Manual de laboratorio de Biotecnología

NORMAS DE SEGURIDAD PARA LA UTILIZACIÓN DEL ESPACIO EN

PRÁCTICAS DE LABORATORIO

*Use bata de laboratorio para cada práctica y no utilice calzado destapado

*Use guantes, tapaboca, lentes de protección, y máscara con filtros, cuando se requieran.

*No pipetee con la boca, use un pipeteador

*No se lleve los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respire directamente sobre ningún
reactivo pues sus vapores pueden ser tóxicos

*No ingiera alimentos o bebidas en el laboratorio

*No use durante las prácticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o collares

*No deposite alimentos en las neveras, ni consuma el hielo que allí se produce

*No se admiten en el laboratorio personas que no estén matriculadas en el

respectivo curso, por favor no reciba visitas

*No ubique bolsos, tulas, maletines o paquetes, en los lugares de trabajo

UTILIZACIÓN DE REACTIVOS

*Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona
que lo preparó y la fecha de preparación

*No arroje por los sumideros ácidos, bases o algún otro reactivo, por favor
depositelos en los recipientes de desecho

*Evite derrames de sustancias en las mesas de trabajo, así se previene que algún
compañero se queme la piel o se deteriore la ropa.

*No arroje al piso ningún reactivo

*No arroje al piso papeles u otros elementos. Por favor utilice el recipiente para la
basura.
 Práctica N. 1:
CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES

INTRODUCCIÓN

El cultivo in vitro, micropropagación o propagación vegetal in vitro, es el cultivo de

células, tejidos u órganos de plantas en un medio aséptico que le aporta los
nutrientes necesarios para su desarrollo. En este medio y con algunas condiciones
físicas y químicas apropiadas, las células tienen la habilidad de desarrollarse,
desdiferenciarse, producir metabolitos, multiplicarse y hasta regenerar un
organismo entero" (Dodds & Roberts, 1985), en cuyo caso, la nueva planta será
genéticamente idéntica a la planta madre, y su desarrollo se dará en un periodo de
tiempo mucho mas corto. Así pues, para lograr cualquiera de estos propósitos se
debe iniciar con la utilización de pequeñas muestras de tejidos vegetales
(explante) que tras una adecuada desinfección superficial, son transferidos
asépticamente a medios nutritivos líquidos o semisólidos y almacenados bajo
condiciones ideales de temperatura y fotoperíodicidad que garanticen un rápido
desarrollo.

Los medios de cultivo, líquidos o semisólidos, difieren básicamente por la

presencia de un gelificante, contienen carbohidratos como fuente de carbono y
energía (generalmente sacarosa), sumado a minerales, vitaminas, aminoácidos,
suplementos orgánicos y en muchos casos fitohormonas o compuestos sintéticos
conocidos como reguladores de crecimiento, son mensajeros químicos vegetales
secretados en un determinado tejido y que actúan en el mismo tejido, o en otro
distinto de la planta y por ello, se les considera biocatalizadores junto con los
enzimas y las vitaminas. Las hormonas vegetales pertenecen a cinco grupos cada
uno de los cuales exhibe propiedades fuertes de regulación del crecimiento en
plantas y pueden ser activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta,
estos grupos son: Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido Abscísico y Etileno.

OBJETIVO GENERAL:

Esta práctica pretende que el estudiante conozca e implemente algunas técnicas

básicas del cultivo de tejidos vegetales.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Inducir desdiferenciación tisular en explantos provenientes de diferentes tejidos

vegetales.
Acelerar el crecimiento de plantas utilizando medios nutritivos suplementado con
fitohormonas.

Conocer la utilidad y el manejo del equipo básico, instrumentos y herramientas de

un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.

REACTIVOS Y MATERIALES A EMPLEAR:

Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 6-benzilaminopurina (BA), hipoclorito de

sodio, alcohol industrial, etanol, agar, sacarosa, medios de cultivo, bisturí, pinzas,
mecheros, frascos, placas de vidrio, gasa, algodón, papel de aluminio, papel craft,
vinilpel, cinta de enmascarar, probetas, erlenmeyer, pipetas, balanza, pH-metro,
agitador magnético, cámara de flujo laminar, guantes, tapabocas, gorro, material
vegetal (fríjol verde, zanahoria, plantas aromáticas)

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de los medios de cultivo:

Para esta práctica se deben preparar y esterilizar bajo condiciones de calor
húmedo (15 psi/ 121 ºC/ 20 minutos) los siguientes medios de cultivo:

Inducción de callos: preparar 60 ml de MS (ver tabla 1)(pH: 5.7-5.8), suplementado

con sacarosa (3%), vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento
(medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones
hormonales descritas por el profesor. Se sugiere relación auxina:citoquinina (1:1 o
2:1)
Crecimiento: preparar 60 ml de MS (ver tabla 1) )(pH: 5.7-5.8), enriquecido con
sacarosa (3%), vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio
control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones hormonales
descritas por el profesor. Se sugiere relación auxina:citoquinina (1:1 o 1:2)

2. Proceso de desinfección del material vegetal

Una vez lavado el material vegetal con agua y jabón, se sumerge inicialmente en
etanol (70%, 2 min) y posteriormente en 50 ml hipoclorito de sodio (2%, 15 min.) al
que previamente se le han agregado algunas gotas de Tween 80. Pasado este
período de tiempo, de elimina el desinfectante, se hacen tres lavados consecutivos
(5 min. cada uno), se transfiere en condiciones estériles a los medios de cultivo y
se almacena bajo condiciones controladas de temperatura y fotoperiodicidad.

SEGUIMIENTO A REALIZAR EN LA PRÁCTICA

1. Revisar los cultivos de tejidos vegetales una vez por semana y anotar los
avances que estos presenten, incluyendo aparición de callos, contaminaciones,
organogénesis y aumento en longitud o tamaño.

2. Realizar subcultivos rutinarios cada cuatro semanas y continuar la práctica

según el desarrollo de cada uno de los grupos de trabajo

Tabla 1. COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN DEL MEDIO MURASHIGE Y SKOOG

(Medio MS) (Murashige–Skoog, 1962)
Concentración de la Volumen de la
Constituyente solución madre solución madre
(g/L) por litro de medio
Macros
NH4NO3 16,5
KNO3 19
CaCl2.2H2O 4,4 100 ml
MgSO4.7H2O 3,7
KH2PO4 1,7
Micros
MnSO4.H2O 1,69
ZnSO4.7H2O 0,86
H3BO3 0,62
KI 0.083
Na2MoO4.2H20 0.025
CuSO4.5H2O 10 ml de sol. 25 10 ml
mg/100ml
CoCl2.6H2O 10 ml de sol. 25
mg/100ml
Fuente de hierro
FeSO4.7H2O 0.00556
10 ml
Na2EDTA.2H2O 0.00746
Vitaminas
Inositol 10
Nicotínico 0,05
HCl-Piridoxina 0,05
10 ml
Glicina 0,2
HCl-Tiamina 0,01
Adicionar al medio 3% de sacarosa y 0.7% de agar.

GLOSARIO
Auxinas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que producen
elongación celular, y en algunos casos división celular; frecuentemente inducen la
aparición de raíces adventicias e inhiben el desarrollo de yemas adventicias (en
los vástagos). Ejemplo el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

Citoquininas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que inducen

la división celular y frecuentemente la formación yemas adventicias (en los
vástagos). En la mayor parte de los casos inhiben el desarrollo de raíces
adventicias. Las citoquininas disminuyen la dominancia apical. Ejemplo: 6-
benzilaminopurina (BA).

Callo: Tejidos no organizados, formados por células diferenciadas y no

diferenciadas, que se dividen de forma activa y que generalmente se originan en
zonas dañadas (por heridas), o en cultivo de tejidos.

