboración de
preparados farmacéuticos y la fabricación de
plásticos. La pintura de caseína ha sido usada desde
la antigüedad por los egipcios.
Punto isoeléctrico
Todas las macromoléculas de la naturaleza
adquieren una carga cuando se dispersan en agua.
Una característica de las proteínas y otros
biopolímeros es que la carga total que adquieren
depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta
dependiendo del pH del medio en el que se
encuentren y de los aminoácidos que la componen,
así como de las cargas de cualquier ligando que se
encuentre unido a la proteína de forma covalente
(irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la
proteína, los radicales libres pueden existir en tres
formas dependiendo del pH del medio: catiónicos,
neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría una
carga neta positiva si se encuentra en un medio lo
suficientemente ácido debido a que los grupos
COOH de los aminoacidos aspártico y glutámico
estarían en su forma neutra pero los grupos amino
de arginina y lisina estarían protonados (–NH3+).
De igual forma si la proteína se encuentra en un
medio con un pH muy alto estaría cargada
negativamente ya que en este caso los grupos
carboxilo estarían desprotonados (COO–) y los
grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un
pH característico al cual su carga neta es cero. A
este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el
punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el
equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que
la proteína presenta su máxima posibilidad para ser
precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su
agregación.
Si suponemos una proteína formada únicamente por
aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga
neta de la proteína dependería exclusivamente de la
protonación/desprotonación de los grupos amino y
carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están
formadas por multitud de aminoacidos unidos
mediante enlaces peptídicos y la carga va a
depender de los grupos ionizables que poseen los
aminoacidos que la componen y del pH del medio.
Determinación colorimétrica del contenido de
proteínas en leche de vaca
Con frecuencia se nos presenta el problema de tener
que analizar proteína en una muestra de alimento,
como puede ser la leche de vaca. En este tipo de
casos es bueno saber el contenido aproximado de
proteína de la muestra (en el caso de la leche de
vaca está en torno al 2-3% p/v) para hacer las
diluciones pertinentes que nos permitan encajar la
muestra en la recta patrón. Lo que se pide en este
caso es que el alumno haga precisamente eso y
obtenga un valor exacto del contenido proteico de
una muestra de leche de vaca.
Electroforesis
La electroforesis de proteínas en geles con una
matriz de poliacrilamida, comúnmente denominada
electroforesis en poliacrilamida (PAGE,
polyacrilamide gel electrophoresis) es sin duda
alguna una de las técnicas más ampliamente usada
para caracterizar mezclas complejas de proteínas.
La electroforesis en poliacrilamida es un método
conveniente, rápido y económico a nivel de muestra
pues se requieren sólo cantidades del orden de
microgramos de proteína.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si
se encuentran en un medio que tenga un pH
diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen
la propiedad de desplazarse cuando se someten a un
campo eléctrico. La velocidad de migración es
proporcional a la relación entre las cargas de la
proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad
de masa más rápida será la migración. Empleando
geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando
las proteínas en una zona estrecha en torno a los
electrodos se pueden determinar diferencias de
carga neta (carga total/masa) entre proteínas. Este
método se denomina electroforesis zonal. La matriz
de poliacrilamida no es un buen soporte para este
método pues la migración de las proteínas en su
seno no sólo es proporcional a la carga neta sino
también al tamaño y forma de las proteínas.
Una ventaja importante de los geles de
poliacrilamida es que son químicamente inertes,
