FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS UNMSM – PROTEÓMICA 2019-II

INFORME N°2

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE Chenopodium pallidicaule

PROTEIN EXTRACTION AND PURIFICATION FROM Chenopodium pallidicaule

CÁRDENAS, Luis; JUSTINO, Sandra; MÉDICO, Aldhair; TARAZONA, Yordi; VELASQUEZ, Anny
E-mail: luis.cardenas14@unmsm.edu.pe; aldhairmedico@gmail.com; anny.velasquez@unmsm.edu.pe

RESUMEN

Para poder realizar una correcta comparación fenotípica entre dos o más individuos que varían su expresión
proteica en respuesta a factores ambientales diversos se emplea el análisis de expresión, y una de las más
directas y actuales es en cuanto al proteoma completo. Mediante técnicas de extracción, cuantificación y
precipitación de proteínas totales, podemos ver la variación de expresión de la Cañihua Chenopodium
pallidicaule ante distintos tratamientos como puede ser el nivel de estrés salino. Después de extraer las
proteínas totales se empleó el método de Bradford modificado para obtener la concentración de proteína, que
fue de 40,45ug/ml, lo que arrojó un rendimiento de 0,2 mg de proteínas por gramo de tejido. Finalmente se
realizó la precipitación de proteínas usando el método de Wessel & Fluegge y se reservó el pellet proteico para
futuras investigaciones y análisis.

Palabras clave: Chenopodium pallidicaule, proteína, extracción, cuantificación, precipitación

ABSTRACT

To be able to make a correct phenotypic comparison between two or more individuals that show variation in
their protein expression in response to various environmental factors, expression analysis is used, and one of
the most direct and current is in terms of complete proteome. Through techniques of extraction, quantification
and extraction of total proteins, we can see the variation of expression of “Cañihua” Chenopodium pallidicaule
in different treatments such as the level of saline stress. After extracting the total proteins, the modified
Bradford method was used to obtain the protein concentration, which was 40.45ug/ml, which yielded was 0.2
mg of proteins per gram of tissue. Finally, protein precipitation n was performed using the Wessel & Fluegge
method and the protein pellet was reserved for future research and analysis.

Keywords: Chenopodium pallidicaule, protein, extraction, quantification, extraction

1. INTRODUCCIÓN
Los métodos clásicos de comparación fenotípica de
dos individuos están basados en el análisis de
caracteres morfológicos y moleculares. Estos
últimos principalmente se basan en el análisis de
polimorfismos de genes específicos relacionados
con el fenotipo. Este enfoque, sin embargo, limita
y excluye la posibilidad de conocer nuevos genes
relacionados con dicho fenotipo, que rara vez
presenta un mecanismo de expresión monogénico.
Por ello, para determinar otros agentes genéticos
involucrados en la expresión de dicho carácter se
suele requerir de grandes esfuerzos para
reconstruir las rutas metabólicas y el pedigrí
familiar, así como pruebas subsiguientes de
secuenciación de genes para demostrar el vínculo
entre alelo y función enzimática o fenotipo.
Una técnica de análisis de expresión más directa es
la comparación de proteomas completos. Esto se
basa en la capacidad natural de los seres vivos de
variar su expresión proteica en respuesta a
determinado factor ambiental. Por lo que resulta
necesario, primero, aplicar técnicas de extracción,
purificación y cuantificación de proteínas [1,2].
La extracción de proteínas es necesaria debido a
que no interesan los demás componentes de la
célula. Para ello se aplican diversos reactivos y
técnicas para degradar la membrana plasmática y
las membranas de organelas. Los métodos físicos
más comunes son aquellos basados en la
trituración mecánica de tejidos o en la aplicación
de ondas de sonido de baja frecuencia (conocido
como sonicación) mientras que los métodos