BIBLIOGRAFIA

farmacia.udea.edu.co/~fsegura/tejidos.zip

Dodds J.H., Roberts L.W., 1985, Somatic embryogenesis, En: Experiments in

Plant Tissue Cultura, Cambridge University Press, 122-132.

Montoya H. L. M., 1991, Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de

Colombia, Seccional Medellín. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento
de Agronomía.

Murashige T., Skoog F., 1962, A revised médium for rapid growth and bioassays
with tobacco tisuee cultures, Physiol. Plant., 15:473-97

Pierik R.L.M., 1990, Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones Mundi-
Prensa, Madrid.

Práctica No. 2
CULTIVO DE LINFOCITOS Y OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS

INTRODUCCIÓN

El cultivo de células animales permite la realización de diferentes actividades

docentes que tienen importancia en el ámbito de la biotecnología. Los diferentes
tipos celulares animales tienen dos opciones de crecimiento, en suspensión y
adheridas, el estudiante deberá conocer los dos sistemas. ¨Para ello deberá
realizar cultivos a corto plazo máximo una semana y realizar dos experiencias, la
primera la obtención de cromosomas y la segunda la criopreservación.

OBJETIVO GENERAL

Dar al estudiante las bases del cultivo de células en suspensión (linfocitos) y de

células adheridas (línea celular).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtener cromosomas de un cultivo de linfocitos de sangre de diferentes

especies.de mamíferos.

Cultivar células adheridas, para establecer cambios morfológicos durante su

crecimiento.

Criopreservar células conservando las características morfológicas iniciales

MATERIALES

Jeringa de 2,5cc, frasco de cultivo ( Boterito), pipeta de 5ml , pipeta de 1 ml,

incubadora a 37oC, tubos cónicos de centrífuga, centrífuga, pipetas pasteur,
láminas portaobjetos, láminas cubreobjetos, aceite de Inmersión, microscopio de
luz (100X), heparina, medio de cultivo RPMI, suero fetal bovino, extracto de frijol,
solución hipotónica de KCL 0.075M, colchicina, metanol, ácido acético, colorante
de Giemsa

PROCEDIMIENTO

La muestra que será suministrada a los estudiantes, será tomada en forma estéril
de la vena yugular en una jeringa heparinizada (Liquemine, Roche). Estas
muestras han de ser identificadas.

La siembra debe hacerse en condiciones estériles y se sembrarán 10 gotas de

sangre en 5 ml de medio RPMI (Roswell Park memorial Institute) suplementado
con suero fetal bovino al 10% y 100ul de Fitohemaglutinina (50Ugrml). Se lleva el
cultivo a una incubadora de 37oC por 72 horas.

OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS

Se adiciona al cultivo 0,1 ml de Colcemid (5ugr/ml)y se deja en incubacón por 30

minutos, luego se centrifugan 10 minutos a 1800 rpm. Se descarta el
sobrenadante y se adicionan 8 ml de solución hipotónica y se homogeniza bien la
muestra y se incuba 10 minutos a 37oC , posteriormente se adiciona 1 ml de
Carnoy ( Metanol: Acido acético 3.1), se homogeniza y se centrífuga.1800 rpm x
10 minutos. All pellet se le adicionan 10 ml, se homogeniza y se deja por 30
minutos en refrigeración (5oC). Se centriufa por 10 minutos, el pellet se
resuspende en 5 ml de fijador y se vuelve a centrifugar, esta operación se repite
dos veces mas.

Al final el pellet se resuspende en 0,5 ml de Fijador , finalmente se colocan 2 o 3

gotas de fijador sobre la lámina, esta se deja secar.

Las láminas son coloreadas con colorante de Giemsa y se observan al

microscopio las metafases.

Seguimiento:
El cultivo debe revisarse a las 24 horas para evidenciasr signos de contaminación.

Las láminas una vez coloreadas deben revisarse para observar la presencia de
metafases y si es posible tomar fotograficas para analizarlas.

GLOSARIO

Medio de cultivo : Solución de aminoácidos, vitaminas y sales que es capaz de

soportar el desarrollo celular

Colchicina: Inhibidor de la despolimerización de los microtúbulos, necesario para

detener las células en metafase

Fitohemaglutinina: Mitógeno, utilizado para promover la división de los linfocitos en

el cultivo

Cultivo: Procedimiento mediante el cual una suspensión de células son puestas a

crecer en condiciones controladas

Práctica No.3
CULTIVO Y CRIOPRESERVACIÓN DE CELULAS ANIMALES

INTRODUCCIÓN

Dentro del proceso de aprendizaje el estudiante conocerá el comportamiento de

las células que crecen adheridas y sumado a esto realizara un ejercicio de crió
preservación de las mismas.
Las células que crecen dependientes de anclaje son aquellas que necesitan un
soporte sólido para su desarrollo in Vitro, usualmente son las células del cuerpo
que sirven de sostén, fibroblastos, tejido conectivo. Ellas crecen tomando formas
especificas que sirven para su identificación y caracterización.

La crió preservación nació hace aproximadamente 50 anos y puede definirse

como el procedimiento mediante el cual se conservan las células a temperaturas
inferiores 00C , esto se pudo dar gracias a dos desarrollos importantes, el primero
el descubrimiento de los crioprotectores y el desarrollo de sistemas de frió. Los
crioprotectores mas usados son el glicerol y el dimetil sulfoxido son moléculas
pequeñas, hasta 150 kd que entran a la célula desplazando el agua intracelular lo
que impide que a bajas temperaturas se formen cristales de hielo que rompen la
membrana. Posteriormente se realiza la curva de congelación que en ocasiones
es muy rápida, caso fibroblastos o lenta caso espermatozoides.

Se pueden congelar cualquier tipo de células, pero lo más importante es que al

descongelar se encuentre viabilidad y funcionalidad de las mismas, por eso
aunque se hable de congelación es igual o más importante la descongelación,
esta se hace transfiriendo las células a 370C por 5 minutos.

Para que la preservación de las células pueda hacerse por largo tiempo se
utilizan sistemas que producen o generan frió, en el primer caso la nevera de
hasta menos -800C, en el segundo gracias a someter a presión los gases estos se
licuan a temperaturas bajas, en el caso del nitrógeno -1960C y el helio -2100C.

Criopreservar es detener el tiempo, esto debe tenerse en cuenta, especialmente

cuando se congelan células germinales, espermatozoides y/o óvulos, pues no se
puede asegurar que la respuesta de la información genética a los efectos
medioambientales sea la misma que cuando fueron congeladas.

OBJETIVO GENERAL
Conocer el proceso de congelación y descongelación en un modelo de células
dependientes de anclaje.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Conocer los cambios morfológicos que ocurren en los cultivos de células

dependientes de anclaje.

Criopreservar células eucarioticas

Materiales
Células, pipetas de 5 ml, pipetas de 1ml, cajas de petri para cultivo, tubos cónicos
de centrífuga, crioviales, congelador de - 80 oC, microscopio, centrífuga, medio de
cultivo Ham F12, suero fetal bovino, solución de Tripsina, glycerol o Dimetil
sulfóxido, solución Salina Bufferada

Procedimiento

Las células son recuperadas cuando la población alcanza el máximo dentro del
frasco de cultivo, idealmente las céulas se han de cosechar cuando están en su
fase mayor de crecimiento (log phase). Las células se deben mantener a 37 oC,
con un ph entre 7.2 y 7.5, una osmolaridad de 220 mosm, alta humedad , con una
fase gaseosa en equilibrio (C02 con el bicarbonato del medio) y en lo posible
protegido de la luz.