transparentes y estables en un amplio rango de pH,
temperatura y fuerza iónica. Algunas características
destacables de la electroforesis en geles de
poliacrilamida son:
Los geles de poliacrilamida se forman por la
polimerización de la acrilamida por acción de un
agente entrecruzador (cross – linking), la bis-
acrilamida en presencia de un iniciador y un
catalizador. Como iniciador se suele utilizar
TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y como
catalizador el ión persulfato (S 2O8 –) que se añade en
forma de persulfato amónico. En algunas
situaciones, como por ejemplo en
isoelectroenfoque en el que la presencia de
persulfato puede interferir con la electroforesis se
emplean riboflavina y TEMED.
Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el
oxígeno es un inhibidor de la polimerización.
Además, durante la polimerización se libera calor
que podría provocar la formación de burbujas en el
seno del gel. La velocidad de polimerización viene
determinada por la concentración de persulfato
(catalizador) y TEMED (iniciador).
La porosidad del gel la determina las proporciones
relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo
menor el poro cuanta más bisacrilamida vs
acrilamida se use.
El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida
determina el rango de separación del gel.
Habitualmente los geles se denominan en función
del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen.
Así, la mayoría de las proteínas se separan bien en
el rango 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor
tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de
gran tamaño.
En función del estado de las proteínas (nativo o
desnaturalizado) a lo largo del proceso
electroforético éstas se clasifican en electroforesis
nativas o desnaturalizantes.
Una electroforesis desnaturalizante, la más común,
es la que somete a las proteínas a migración
asegurando la completa desnaturalización (pérdida
de la estructura tridimensional). En esta situación la
migración es proporcional a la carga y al tamaño de
la molécula pero no a su forma. El agente
desnaturalizante más empleado es el
sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.
Una electroforesis nativa es la que somete a las
proteínas a migración sin desnaturalización. En esta
situación las proteínas migran en función de su
carga, de su tamaño y de su forma. Además se
mantienen en ciertos casos las interacciones entre
subunidades y entre proteínas, separándose los
complejos. Los sistemas tampón empleados en estos
caso son: tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-
borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-acetato (rango
el de pH 7.2 a 8.5).
MATERIALES Y REACTIVOS
Los siguientes materiales y reactivos son de uso
general:
 Soluciones buffer pH 4.0 y 7.0 para calibrar el
potenciómetro
 Potenciómetro
 Espectrofotómetro
 Leche de vaca líquida comercial
 Cámara de electroforesis
 Fuente de poder
 Reactivo de Biuret
 Patrón de albúmina de huevo 5 mg/ml
 Un juego de micropipetas
MATERIAL
REACTIVOS
CANTIDAD TIPO
Vaso de
10 precipitado de 25 Agua destilada
ml
 Vaso de Al finalizar queda un precipitado blanco de fácil
Acetato sódico
2 precipitado de 50 manipulación, el cual es la caseína.
0.1 N
ml
vaso de Secar la caseína extraída. Pesar la caseína una vez
Ácido acético esté seca.
1 precipitado de
0.01 N
250ml
tubos de ensayo Ácido acético 0.1 Determinar rendimiento de extracción de caseína.
10
N
Probeta de 50ml Ácido acético 1.0
1
N
Matraz aforado Preparación de solución de caseína
1 NaOH 1N Colocar aproximadamente 250mg de caseína en un
de 50 ml
pipeta graduada vaso de precipitado de 50mL. Agregar 20mL de
1 Éter etílico agua destilada y 5mL de NaOH 1N, agitar hasta
de 5.0 ml
pipeta graduada completar la disolución total de la caseína.
1 Etanol al 70%
de 1.0 ml
pipeta graduada Una vez disuelta la caseína se vierte a un matraz
1 aforado de 50mL, adicionar 5mL de ácido acético
de 10.0 ml
Embudo de 1N y diluir con agua destilada hasta 50mL. La
1 solución debe ser clara y limpia. (Se debe guardar
vidrio mediano
1 Termómetro una muestra de la caseína final solubilizada como
Papel de filtro solución C).