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químicos más comunes son aquellos donde se
emplean detergentes y sales o enzimas específicas
de ser necesario [3,4].
La purificación de proteínas consiste en aislar las
proteínas de interés del resto. Las principales
técnicas de este tipo están basadas en la
precipitación con sales por cambios en la
solubilidad, la cromatografía y sus diversas
variantes, así como la afinidad de la proteína por
determinado anticuerpo. Usualmente es seguido
por un paso de concentración [5].
La cuantificación de proteínas es importante para
conocer la concentración de proteínas por
volumen de muestra o por cantidad de tejido.
Actualmente se emplean técnicas colorimétricas
como la de Biuret, Lowry, Bradford o ácido
bicinconiníco basadas en la capacidad de absorción
de luz de longitud de onda específica por parte de
residuos aromáticos o por la formación de
complejos entre las aminas y carboxilos de la
cadena peptídica y una molécula del colorante.
Todas estas técnicas requieren del uso de un
espectrofotómetro [6,7].
Esta variación en la expresión puede ser estudiada
a partir de dos muestras donde una fue sometida a
un agente estresante frente a un grupo control.
Técnicas como la electroforesis de proteínas en gel
de poliacrilamida (SDS-PAGE) o la electroforesis
bidimensional en gel (PAGE-2D) nos ayudan a
obtener patrones de expresión específicos basados
en la separación por tamaño y punto isoeléctrico
de las proteínas [8]. El gel resultante puede ser
analizado mediante tinción con Azul de Coomasie
o mediante una hibridación Western-Blot contra
un anticuerpo específico. La comparación de
ambos geles mostrará la presencia de puntos
específicos o spots de proteínas de determinado
peso y punto isoeléctrico que muestren diferencia
considerable entre ambos tratamientos [8].
En trabajos anteriores se llegó a caracterizar la
concentración de proteína ‘cañihua’ Chenopodium
pallidicaule [9,10]. Aunque ha habido trabajos
anteriores sobre el proteoma completo de una
especie cercana ‘quinua’ Chenopodium quinoa
[11]. En este trabajo, se analizó el efecto de un
tratamiento salino sobre la planta de ‘cañihua’.
2. MÉTODOS
2.1. Cultivo de muestra
Se sembró semillas cañihua Chenopodium
pallidicaule variedad Cupy, proporcionadas por el
Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) y se
cultivó durante 2 meses y medio en solución
hidropónica bajo condiciones de invernadero en
condiciones controladas (25°C y 54% de humedad
relativa). Para el análisis se empleó un grupo
control regado con agua y un grupo experimental
con NaCl 0.5M.
2.2. Extracción de proteínas
Se extrajo unos fragmentos de tejido de 2g de
hojas con tijeras y bisturí. Se pesó el material en
una balanza electrónica. Se colocó el material en
un mortero y se agregó 7.5 ml de buffer de
extracción (Tris-HCl 100 mM pH 6.8, SDS 4%, DTT
200mM, cóctel de inhibidores de proteasas P9599-
Sigma Aldrich [12]). Se trituró mecánicamente la
muestra y se centrifugó la solución a 5000 rpm por
10 minutos. Se recuperó el sobrenadante y se
conservó a -20°C. El flujo de trabajo de este
proceso se presenta en la Figura 1.
2.3. Cuantificación de proteínas
Se mezcló 120 ul de muestra de cañihua con 300 ul
de reactivo de Bradford modificado por la empresa
Bio-Rad. Se homogeneizó la mezcla y se incubó a
temperatura ambiente por 5 minutos. Se midió la
absorbancia de las muestras al ser expuestas a 595
nm de longitud de onda y se calculó la
concentración de proteínas por volumen de
muestra y por gramos de tejido empleando como
estándar 10 ug/ml por cada 0.500 de Abs. El flujo
de trabajo de este proceso se presenta en la Figura
2.