CULTIVO Y CRIOPRESERVACION

A cada grupo se le entregara una suspensión de células, que deberá lavar , contar
(al menos mirar la microscopio cuantas tiene por campo) y determinar su
viabilidad. Ellos sembraran en cajas de petri de 30 mm con medio RPMI
suplementado con suero al 10%, algún grupo puede usar otro medio como Ham´s
F12 o Dulbecco. Allí las dejarán observando los cambios morfológicos hasta la
confluencia, una vez confluentes procederán a soltarlas y a criopreservarlas.

Tripsinización de células adherentes

Evalué la densidad celular de su cultivo (frasco, botella, etc), si tiene confluencia o

usted estima conveniente remover las células pase al paso No 2., remueva el
medio de cultivo (OPCIONAL: Lave una o dos veces con solución salina bufferada
(PBS) su cultivo con el fin de remover las proteínas, adicione 1 ml de Tripsina
0.25 % y déjelo por 10 minutos a 37oC. A los 5 minutos observe si las células se
están soltando. Cuando las células estén totalmente sueltas, adicione 5 ml de
medio sin suero fetal bovino, transfiera la suspensión celular a un tubo de ensayo
y centrifuge a 1800 rpm x 10 minutos.

Descarte el sobrenadante y resuspenda en 5 ml de medio con suero fetal bovino y

dependiendo de sus necesidades, determine la concentración y la viabilidad

Ajuste con medio de cultivo de acuerdo con sus necesidades, si simplemente va a

duplicar un cultivo existente añada 10 ml de medio con suero y siembre de a 5 ml
en una cada frasco

Criopreservación
A 4 ml de suspensión de células agregue 4 ml de suero fetal bovino y 1 ml de
glycerol, homogenize y transfiera a los crioviales. Una los crioviales y envuélvalos
en gasa. Llévelos a -80 oC, y déjelos allí mínimo 72 horas.

Descongelación

Tome un vial y llévelo al baño de maria a 37 oC espere a que el vial se descongele

totalmente, transfiera el contenido del vial a un tubo de centrífuga con medio de 5
ml de medio de cultivo, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de
medio con suero fetal bovino al 20%, siembre las células en las cajas de cultivo y
observe el crecimiento

SEGUIMIENTO

24 horas después de la siembra de debe verificar si hay o no contaminación.

Cada 24 horas se observa el cultivo para ver el crecimiento de las células y la
formación de monocapas
Verificación del crecimiento después de la descongelación.

GLOSARIO

Criopreservación: Procedimiento de almacenamiento celular mediante el cual

estas se conservan vivas a temperaturas inferiores a - 70 grados centígrados

Tripsinización: Procedimiento mediante el cual, se aplica una solución de tripsina a

células adheridas para que estas se suelten.

Vial: Recipiente pequeño, de un volumen no mayor a 2 ml usado para almacenar

células.

Pasaje: Procedimiento mediante el cual, una vez formada la monocapa de células

estas se sueltan y son sembradas en dos o mas nuevos frascos de cultivo.

BIBLIOGRAFÍA

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5. Elsdale, T., Tolbert, W.R. Scientific American. 54, 626-637.1972.
6. Freshney, R.I. Culture of animal cells. A manual of basic technics. Alan, R.
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 7. Góngora, A, Villamil, L.C. Vera, V., Parra, JL., Ramírez, G., López, G.
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esmegma prepucial en un toro reproductor. Revista de Medicina Veterinaria
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18. Pollard, J.: Walker, J. Animal cell culture. In: Methodos In Molecular Biology.
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19. Parra, J.L., Vera, V., Villamil, L.C., Ramírez, G. Seroepidemiología de la
diarrea viral bovina en explotaciones lecheras de la Sabana de Bogotá.
Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLLL. No 1. Pp 29-45.
1994

Práctica No. 4
Producción in vitro de embriones de ratón

INTRODUCCIÓN

Desde hace tiempo el hombre ha querido conocer los secretos más íntimos de su
naturaleza, especialmente en lo relacionado con el desarrollo, esto es, el proceso
mediante el cual los gametos fusionados en el zigoto se convierten en un ser
humano. Para ello ha utilizado diferentes modelos algunos mas cercanos
evolutivamente que otros a si mismo. Se sabe mucho de la biología del desarrollo
en especies como la Drosophila Melanogaster o el Xenopus laevis, estas especies
de genoma relativamente pequeño y corto intervalo generacional no permiten
extrapolar totalmente a los eventos del desarrollo mamífero. El ratón es el modelo
mas parecido al humano, por su versatilidad se ha convertido en la especie de
elección para el estudio de la biología de los embriones y la genética del desarrollo

Se conoce desde hace más de 30 años que se pueden manipular gametos y

embriones, gracias a ello y a los diferentes avances conceptuales y técnicos hoy
en día esa manipulación puede ser usada en el tratamiento de la infertilidad
humana. La falla reproductiva, entendida como la inhabilidad para concebir, gestar
y parir un individuo se puede cuantificar y expresarla como una proporción
determinada en cada especie siendo el ser humano una de las más ineficientes,
en esta especie si una pareja no se embaraza luego de un año sin relaciones
sexuales sin protección se considera infértil. Una de las técnicas mas usadas hoy
en día es la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), una técnica
costosa y de la cual aún se desconocen algunos aspectos de sus efectos sobre
los nacidos vivos, es por eso que se plantea la posibilidad de utilizar las técnicas
de manipulación existentes con el fin de intentar obtener fertilización de la forma
mas natural posible.

En este manual se presenta información derivada de los procedimientos de

manipulación de gametos y de cirugía utilizados para el desarrollo del proyecto de
investigación " Efecto de la remoción de la Zona Pelúcida sobre el desarrollo
embrionario"

Para incrementar el número de oocitos que son ovulados se administran

gonadotropinas exógenas a las hembras antes del apareamiento, permitiendo
recuperar grandes números ( hasta 35, de nuestra experiencia ) de embriones
preimplantatorios que pueden utilizarse en los diferentes tipos de experimentación
( microinyección de huevos, infección viral de mórula y marcaje metabólico de los
embriones con radioisótopos). La fuente mas común de gonadotropinas son las
que se obtienen del suero de yegua preñada (PMSG), esta tiene un marcado
efecto estimulador del desarrollo folicular ( acción folículo estimulante, FSH) y la
gonadotropina coriónica humana (hCG) cuyo efecto es similar a la función de la
hormona luteinizante (LH). Una superovulación eficiente depende de la edad, el
peso y las condiciones de salud. Usualmente se utilizan hembras prepúberes
entre las 3 y 5 semanas de edad, el peso bajo o la enfermedad alteran la
respuesta a las gonadotropinas y reducen el número de oocitos obtenidos en la
superovulación.; la dosis de gonadotropinas empleada con mayor frecuencia es 5
UI de PMSG y 5 UI de hCG estas son inyectadas intraperitonealmente en
volúmenes muy bajos que no exedan 0.2 ml; con un intervalo de 42 a 48 horas en
su administración, primero es la PMSG y posteriormente la hCG. Una cepa de
ratones se clasifica como buena respondedora cuando ovulan entre 40 a 60
oocitos y mala respondedora si ovulan 15 o menos .
Además para maximizar el número de oocitos fertilizados es necesario mantener
ratones con fertilidad probada, un alto conteo espermático y una buena proporción
de formación de tapón vaginal en las hembras apareadas.

Materiales y Equipos

Ratones, Jeringa de 1cc, Tijeras y Pinzas, Cajas de Petri de 30mm, Cajas de

cultivo de cuatro pozos, Agujas calibre 16, Pipetas Pasteur (2), Mechero,
Esteromicroscopio y/o microscopio invertido, Algodón, Alcohol, Gonadotropina
Sérica de Yegua Preñada, Gonadotropina Coriónica Humana, Medio de cultivo
Hams F10 u otro similar, Albúmina Sérica Bovina, Solución salina Bufferada

INYECCION INTRAPERITONEAL

Para realizar la inyección intraperitoneal se deben tener en cuenta dos factores: el

primero relacionado con tomar el ratón de la caja y el segundo el proceso de
inyección propiamente dicho. Recuerde que usted debe utilizar un adecuado
equipo y protección para evitar ser herido por el animal.