Determinación del punto Isoeléctrico de la

Nota: Las soluciones que se requieren para la
caseína
electroforesis se adjuntan en el Anexo 1, estas
Colocar en 10 vasos limpios y secos los siguientes
soluciones ya han sido previamente preparadas para
volúmenes de los reactivos:
la práctica en el laboratorio

Acetato Ácido Ácido pH

sódico acético acético resultante
Tubo
PROCEDIMIENTO 0,1N 0,1N 0,01N aproximado
SESION 1 : Aislamiento de caseína (ml) (ml) (ml)
Calentar en un vaso de precipitado de 50 a 100 mL 1 0,5 9,5 - 3,2
de agua destilada a 38°C, añadir 50mL de leche. 2 1,0 9,0 - 3,6
Luego agregar gota a gota con bureta y con 3 1,5 8,5 - 3,8
agitación ácido acético 1N, hasta que se observe un 4 2,0 8,0 - 4,0
precipitado, es decir, la leche se corte. 5 3,0 7,0 - 4,2
6 4,0 6,0 - 4,5
Centrifugar (2 min a 5000rpm) y guardar el 7 6,0 4,0 - 4,7
sobrenadante para utilizar en procedimiento de 8 8,0 2,0 - 5,1
electroforesis (solución A). Lavar el precipitado con 9 6,0 - 4,0 5,5
20mL de etanol. 10 8,0 - 2,0 6,1
Centrifugar nuevamente (2 min a 5000rpm) y Tabla 1: Volúmenes a utilizar de cada uno de los
guardar nuevamente el sobrenadante para reactivos para determinación del pI
procedimiento de electroforesis (solución B).
Medir los pH de los vasos, los cuales debían cubrir
A continuación adicionar 10mL de éter etílico, un rango aproximado entre 3,0 y 6,5. Anotar los
centrifugar (2 min a 5000rpm). Desechar valores, que deben ser semejantes a los expresados
sobrenadante. anteriormente.

Añadir 1mL de la solución de caseína a cada vaso.
(Para esto usted gastara 10ml de la solución de
caseína).
Agitar suavemente y esperar aproximadamente 3
minutos, luego medir la absorbancia de cada
muestra a 640nm con cubetas de colorimetría de
1cm de paso óptico. Anotar los resultados a fin de
representar la absorbancia frente al pH y determinar
el pI aproximado de la caseína.
SESION 2 Cuantificación de proteínas de la
leche
Preparar las siguientes reacciones en 10 tubos de
ensayo:
Agua (ml)
pH más básico (8.3) de manera que ofrezca mayor
resistencia en la corrida a los polipeptidos.
El gel de apilamiento posee baja concentración de
acrilamida (4%) en tampón ligeramente ácido
(Tris/HCl 1M pH 6.8), de forma que ofrezca poca
resistencia a la mezcla de proteínas sometidas a
electroforesis por tanto lo atraviesan con relativa
rapidez.
Una vez preparado y polimerizado el gel de corrida,
se prepara, en la parte superior de este el gel de
apilamiento. Bajo la acción del campo eléctrico, la
mezcla proteica, colocada sobre el gel de
apilamiento, comienza a migrar hacia el polo
positivo.
Cuando las proteínas atraviesan el gel de
apilamiento, se encuentran con la resistencia

Albumina

Muestra

ejercida por el gel de corrida de manera que

Biuret
Leche
Tubo

(ml)

(ml)

(ml)

(ml)

aquellas proteínas retardadas puedan alcanzar al

resto y todas inicien la separación desde el mismo
punto, mejorando así la calidad de la corrida. El gel
B 1,8 - - - 1,2 de apilamiento se prepara siempre a una
1 1,6 0,2 - - 1,2 concentración de acrilamida 4%, mientras que el gel
2 1,4 0,4 - - 1,2 de separación o gel de corrida se prepara según el
3 1,2 0,6 - - 1,2 rango óptimo de resolución:
4 1,0 0,8 - - 1,2
5 0,8 1,0 - - 1,2 Gel de corrida
Leche 1,79 - 0,01 - 1,2 Ensamblar, según instrucciones, el cassette que
Sln A - - - 1,8 1,2 consta de soportes, vidrios y separadores. Preparar
Sln B - - - 1,8 1,2 el gel de corrida. El volumen del gel de corrida
Sln C - - - 1,8 1,2 deberá calcularse dependiendo del grosor del gel.
Tabla 2: Volúmenes a utilizar de cada una de las Por lo general se preparan 10ml de acrilamida 10%
soluciones en la cuantificación de proteínas así:

Agitar suavemente y esperar 15min a que se

desarrolle el color en la oscuridad y medir la
absorbancia de cada tubo a 595nm. Solución Volumen
Agua destilada 3,4mL
Electroforesis de las proteínas de la leche Acrilamida-bisacrilamida 30% 3.4mL
Geles de corrida y apilamiento Tris/HCl 1.5 M pH 8.8 2.5mL
La técnica de separación comúnmente utilizada se SDS 10% 100µL
denomina electroforesis discontinua. En esta se Persulfato de amonio 10% 150µL
preparan 2 geles, el de corrida, donde se separan las TEMED 10µL
proteína y el de apilamiento o concentrado, que Tabla 3: Volúmenes a utilizar de los reactivos
como su nombre lo indica, concentra la mezcla. para la preparación del gel de corrida

El gel de corrida que separará las muestras debe Verter cuidadosamente la solución de acrilamida
tener mayor concentración de Acrilamida (10%) y con una pipeta Pasteur en el contenedor
representado por 2 vidrios sujetos al cassette y
distanciados por unos separadores. Dejar
aproximadamente 1,5cm de distancia entre la
solución de acrilamida y el vidrio frontal.
Luego de añadido el gel de corrida y previo a la
polimerización, añadir suavemente agua destilada
para evitar que el borde del gel polimerice de
manera irregular. Esperar unos 15min para una
polimerización total del gel.
Gel de apilamiento
Luego de polimerizado el gel de corrida, descargar
el agua de la superficie del mismo y preparar 4ml
del gel de apilamiento (4%) según se muestra a
continuación:
Solución Volumen
Agua destilada 6,1 mL
Acrilamida-bisacrilamida 30% 1,3mL
Tris/HCl 1M pH 6.8 2,5 mL
SDS 10% 100µL
Persulfato de amonio 10% 50µL
TEMED 10µL
Tabla 4: Volúmenes a utilizar de los reactivos
para la preparación del gel de apilamiento
Verter suavemente el contenido del gel de
apilamiento sobre el gel de corrida polimerizado y
colocar el peine cuidadosamente para que no se
formen burbujas. Esperar unos 10min hasta que
polimerice la acrilamida.
Colocación de las muestras
Cuando el gel de apilamiento haya polimerizado,
colocar el cassette en el tanque de electroforesis con
aproximadamente 500mL del tapón de corrida en el
cual se encuentran los electrodos sumergidos.
Quitar cuidadosamente el peine para que quedaran
libres los pocillos del gel. Se colocaron
cuidadosamente las muestras con una micropipeta.
Muestras:
 Leche 2µL
Buffer sample o de muestra 18µL (Solución
con Azul de Coomassie)
 Solución A 10µL
Buffer sample 10µL
 Solución B 10µL
Colorín 10µL
 Solución C 10µL
Colorín 10µL
 Estándar peso molecular 5 µL
Someterlas a calentamiento (100°C) por 5 minutos e
inmediatamente sacarlas a hielo, luego sembrar
20µL de las muestra en los pocillos de los geles de
la electroforesis. Incluir un estándar de peso
molecular en uno de los pocillos (5µL).
Someter las muestras a electroforesis aplicando una
corriente de 30 mA y observar la corrida por 40
minutos.
Finalizada la corrida extraer los vidrios del cassette
cuidadosamente y separarlos de manera tal que el
gel quedara posado sobre uno de los vidrios.
Sumergir el gel en una solución colorante (1g de
azul de Coomassie, 459ml de metanol, 450ml de
agua destilada y 100ml de ácido acético glacial) por
3 horas. Transcurrido el tiempo, sumergir el gel en
una solución decolorante (100ml metanol, 100ml de
ácido acético glacial, 800ml de agua destilada) o en
agua caliente por 5 minutos para eliminar las
asociaciones inespecíficas del gel al colorante.
Observar las bandas proteicas y medir la distancia
recorrida por cada banda para determinar su PM y
definir que posible banda corresponde a que posible
proteína.
PARA INCLUIR EN EL INFORME
1. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia
para la determinación del punto isoeléctrico de