2.4. Precipitación de proteínas
Usando el método de Wesse & Fluegge, se mezcló
500 ul de muestra con 500 ul de metanol frío y 125
ul de cloroformo y se homogeneizó. Luego se
centrifugó la mezcla a 14000 rpm a 4°C por 5
minutos. Se removió el sobrenadante y se agregó
500 ul de metanol. Se centrifugó la mezcla
nuevamente a 14000 rpm a 4°C por 5 minutos y se
removió el sobrenadante. Finalmente se dejó secar
a 37°C. El flujo de trabajo de este proceso se
presenta en la Figura 3.
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3. RESULTADOS
3.1. Extracción de proteínas
A partir de los 2g de tejido (germinado de Cañihua,
extrajimos las proteínas totales como se muestran
en la Figura 4. A partir de esta extracción se pudo
realizar la cuantificación de proteínas.
3.2. Cuantificación de proteínas
La lectura de la absorbancia a 595nm realizada a
partir del resultado de la extracción, donde la
lectura del blanco fue restada automáticamente,
fue de 2,121 y 1,924, con un promedio de 2,0225.
En base a la curva estándar determinada con
seroalbúmina bovina, se logró obtener la
concentración de proteína, según el método de
Bradford modificado por la empresa BioRad, que
fue de 40,45ug/ml de proteína total. Para poder
hallar el rendimiento, debemos tener presente el
volumen del tubo inicial de mezcla, que es de 10ml
y la cantidad de tejido que se usó, que fue de 2g.
Finalmente el rendimiento que nos ofrece el
método de extracción usado es de 0,203mg de
proteína por gramo de tejido. Los cálculos
empleados se resumen en los siguientes pasos:
a) Promedio de lecturas
2,121 + 1,924
= 2,0225
2 modificado de Wesse-Fluegge para precipitar
b) Concentración de proteína (C)
Estándar: 10ug/ml  0,500
10𝑢𝑔
2,0225 𝑥
𝐶= 𝑚𝑙 = 40,45𝑢𝑔/𝑚𝑙
0,500
c) Rendimiento de la extracción de proteína (R)
* Volumen del tubo inicial  10ml
*Cantidad de proteína total en 10ml de volumen
inicial
40,45𝑢𝑔
𝑥10𝑚𝑙 = 404,5𝑢𝑔  404,5ug
𝑚𝑙
Cantidad de tejido usado  2g
404,5𝑢𝑔 0,4045𝑚𝑔 0,405𝑚𝑔
𝑅= = =
2𝑔 2𝑔 2𝑔
= 0,2025𝑚𝑔/𝑔 = 0,203𝑚𝑔/𝑔
3.3. Precipitación de proteínas
Del producto obtenido de la extracción de
proteínas, se hizo un spin y se hizo precipitar las
proteínas totales mediante el método
metanol/cloroformo, donde el cloroformo se
empleó para arrastrar el pigmento verdoso al
fondo del tubo por densidad (Figura 5A-B), y en la
fase acuosa sobrenadante se hizo precipitar la
proteína con metanol, obtuvimos el ultimo pellet
(Figura 5C) que dejamos secar a 37°C y de esa
manera tenemos el material necesario para una
futura electroforesis y trabajos posteriores.
4. DISCUSIÓN
Una de las mayores dificultades que se tienen al
trabajar con plantas es la composición de sus
células debido a que están compuestas por una
pared celular de polisacáridos y otros compuestos.
Es por ello que la disrupción del tejido foliar se
realiza mediante la trituración con un mortero y
solución buffer de extracción para de esta forma
minimizar la proteólisis y degradación proteica
[13]. Se ha comprobado que mientras mayor sea la
pulverización del tejido se consigue mayor
rendimiento de extracción proteica [14].
En la práctica realizada se empleó el método
proteínas, el cual permite la recuperación de
proteínas tanto solubles como hidrofóbicas. La
ventaja que supone este método de precipitación
es que no se ve afectado por la interferencia de
detergentes, sales, β-mercaptoetanol o
fosfolípidos que puedan ser encontrados en el mix
de proteínas posterior a la extracción [15].
Debido a la alta concentración de proteínas
encontradas en las muestras se empleó una mayor
cantidad de muestra siendo la misma proporción
que el metanol. Debe resaltarse que la proporción
cloroformo-metanol (1:4) se mantuvo y no se