Para la primera tome el ratón por la cola y colóquelo en una superficie firme y
seca, no mantenga el ratón por mas dos 2 minutos de la cola pues causa una gran
cantidad de estrés. Coloque el ratón en una superficie firme y rugosa de forma
que el animal pueda fijarse en ella por sus garras. Con la otra mano , una vez el
ratón esta fijo, tómelo por la nuca asegurándose de abarcar toda la piel de la zona,
finalmente coloque la cola del animal entre los dedos y permita que la otra mano
quede libre para hacer cualquier procedimiento de manipulación.

Para la superovulación se utilizan generalmente jeringas de tuberculina,

previamente llene la jeringa con el volumen que vaya a inyectar. Fije un ratón de
la forma anteriormente mencionada, incline el animal 45 o con la cabeza abajo,
con esta práctica los intestinos se desplazan cranealmente al sitio de inyección.
Limpie con alcohol el área donde va ha hacer la inyección. Inserte la aguja en el
cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen formando un ángulo de 30oC,
aspire una pequeña cantidad de aire con el fin de asegurar la localización de la
aguja. En la región entre el diafragma y la vejiga, administre el fluido que vaya a
inyectar.

Sacrificio por dislocación cervical

Tome el ratón por la cola y póngalo en una superficie firme y rugosa de forma que
el animal pueda fijarse en ella por sus garras, con la otra mano fije el ratón de la
nuca asegurándose de tomar la mayor cantidad de piel posible, fije la nuca y estire
el animal de la cola, hasta sentir que la cabeza se separa de la columna vertebral.
FABRICACIÓN DE LAS PIPETAS PARA RECOLECTAR Y MANIPULAR
EMBRIONES

Las pipetas utilizadas para la manipulación de óvulos y embriones se fabrican en

el laboratorio, tomando Pipetas Pasteur , usualmente de 2 " de longitud en su
parte estrecha. Estas se mantienen estériles en recipientes y son adelgazadas
hasta el diámetro necesario en el momento de la manipulación embrionaria. Para
adelgazarlas se calientan las pipetas Pasteur con una llama fina , bien sea de
mechero a gas o de alcohol, se fijan los dos extremos, cuando está lo
suficientemente caliente y se siente que el vidrio está blando , se estira para
producir un tubo con un diámetro interno de aproximadamente 200 (m. Es de
anotar que se hace el estiramiento manteniendo los dos extremos fijos, no se trata
de hacer un capilar con un extremo cerrado, se hace un tubo muy delgado,
posteriormente con el microscopio se observa el diámetro de la pipeta y se corta
por el sitio que mas se ajuste al tipo de célula o de procedimiento a realizar. Con
la llama se deben pulir los bordes de la pipeta.

FERTILIZACIÓN IN VITRO

Se inyectan las hembras con PMSG y hCG para inducir la superovulación.

Obtención de espermatozoides:

Los machos se sacrifican por dislocación cervical 12 horas después de que las
hembras han sido inyectadas con hCG, se deben utilizar machos que se hayan
tenido por lo menos 3 días de abstinencia sexual.

Se realiza una incisión media ventral y se fija el animal por las extremidades, una
vez abierto se identifica y extrae la cola del epidídimo, removiendo la mayor
cantidad de tejido adiposo como sea posible. Se corta el conducto deferente lo
más cerca posible al epidídimo y luego se coloca en un plato con 500 µl de medio
de cultivo suplementado con 30 mg/ml de albúmina sérica bovina. Utilizando unas
pinzas finas se presiona el epidídimo para facilitar la salida de los
espermatozoides. Los espermatozoides así obtenidos se deben incubar durante
90 minutos a 37°C con 5 % de CO2 para capacitarlos.

Obtención de óvulos

Se sacrifican las hembras por dislocación cervical 12.5 horas después de la

inyección de la hCG, se extraen los oviductos, se sacan las masas de oocitos y se
colocan en un plato con 1000 µl de medio de cultivo con 30 mg/ml de albúmina
sérica bovina y se llevan a incubadora con 5% de CO2 en aire y 37°C de
temperatura. Luego de que hayan transcurrido 13.5 horas después de haber
inyectado las ratonas con hCG se adicionan 100 µl de espermatozoides a los
platos donde se encuentran los oocitos, se debe ajustar a una concentración de
espermatozoides móviles de 1x106 a 2x 106 espermatozoides/ml.

Incubar los espermatozoides con los oocitos durante 4 horas a 37°C. Luego de
que hayan transcurrido las 4 horas de incubación se transfieren los oocitos a
medio de cultivo con 4 mg/ml de albúmina sérica bovina, con la menor la menor
cantidad de espermatozoides como sea posible. Unas 12 a 16 horas posterior a la
inseminación de los oocitos, se evalua la fertilización mediante la observación de
los pronucleos masculino y femenino y la extrusión del segundo cuerpo polar.

CULTIVOS EN MICROGOTAS

En un plato de cultivo estéril se vierten gotas de 20 a 40 µl de medio M16, luego

se cubren con aceite de parafina y se transfieren los embriones al medio de
cultivo, por último se llevan a una incubadora con atmósfera de CO2 al 5% y se
verifica su desarrollo hasta llegar al estadio de blastocisto

SEGUIMIENTO

Una vez fertilizados a las 18 horas se realiza la evaluación de los pronucleos, es

decir la fertilización.

Cada 24 horas se evalua el desarrollo embrionario hasta el estado de blastocisto.

GLOSARIO

Oocito.: Gameto femenino

Oocito maduro: Gameto femenino que una vez ovulado se encuentra en

metafaseII

Pronucleo: Estado del desarrollo embrionario en el que se encuentra previos a la

singamia.

Singamia: Proceso mediante el cual se unen los genomas femenino y masculino

(pronucleos).

Embrión: Estado de desarrollo del ser, previo a la implantación.

Blastocisto: Estado de desarrollo del embrión en el que se forma una cavidad,

previo a la implantación.
Gonadotropinas : Hormonas que se suministran a los animales para la inducción
del desarrollo folicular y ovulación.

Peritoneo : Capa de tejido que cubre la cavidad abdominal.

Práctica No. 5
ESTABILIZACIÓN DE LA MATERIA ORGÁNICA MEDIANTE
PROCESOS BIOXIDATIVOS AEROBIOS (COMPOSTAJE)

INTRODUCCION

La tierra se considera como un sistema termodinámico cerrado. En consecuencia,

la única posibilidad de generación de nueva biomasa es el reciclaje de la materia.
Los denominados biosistemas han evolucionado en consecuencia con esta
condición termodinámica hasta generar una clasificación, basada en la
transformación de la materia, que determina la configuración de tres tipos de
organismos: Productores, consumidores y descomponedores. Se denomina como
productores a los biosistemas que están en capacidad de biotransformar la
energía lumínica procedente del sol en energía química almacenada en forma de
moléculas reducidas. El segundo tipo de biosistemas que se denominan
consumidores se caracterizan por ser intermediarios de la energía química.
Finalmente, se denominan descomponedores a los organismos especializados
generar energía química a expensas de la biooxidación de la biomasa generada
en los otros dos tipos de biosistemas.