la caseína?
2. ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima
en el pI?
3. ¿Cuál es el peso aproximado de las proteínas de
la caseína?
4. ¿Cuál es la concentración de la solución de
caseína?
5. Que es el lactosuero? Que proteínas contiene?
6. Que diferencias hay entre los resultados y
análisis de proteínas utilizando el método de
espectrofotometría o electroforesis?
BIBLIOGRAFÍA
Bollag D.M., Edelstein S.J., (1.994) “Protein
methods”. WileyLiss Publications. USA. 229 pp
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Bioquímicas”. Editorial Reverté. España. 442p
Janovick, S. etal SDS-PAGE Analysis of Soluble
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Exposed to Different Heat Treatments Sensors
2007, 7, 371-383
Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual
de Laboratorio. Limusa Wiley, México
Parra R.A. 2009 Lactosuero: Importancia en la
industria de alimentos. Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín
62(1): 4967-4982.
Wenk, M. R., & Fernandis, A. Z. (2007). Manual
For Biochemistry Protocols, A. Singapore: World
Scientific. eBook Academic Collection
(EBSCOhost)
ANEXO
1. Tris/HCl 1,5M pH 8.8, 100 ml:
Pesar 18,15 g de Tris, disolver el Tris en 50ml de
agua destilada, añadir gota a gota HCl concentrado
hasta que el pH baje a 8.8, completar con agua
destilada hasta el volumen final (100ml)
2. Tris/HCl 1 M pH 6.8, 100ml:
Pesar 12,1 g de Tris, disolver el Tris en 50ml de
agua destilada, añadir gota a gota HCl concentrado
hasta que el pH baje a 6.8, completar con agua
destilada hasta el volumen final (100ml)
3. SDS 10% (p/v), 100ml:
Pesar 10 g de SDS, añadir agua destilada hasta
completar el volumen de 100ml, información de
seguridad: El SDS es un polvo fino neurotóxico, por
lo tanto se debe usar máscara, guantes y lentes de
protección para su manipulación.
4. Glicerol 50% (v/v), 100 ml:
Tomar un volumen de 50ml de glicerol al 100%,
añadir 50ml de agua destilada. Esta solución se usa
para preparar el buffer sample o de muestra..
5. Azul de Bromofenol 1% (p/v), 10ml:
Pesar 100mg de azul de bromofenol, completar con
agua destilada hasta 10ml y mezclar hasta disolver,
filtrar la solución en papel Whatman No 1 (o
cualquier papel de filtro) para eliminar el colorante
no disuelto. Esta solución se usa para preparar el
buffer sample o de muestra..
6. Acrilamida 30% (100ml):
La solución de acrilamida al 30% (p/v) es una
mezcla de acrilamida (29,2g) y Bisacrilamida
(0,8g), pesar ambos reactivos y añadir agua
destilada hasta 100ml, filtrar en papel de filtro
Whatman No.1
Información de seguridad: La acrilamida en polvo y
en solución es neurotóxica, por lo tanto se debe usar
máscara, guantes y lentes de protección para su
manipulación.
7. Persulfato de amonio al 10% (p/v), 5 ml:
Pesar 0,5g de persulfato de amonio, disolver en 5ml
de agua destilada
8. Solución Tampón de corrida, 1 L:
Pesar 3 g de Tris (25mM), pesar 14,4g de glicina
(192mM), pesar 1g de SDS (0,1%), añadir agua
destilada hasta completar 1 litro
NOTA: El pH debería ser de aproximadamente 8,3.
Se puede preparar una solución 10 veces
concentrada y diluir el volumen necesario en el
momento de la corrida electroforética. Esta solución
puede almacenarse indefinidamente a Temperatura
ambiente.
9. Tampón muestra 5X, 10 ml:
0,6ml de Tris/HCl 1M pH 6,8 (solución 2) 60mM ,
5ml de Glicerol 50% (solución 4) 25%, 2ml de SDS
10% (solución 3) 2%, 0.5ml de 2 mercaptoetanol
14.4mM, 1ml de azul de bromofenol (solución 5)
0,1% 0.9ml de agua destilada
NOTA:
Las soluciones 1, 2 y 6 son estables por meses a
4°C. Las soluciones 7 y 9 deben ser almacenadas a
–20°C. El resto a temperatura ambiente.