adicionó agua para la separación posterior a la
centrifugación.
El número de revoluciones por minuto (rpm) y el
tiempo necesarios para la precipitación es
proporcional a la cantidad de muestra que se use.
Los autores E. Roitinger, M.Hofer y colaboradores
prolongaron el tiempo de centrifugación a 30 min
del lisado de Arabidopsis thaliana debido a que
emplearon mayor cantidad de muestra en
comparación con la del protocolo, de igual forma,
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en la práctica realizada se aumentó el número de 2. Selber, K., Collén, A., Hyytiä, T., Penttilä,
rpm por el mismo motivo, para así conseguir una M., Tjerneld, F., & Kula, M. R. (2001).
óptima separación entre el sobrenadante y las Parameters influencing protein extraction
proteínas (precipitado). [16] for whole broths in detergent based
aqueous two-phase systems.
Por otro lado, para determinar el mejor método de Bioseparation, 10(4-5), 229-236.
precipitación se debe de tener en cuenta la fuente 3. Wang, W., Scali, M., Vignani, R.,
de la muestra, si se trabajará con hojas, raíces o Spadafora, A., Sensi, E., Mazzuca, S., &
semillas, ya que de realizar un lisado completo Cresti, M. (2003). Protein extraction for
celular se obtendrán proteínas de diferente two‐dimensional electrophoresis from
naturaleza, solubles o hidrofóbicas. Para este olive leaf, a plant tissue containing high
último caso, se recomienda una proporción de levels of interfering compounds.
cloroformo/metanol de 1:1 debido a que facilita la Electrophoresis, 24(14), 2369-2375.
eliminación de fosfolípidos que se encuentran 4. Wang, W., Tai, F., & Chen, S. (2008).
junto a las proteínas con alto contenido de Optimizing protein extraction from plant
aminoácidos hidrofóbicos, característicos de tissues for enhanced proteomics analysis.
proteína de membrana. Vertommen y Journal of separation science, 31(11),
colaboradores evaluaron la precipitación de 2032-2039.
proteínas con cloroformo-metanol a distintas
5. Jervis, L., & Pierpoint, W. S. (1989).
proporciones en plantas modelo como A. thaliana
Purification technologies for plant
y no modelo como Musa spp. Se evidencia la
proteins. Journal of Biotechnology, 11(2-
utilidad de esta metodología para la precipitación 3), 161-198.
de proteínas de membrana en aquellas especies en
las que no se conoce de antemano la composición 6. Norrgran, J., Williams, T. L., Woolfitt, A. R.,
específica o características de las proteínas Solano, M. I., Pirkle, J. L., & Barr, J. R.
encontradas en la lisis celular [17], lo cual es de (2009). Optimization of digestion
suma importancia en el presente estudio realizado parameters for protein quantification.
Analytical biochemistry, 393(1), 48-55.
con la Cañihua, planta de alto contenido
nutricional que recientemente se vienen 7. Goldring, J. D. (2012). Protein
explorando. quantification methods to determine
protein concentration prior to
La precipitación con ácido tricloroacético (TCA) es electrophoresis. In Protein
otro de los métodos más empleados debido a la Electrophoresis (pp. 29-35). Humana
facilidad de aplicación; sin embargo, se tiende a Press, Totowa, NJ.
perder parte de las proteínas en el lavado con
8. Kumar, B., Sharma, D., Sharma, P., Katoch,
acetona que se realiza para eliminar el TCA, V. M., Venkatesan, K., & Bisht, D. (2013).
además, que esta método de precipitación tiene Proteomic analysis of Mycobacterium
mayor rendimiento para la extracción de proteínas tuberculosis isolates resistant to
solubles y no de membrana como sí lo es el método kanamycin and amikacin. Journal of
de precipitación con cloroformo-metanol [18] proteomics, 94, 68-77.