Con la consolidación del urbanismo en el siglo XX se estableció una doble

problemática: En primera el deterioro paulatino de los suelos con vocación
agrícola y en segunda instancia la contaminación ambiental por acumulación de
materia orgánica. Ante esta doble problemática, se vienen buscando alternativas
científicas y tecnológicas que puedan dar respuesta en ambos sentidos: En el
sentido agronómico buscar formular sustratos que permitan recuperar la fracción
orgánica del suelo y, en el sentido ambiental al minimizar el impacto de la
acumulación de materia orgánica.

El compostaje se considera hoy como una de las alternativas más plausibles a la

condición anotada. El compostaje se puede entender como el proceso acelerado
e irreversible de la degradación biooxidativa y catabólica seguida de un proceso
de resíntesis de un substrato orgánico sólido, a través de organismos
descomponedores endémicos (normalmente artrópodos y microorganismos), endo
y exoenzimas presentes en el medio, que actúan sobre la matriz orgánica hasta la
obtención de un producto heterogéneo denominado compost, con apariencia
completamente independiente del material de origen y que se caracteriza por su
estabilidad química y sanitización, con respecto a parámetros de referencia
establecidos por un patrón.

El objeto de la presente práctica es dar una serie de herramientas a los

estudiantes sobre los tratamientos bioxidativos de materiales orgánicos de
desecho, para la generación de insumos agrícolas.

OBJETIVO GENERAL

Diseñar, producir y evaluar un proceso bioxidativo aerobio (compostaje) bajo

condiciones de laboratorio.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Definir las materias primas aptas para el proceso de compostaje mediante la

evaluación de variables físicas, químicas, biológicas y ambientales.

Establecer las mezclas adecuadas para dar inicio a un proceso de compostaje.

Evaluar cinéticamente el proceso (variables físicas, químicas y biológicas) para

definir el punto final del proceso en consideración a la normatividad vigente.

MATERIALES

Como materias primas se utilizarán residuos sólidos urbanos (con separación en

fuente), gallinaza (estiércol) y aserrín. Además un reactor con capacidad para 25
lts según se presenta en el esquema siguiente.

Sistema de aire
biofiltros

Termómetro
METODOS

Definición de materias primas. En función del origen, la humedad y la relación

carbono/nitrógeno se estima la mezcla más adecuada para iniciar el proceso.

Estudio cinético. Una vez definidas la mezcla inicial, con intervalos de dos
semanas, obtener una muestra para la realización de un estudio cinético. Para el
caso presente se realizará el estudio por 60 días.

Determinación de punto final del proceso y calidad del producto final.

Carbono orgánico

Para determinar la cantidad de carbono orgánico, las moléculas orgánicas deben

romperse en unidades de carbono simples y ser convertidas en una forma
molecular sencilla que pueda medirse de forma cuantitativa. Se sigue el protocolo
descrito a continuación.

Transferir a un Matraz de Erlenmeyer 1.0 g (0.5 g o menos sí es alto en materia orgánica el

material debe pasar una malla N° 80)

Adicionar 10.0 mL de Dicromato de Potasio 1 N

Inmediatamente adicionar 20 mL de ácido sulfúrico

concentrado sobre la disolución anterior y agitar
vigorosamente por 1 minuto

Reposo por 30 minutos

Adicionar 200 mL de agua y 10 mL

de ácido fosfórico

Adicionar 0.5 mL de difenilaminosulfonato de Bario antes de titular

Titular con FeSO4 .7 H2O hasta que aparezca un

ligero verde fosforescente
Cenizas

Es un parámetro útil en definiciones cinéticas (dado que debe aumentar en función

del tiempo) e igualmente necesario para el reconocimiento de la calidad del
producto final. Debe tenerse en cuenta que realmente se determina tanto
contenido de cenizas como el carbono orgánico fijo.

Materiales y procedimiento

Crisol de porcelana, horno mufla, desecador y balanza analítica con sensibilidad

de 0.001 g. Para iniciar, se pesan 2 g de la muestra en un crisol de porcelana,
previamente tarado a la temperatura de trabajo, se lleva la muestra a un horno
mufla precalentado a 250 °C y se calienta gradualmente, hasta alcanzar una
temperatura de 550 °C. Se calcina la muestra durante cuatro horas, se enfría en
un desecador y se pesa.

CÁLCULOS

El contenido de cenizas, expresado como porcentaje, se calcula aplicando la

siguiente ecuación:

% de Cenizas = (B - C)/(A - C) x 100

Donde: A: Peso de la cápsula más muestra en gramos, B: Peso de la cápsula más cenizas en gramos y C:
Peso de la cápsula vacía en gramos

Nitrógeno

Dado que es un macronutriente, es trascendental definir las cantidades presentes.

El nitrógeno calculado corresponde a nitrógeno total y el procedimiento empleado
para la determinación de nitrógeno total es el método de Kjeldhal, que consiste en
convertir el nitrógeno presente en sulfato de amonio por digestión con ácido
sulfúrico concentrado en presencia de un catalizador. El amonio formado se libera
por adición de NaOH en exceso, luego se destila sobre una disolución de H2SO4 ó
HCl y se titula el exceso de ácido con disolución valorada de NaOH o KOH.

Reactivos:

Catalizador: Pesar 100 g de sulfato de potasio (K2SO4) y mezclarlos con 1.6 g de

sulfato de cobre (CuSO4)

NaOH al 50 %: Pesar 50 g de hidróxido de sodio en escamas y adicionar 50 mL de

agua destilada, Acido clorhídrico 0.1 N, Acido Sulfúrico concentrado (98%) e
Indicador Tashiro
Para calcular el nitrógeno total se emplea la siguiente ecuación:

% de N = [ (V HCl x N HCl) – (V NaOH x N NaOH) ] 14x 100 / g de muestra

El protocolo se ilustra a continuación

Muestra 0.4 g

Balón Kjeldhal

10.0 mL de H2SO4
Adicionar
Concentrado

4.0 g de
Adicionar
catalizador

Digestión Aprox. 1 hora

Lavar con agua

Adicionar
paredes del balón

Reposo Hasta temperatura

ambiente

Balón destilación
Traspasar
realizando lavados

Adicionar 40.0 mL de NaOH al 50 %

Destilar

Recibir Aprox. 100 mL sobre 50 mL de

HCl de concentración conocida

Titular NaOH 0.1 N

Capacidad de retención de agua

Es fundamentalmente un parámetro de calidad del producto final.7,9

EQUIPO

Embudo pequeño de vidrio con tallo corto, matraz de Erlenmeyer de 250 mL,
balanza analítica con sensibilidad de 0.001 g, papel de filtro, malla 60

PROCEDIMIENTO

Se coloca un papel de filtro previamente humedecido hasta saturación en un

embudo de vidrio, se registra el peso y se coloca en un Matraz de Erlenmeyer. Se
coloca el conjunto en la balanza, se tara y se pesa una cantidad determinada de
muestra (aproximadamente 5 gramos, secada al aire y que pase por malla 60). A
la muestra pesada se le adiciona agua en exceso, se deja hasta que filtre por
completo y se pesa nuevamente el embudo con muestra húmeda y se registra el
dato de diferencia entre el peso de embudo, papel y muestra, y peso de embudo y
papel.

RESULTADOS

La capacidad de retención de agua, expresada como mililitros/gramo de muestra,

se calcula aplicando la siguiente ecuación:

C.R.A. = Vr
W
Donde: C.R.A.: Capacidad de retención de agua, W : Peso inicial de muestra en gramos, Vr : Volumen de
agua retenido por la muestra; el cual se calcula como la diferencia entre el peso final y el peso inicial de la
muestra. Vr = Wfinal - Winicial (W: peso de muestra)

La capacidad de retención de agua es reportada como un promedio con su

respectiva desviación estándar.

Densidad aparente

Es igualmente un indicativo de la calidad del producto final y definitiva en la

comercialización del producto.10,11

EQUIPO

Recipiente de vidrio o de plástico con volumen definido, balanza analítica con

sensibilidad de 0.001 g, malla de 360 micrómetros
PROCEDIMIENTO

Se toma un balón volumétrico de 2 mL , se tara en la balanza analítica, se deja

caer libremente la muestra (seca y cernida) hasta completar el volumen del
recipiente y se registra el peso.

RESULTADOS

La densidad aparente expresado como gramos/mililitros de muestra se calcula

aplicando la siguiente ecuación:

D = W (g)
V

Donde: D : Densidad de la muestra, W : Peso de la muestra en gramos y V : Volumen del recipiente en

centímetros cúbicos

Práctica No.6
OBTENCIÓN DE BIONSECTICIDAS

INTRODUCCIÓN

La actividad insecticida de contacto se basa en la determinación de un modelo

estadístico matricial que considera el efecto (actividad biocida) como la variable
dependiente, en función de la concentración (o dosis) y el tiempo de contacto
como las variables independientes. Para un modelo de regresión múltiple, la Dosis
Letal Media (DL50) (o Concentración Letal Media, CL50) y el Tiempo Letal Medio
(TL50), se obtienen mediante dos análisis: En el primero se hace constante el
tiempo y se genera la DL50. En el segundo la dosis se hace constante y se genera
el TL50.

Para cada evaluación se realizan dos tipos de ensayos. Un exploratorio y uno

definitivo. En el ensayo exploratorio se utilizan al menos cinco concentraciones
diferentes del extracto, calculadas así: la recomendada por el fabricante como una
concentración intermedia y a partir de ella se seleccionan dos concentraciones
superiores y dos inferiores, separadas entre si por un factor de 10. Con base en
los resultados, se calculan las nuevas concentraciones del extracto para los
ensayos definitivos, así: Para el nuevo intervalo de concentraciones, se toma
como valor mínimo la máxima concentración donde no se observaron efectos y
como valor máximo, la mínima concentración donde se observó el máximo efecto.
Entre estos dos valores extremos, se calculan al menos otras cuatro
concentraciones intermedias separadas por un factor logarítmico, que varía en
cada ensayo y según el intervalo establecido en el ensayo exploratorio.

Los datos de efectos son anotados en los formatos específicos para cada prueba.
Luego se elabora la matriz de dosis-respuesta y se calcula el modelo de regresión
múltiple. En cada ensayo se deben incluir dos controles: el negativo consiste en
someter ejemplares a las mismas condiciones experimentales pero sin extracto o
sustancia y como control positivo se utiliza un extracto de referencia.

En el presente caso se consideran tanto pruebas “de contacto” como de

“interrupción del ciclo de vida” en insectos. Por esta característica este tipo de
compuestos insecticidas. Específicamente se considera “prueba de contacto” al
bioensayo sobre un insecto de referencia que al entrar en contacto con un
producto permite estimar el porcentaje de mortalidad en un tiempo relativamente
corto (aproximadamente menor a 1 hora) y que no requiere de la ingestión para
lograr el efecto. Por su parte, se denomina bioensayo de “interrupción del ciclo de
vida”, al estudio del efecto que un extracto o producto tiene sobre los diferentes
instar del ciclo del insecto de referencia.

OBJETIVO GENERAL

Evaluar insecticidas naturales y de síntesis para determinar concentraciones

letales y tiempos de mortalidad.

Procedimientos

Las pruebas de actividad insecticida (contacto e interrupción de ciclo) se realiza

según los siguientes diagramas. Para su seguimiento y toma de datos se utiliza el
formato adjunto.

PRUEBAS POR CONTACTO (DISCOS IMPREGNADOS)

1. Materiales y equipos

Colonias de D. Melanogaster, estereomicroscopio, cartulina blanca, pincel suave,

pinzas entomológicas, balanza, viales de 25 mL, papel de filtro, embudo, tapones
de algodón y gasa, CO2, beaker, Erlenmeyer, pipetas (1, 5, 10 mL), micropipeta,
agitadores de vidrio, papel de filtro, bandejas plásticas, capturadores manuales,
jaulas para cría de insectos, bandejas de alumio, bombillas

2. Procedimiento
La prueba de actividad insecticida por contacto se realiza de la siguiente manera:

Se seleccionan grupos de 30 individuos de la colonia principal, utilizando CO2

para anestesiarlos y manejar fácilmente. Se deben separar al menos tres grupos
por cada concentración de extracto que se desee evaluar (3 réplicas). Las
concentraciones de extracto se preparan como se describe en la Fundamentación
teórica previamente descrita y cada grupo de 30 ejemplares se deposita en un vial
limpio y transparente. A otro grupo de viales limpios y transparentes (3 réplicas por
cada concentración de extracto), se les introducen discos de papel de filtro hasta
el fondo. Éstos se saturan con 0.20 mL del extracto a las concentraciones
seleccionadas. Una vez despiertos los individuos, con la ayuda de un embudo se
deposita cada grupo de 30 en los viales con los discos impregnados del extracto.
El intervalo para depositar cada grupo es de 5 minutos.
Durante 60 minutos y cada 5 minutos, se hace un recuento de los individuos
muertos en cada vial. Los datos se registran en el formato respectivo (Importante:
Los tiempos de observación pueden variar de un producto a otro). Con la
información obtenida se debe estimar la media y la desviación estándar para cada
tiempo de observación y correlacionar resultados y registrar estos datos en el
formato adjunto.
Formato para evaluación de actividad insecticida de extractos (por contacto)

Concentración
C1 C2 C3 C4 C5 C6 MODELO Valor p CL50
Tiempo
t1
t2
t3
t4
t5
t6
t7
t8
t9
T10
MODELO
Valor p
TL50
 PRUEBA DE INHIBICIÓN DEL CICLO DE VIDA
(PRUEBA POR INGESTIÓN) CON Drosophila melanogaster

Esta prueba se realiza de acuerdo con el siguiente protocolo:

Procedimiento para pruebas de inhibición del ciclo de vida con D.

melanogaster

Se preparan los viales con las diferentes concentraciones de extracto que se

quiera evaluar, al menos seis concentraciones con tres réplicas cada una
Se prepara el alimento clásico para D. melanogaster y se deposita en los viales
con el extracto, hasta completar un volumen de 15 mL, se agita la mezcla para
homogenizarla y cubrir los viales con gasa hasta el día siguiente. Pasado este
tiempo, se depositan tres parejas jóvenes en cada vial y se dejan allí durante 2
días, para luego descartarlas (Observación: Los ejemplares se deben dormir
previamente con CO2 antes de manipularlos). El día 9 se cuentan las pupas y a
partir del día 10 se cuentan los adultos una vez al día y durante 10 días (para el
vigésimo día ha culminado el desarrollo de los individuos de la primera generación
filial). Los datos se registran en el formato para pruebas de inhibición del ciclo de
vida. Para cada concentración se estiman: la relación entre las pupas obtenidas y
el número de adultos que eclosionaron, el porcentaje de inhibición y la CL50
 Práctica No. 7

PRODUCCIÓN DE JARABES A PARTIR DE ALMIDÓN DE YUCA

En este informe se presentan los resultados obtenidos en la experimentación de

cada una de las etapas, a saber: licuefacción, sacarificación e isomerización.
También se presentan los resultados obtenidos en la puesta en marcha del
proceso de sacarificación en continuo, así como, las posibles estrategias de
escalamiento, dado el caso de querer llevar los resultados a nivel piloto. Después
se presenta la evaluación de la economía del proceso en la que se determinó a
partir de que volumen y en que tiempo se puede recuperar la inversión. Este
costeo se realizó utilizando el SuperPro Designer Versión 4.1.