5. CONCLUSIONES 9. Repo-Carrasco, R., Espinoza, C., &

Jacobsen, S. E. (2003). Nutritional value
and use of the Andean crops quinoa
(Chenopodium quinoa) and kañiwa
(Chenopodium pallidicaule). Food reviews
international, 19(1-2), 179-189.
6. BIBLIOGRAFÍA 10. Villa, D. Y. G., Russo, L., Kerbab, K., Landi,
M., & Rastrelli, L. (2014). Chemical and
1. Lugg, J. W. H. (1939). The nutritional characterization of
representativeness of extracted samples Chenopodium pallidicaule (cañ ihua) and
and the efficiency of extraction of protein Chenopodium quinoa (quinoa) seeds.
from the fresh leaves of plants; and some Emirates Journal of Food and Agriculture,
partial analyses of the whole proteins of 609-615.
leaves. Biochemical Journal, 33(1), 110.

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11. Burrieza, H. P., Rizzo, A. J., Vale, E. M.,
Silveira, V., & Maldonado, S. (2019).
Shotgun proteomic analysis of quinoa
seeds reveals novel lysine-rich seed
storage globulins. Food chemistry, 293,
299-306.
12. SIGMA-ALDRICH. (2019). PROTEASE
INHIBITOR COCKTAIL. [online] Available
at:
https://www.sigmaaldrich.com/content/
dam/sigma-
aldrich/docs/Sigma/Datasheet/5/p9599d
at.pdf [Accessed 19 Oct. 2019].
13. Wang, W., Scali, M., Vignani, R.,
Spadafora, A., Sensi, E., Mazzuca, S.,
Cresti, M., (2003). Protein extraction for
two-dimensional electrophoresis from
olive leaf, a plant tissue containing high
levels of interfering compounds.
Electrophoresis, 24, 2369 – 2375.
14. Malik, N. A., Bradford, J. M., J. A Simple
Protein Extraction Method For Proteomic
Studies On Olive Leaves. (2005)Food
Agric. Environ., 3, 246 – 248
7. FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Flujo de trabajo para la extracción de proteínas
15. Wessel, D., & Flügge, U. I. (1984). A
method for the quantitative recovery of
protein in dilute solution in the presence
of detergents and lipids. Analytical
Biochemistry, 138(1), 141–143.
doi:10.1016/0003-2697(84)90782-6
16. Roitinger, E., Hofer, M., Köcher, T.,
Pichler, P., Novatchkova, M., Yang, J., . . .
Mechtler, K. (5 de January de 2015).
Quantitative Phosphoproteomics of the
ATM and ATR dependent DNA damage
response in Arabidopsis thaliana.
Molecular & Cellular Proteomics.
17. Vertommen, A., Panis, B., Swennen, R., &
Carpentier, S. (April de 2010). Evaluation
of chloroform/methanol extraction to
facilitate the study of membrane proteins
of non-model plants. Planta, 231(5),
1113–1125.
18. Jiang, L., He, L., & Fountoulakis, M. (2004).
Comparison of protein precipitation
methods for sample preparation. Journal
of Chromatography A, 1023, 317–320.
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Figura 2. Flujo de trabajo para la cuantificación de proteínas mediante el método de Bradford (BIO-RAD)

Figura 3. Flujo de trabajo para la precipitación de proteínas mediante el método de Wessel y Fluegge

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A B

Figura 4. Resultados obtenidos del proceso de extracción de proteínas. A representa la mezcla del tejido
disgregado con el buffer de extracción. B indica el pellet obtenido conteniendo las proteínas totales.

A B C

Figura 5. Resultados obtenidos del proceso de precipitación de proteínas mediante el método de Wessel y
Fluegge. A y B representan la parte del proceso donde se empleó cloroformo para eliminar el pigmento
verdoso. C indica el pellet obtenido al final del proceso.