Para la etapa de licuefacción, se diseño y se construyó un reactor por lotes en

acero inoxidable, con agitación y control de temperatura de 10L. Se concluyó que
la mejor conversión de almidón de yuca se obtiene al trabajar con una
concentración de almidón del 40%; con una concentración de enzima
(Termamyl 120L) de 1,33 mL/L; a las condiciones de: pH = 5,5, temperatura =
85°C y agitación = 200 rpm. En estas condiciones, al cabo de dos horas, se logra
una conversión del 50% (DE) trabajando en un reactor en acero inoxidable
enchaquetado y con un volumen efectivo de trabajo de 8L.

Las mejores condiciones operacionales para el proceso de sacarificación por lotes

fueron: pH 4.5, temperatura 55°C y tiempo de reacción 6 horas, utilizando una
concentración de enzima (AMG 300L) de 1 ml/L de sustrato, en estas
condiciones se obtiene una conversión del 98% de DE. Este proceso se trabajó
también en continuo, con un volumen de 3 L, y empleando una membrana de
Ultrafiltración para recuperar la enzima. En este se logró un flujo de 20 ml/min. y
un tiempo de residencia de 2.2 h durante 6h. Se trabajo con una concentración de
1.5 ml de enzima/L de sustrato Las conversiones alcanzadas en estas
condiciones fueron de solo el 75% DE.

METODOLOGÍA:

LICUEFACCIÓN:

Medición colorimétrica de azúcares reductores

Equivalente de dextrosa: Para la caracterización de los productos de la hidrólisis

del almidón se emplea el parámetro que mide el grado de hidrólisis: Equivalente
de dextrosa (DE) que se define como unidades de glucosa pura requeridas para
reducir la misma cantidad de reactivo ácido dinitrosalicilico (DNS) que 100
unidades de masa de hidrolizado seco (Miller G.L, 1959).
Para determinar el equivalente de dextrosa, se utilizó el método del DNS, descrito
anteriormente, elaborando una curva patrón de concentración de glucosa vs.
absorbancia. Las lecturas fueron hechas en un espectrofotómetro Spectronic
Genesys 2PC.

Condiciones de Operación
Temperatura.
Para este ensayo se utilizo almidón a una concentración de 1%, la concentración
de la enzima fue de 60 KNU, el pH: 5,5 y el tiempo de reacción fue de 30 minutos.
Las temperaturas a las cuales se analizó el grado de hidrólisis fueron: 60, 70, 80,
85, 90, 95 y 100°C.

Preparación del almidón

Las soluciones concentradas de almidón (40, 45 y 50%) se preparan diluyendo el
almidón en 2/3 del volumen total de agua que lleva la solución y agregándolo al
1/3 de agua restante que ha sido calentada previamente a una temperatura
aproximada de 70°C y homogeneizando con agitación vigorosa.

SARIFICACIÓN:

Equivalente de dextrosa: Para la caracterización de los productos de la hidrólisis

del almidón se emplea el parámetro que mide el grado de hidrólisis: Equivalente
de dextrosa (DE), que se define como unidades de glucosa pura requeridas para
reducir la misma cantidad del reactivo ácido Dinitrosalicílico (DNS) que 100
unidades de masa de hidrolizado seco (Miller G.L, 1959).

Para determinar el equivalente de dextrosa se utilizó el método del DNS descrito

anteriormente, elaborando una curva patrón de concentración de glucosa vs.
absorbancia. Las lecturas fueron hechas en un espectrofotómetro Spectronic
Genesys 2PC.

Glucosa oxidasa: La determinación de glucosa para las soluciones obtenidas

después de la sacarificación se realizaron mediante el análisis enzimático con
glucosa-oxidasa (GOD-PAP, obtenido de Merck). Este método consiste en una
reacción colorimétrica exclusiva para glucosa, lo cual permite diferenciarla de los
demás subproductos obtenidos en la sacarificación.

Actividad enzimática: Para la determinación de la actividad enzimática de la

AMG 300L se siguió la técnica desarrollada por INDUSTRIAS NOVO NORDISK,
Método Analítico Novo AF 22/6-GB, en la que 1 AGU es la cantidad de enzima
que a condiciones estándar hidroliza una micromol de maltosa por minuto a 25oC
y pH 4.3.
 Practica N. 8
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA CON LEVADURAS

INTRODUCCIÓN

La Fermentación alcohólica de define como el proceso bioquímico por el cual las

levaduras transforman los azúcares del mosto en Etanol y CO2. Para que la
fermentación se realice de manera eficiente, el mosto ha de hallarse en
condiciones anaerobias. En condiciones aerobias las levaduras se multiplican
abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consiguen
1g de levadura por cada 4g de azúcar consumidos los productos obtenidos son
muy poco etanol, agua y CO2.
En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentación; es decir
degradan los azúcares de forma incompleta generando Etanol, CO2 y energía.
En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1g de levadura por
cada 100g de azúcares consumidos.

Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la producción de etanol.
Saccharomyces cerevisiae es la levadura más comúnmente utilizada. El Etanol
es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las levaduras es
crítica para obtener rendimientos altos.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIÓN ALCOHÒLICA

Existen factores tanto físicos como químicos que inciden positiva o negativamente
en el transcurso de la fermentación alcohólica, ya sea actuando sobre el
desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia
fermentación. Los más relevantes son los siguientes:

TEMPERATURA: A mayor temperatura la fermentación transcurre mas

rápidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y
mas cantidad de compuestos secundarios.
Las levaduras a 30°C tienen su temperatura óptima de desarrollo. Por encima de
35°C la actividad disminuye rápidamente y mueren a antes de 45°C.

OXIGENO: Aunque la fermentación es un proceso anaeróbico, las levaduras

mantienen una leve respiración utilizando para ello el oxigeno disuelto en el
mosto.

NUTRIENTES: Los azúcares son fuente de energía para las levaduras.

OBJETIVO

Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentación realizada

por la levadura de Saccharomyces cerevisiae .
 MATERIALES Y EQUIPOS

Azúcar, miel o panela, Levadura, Recipiente de vidrio, Manguera y tapón,

Licuadora, Colador, Antiespumante, Alcoholímetro, Agitador mecánico
pHmetro, Equipo de destilación, Probeta, Espátulas, Balones de 4-6 L,
Refractómetro, Perlas de ebullición

REACTIVOS

KMNO4, Bisulfito de Sodio, Ácido Cromotrópico, H2SO4

DATOS Y OBSERVACIONES

Consideraciones a tener en cuenta en la elaboración del fermento:

Tabla 1: Cantidad de azúcar del mosto para corregir los °Brix

MATERIALES
CANTIDAD
QUE CONTIENEN AGUA (ml) °BRIX
(g)
AZÙCAR
Azúcar Blanca 10 100 1
Azúcar Morena 10 100 1
Miel 10 100 0,6
Glucosa 10 100 1

NOTA:

No es recomendable utilizar para la práctica frutas tales como: Mango,

Papaya, Guanábana y Guayaba; ya que estas tienen mucho mucílago y son
muy espesantes al trabajar con ellas, complicando la fermentación

Se sugiere utilizar frutas tales como: Mora, Uva, Lulo, Maracayá, Naranja.
Tabla 2: %Azúcar en algunas frutas

%AZÚCAR AZÚCAR
FRUTA
(g/1000ml) (gramos/litro)
Anon 25.4 254
Badea Jugo sin semilla 10.1 101
Banano común 23.4 234
Ciruela común 20.8 208
Cereza 16.6 166
Ciruela Claudia 13.0 130
Curaba 6.3 63
Chirimoya 18.2 182
Durazno amarillo 12.0 120
Feijoo sin cáscara 11.9 119
Frambuesa 11.6 116
Fresas enteras 6.9 69
Guayaba común 11.9 119
Guayaba pera 6.8 68
Guanábana pulpa 13.0 130
Higo sin semilla 9.6 96
Kiwi pulpa 14.9 149
Lima 6.0 60
Limón común jugo 8.6 86
Limón mandarina 5.8 58
Limón Tahití 7.2 72
Lulo sin semilla 5.7 57
Mamey pulpa 12.4 124
Mandarina Jugo 10.1 101
Manzana Ana 15.0 150
Manzana sin cáscara ni semilla 14.8 148
Maracuyá morado pulpa 13.6 136
Maracuyá amarillo pulpa 14.5 145
Mora castilla pulpa sin semilla 5.6 56
Naranja jugo 10.4 104
Pera sin cascara 8.5 85
Piña jugo 13.0 130
Tamarindo pulpa concentrada 61.3 613
Tomate arbol pulpa semilla 7.0 70
Toronja jugo 9.2 92
Uchuvas enteras 19.6 196
Uva Queen verde 14.0 140
Uva Isabela 15 150
Uva negra 9.6 96
Uva Red Globe 17 170
Uva Ribier 17 170
Uvas pasas sin semilla 75.0 750
Zapote pulpa 12.4 124
Tabla 3: Gramos de azúcar a adicionar por kilo de mosto.

Gramos de azúcar a adicionar por litro de mosto

Alcohol
Densidad 20ºC ºBrix Alcohol 8% Alcohol 10% Alcohol 12%
14%
1.0000 0.0 144.0 180.0 216.0 252.0
1.0050 1.5 129.0 165.0 201.0 237.0
1.0070 2.0 124.1 160.1 196.1 232.1
1.0100 2.7 116.7 152.7 188.7 224.7
1.0110 3.0 114.2 150.2 186.2 222.2
1.0150 4.0 104.4 140.4 176.4 212.4
1.0196 5.0 94.0 130.0 166.0 202.0
1.0200 5.2 92.1 128.1 164.1 200.1
1.0250 6.4 80.0 116.0 152.0 188.0
1.0300 7.6 67.9 103.9 139.9 175.9
1.0350 8.8 55.9 91.9 127.9 163.9
1.0399 10 44.0 80.0 116.0 152.0
1.0441 11.0 34.0 70.0 106.0 142.0
1.0483 12.0 24.0 60.0 96.0 132.0
1.0500 12.4 20.3 56.3 92.3 128.3
1.0525 13.0 14.0 50.0 86.0 122.0
1.0550 13.5 8.6 44.6 80.6 116.6
1.0567 14.0 4.0 40.0 76.0 112.0
1.0610 15.0 0.0 30.0 66.0 102.0
1.0653 16.0 20.0 56.0 92.0
1.0696 17.0 10.0 46.0 82.0
1.0740 18.0 0.0 36.0 72.0
1.0784 19.0 26.0 62.0
1.0828 20.0 16.0 52.0
1.0873 21.0 6.0 42.0
1.0918 22.0 0.0 32.0
1.0963 23.0 22.0
1.1009 24.0 12.0

PROCEDIMIENTO A (Producción con Células libres)

Preparar un sustrato (tener en cuenta que esté en buen estado), medir los grados
Brix y verificar que se encuentren entre 17-20 grados. En caso de ser necesaria
una corrección, se puede adicionar azúcar como fuente de carbono suplementaria
hasta obtener los grados Brix requeridos. Una vez corregidos, se ajusta el pH
(3.0-3.5). Finalizado este proceso, se toman 200ml del mosto y en él, se adiciona
la levadura (aproximadamente 2-4g/l) para sua ctivación a 37 °C. Al mosto
sobrante, se le agrega Bisulfito de Sodio (100 p.p.m.) para impedir la proliferación
bacteriana y el pardeamiento del medio.

Es necesario dejar un espacio en el recipiente para el control de espuma y la

salida del CO2, para ello se le pone el tapón de caucho con un orificio para la
introducción de una manguera aproximadamente de 1 metro de longitud la cual
tiene una salida que llega a un recipiente con agua donde se observarán las
burbujas del CO2 producidas.
Dejar fermentar libremente durante 4 semanas aproximadamente. A lo largo de
todo el proceso, se debe realizar un control periódico de las propiedades
fisicoquímicas del material en fermentación, tales como: pH y grados Brix, las
cuales ponen en evidencia el curso que lleva el proceso. (Producción ó no de
fermentación).
En caso de que los grados Brix bajen puede ser necesaria la adición de más
cantidad de azúcar, proporcional a los grados Brix que se quieran aumentar. VER
TABLA 1.

Finalizado el proceso de fermentación por parte de la levadura, indicado por la

estabilidad de los grados Brix, se procede a separar el alcohol del material no útil,
mediante destilación, para esto se procede así:

DETERMINACIÓN DEL GRADO ALCOHÓLICO VOLUMÉTRICO

Medir 200 ml del medio en un matraz aforado y anotar la temperatura.

Transvasar la muestra al balón de destilación, enjuagar el matraz aforado 4
veces, con 10 ml de agua destilada cada vez y añadir los líquidos de lavado al
mismo balón; adicionar perlas de vidrio y adicionar unas gotas del antiespumante.
Ensamblar el equipo y destilar recibiendo el destilado en el mismo matraz donde
se midió la muestra, el cual debe permanecer en baño de hielo. Recoger el
destilado, hasta obtener un volumen aproximadamente igual a ¾ del volumen.
Agitar y llevar a volumen con agua, a la temperatura inicial, con una tolerancia de
+/- 2°C. Para comprobar la producción de etanol producido, se realiza una prueba
cualitativa, el cual se toma una porción del destilado con una espátula y con una
candela se pone la llama debajo de esta, presenciar la producción de una llama
de color azul intenso, la cual indica la presencia de etanol relativamente puro,
descartándose la presencia de agua en el producto destilado.

Lectura:

Colocar el destilado en la probeta, la cual debe mantenerse en perfecta posición

vertical. En el líquido no deben existir burbujas ni partículas flotando. Introducir el
alcoholímetro en el líquido, agitar, dejar en reposo al menos 30 segundos y anotar
la temperatura. Leer el grado alcohólico, por encima o por debajo.

PROCEDIMIENTO B (Producción con Células inmovilizadas utilizando como

sustrato jarabe glucosado)

MATERIALES

Cepa de Saccharomyces cerevisiae mantenida en caja petri con agar Sabouraud

4 % de glucosa a 4 ° C.
Medio de cultivo para la activación de la cepa

Componente Cantidad por litro

Fuente de carbono 100.0 g
KH2PO4 2.0 g
(NH4)2SO4 3.0 g
MgSO4· 7 H2O 1.0 g
Extracto de Levadura 4.0 g
Peptona Universal 3.6 g
Agua destilada 1.0 L

PROCEDIMIENTO

Se debe repicar la cepa de levadura para obtener un cultivo fresco, esto se realiza
preparando algunas cajas con agar Sabouraud 4 % de glucosa y sembrando el
ellas el microorganismo. Se deben incubar las cajas a 38 ° C durante 4 días.

Activación de la levadura: Como el microorganismo se conserva en caja, para

transferirlo al medio de cultivo de producción del etanol; es necesario activarlo,
para esto se utilizan tubos de ensayo tapa rosca con un volumen de 10 mL del
medio de cultivo para activación. NOTA: La fuente de carbono utilizada es
sacarosa. Se toman colonias definidas y aisladas de una caja petri y se lleva a los
diferentes tubos con medio previamente preparados y esterilizados,
posteriormente se incuban a 38 ° C y 150 rpm durante 4 días. Pasado este
tiempo, se selecciona uno de los tubos dependiendo de la cantidad de biomasa
que presente y este se escala a un volumen final de 100 mL del mismo medio de
cultivo utilizado para la activación de la cepa. Pasadas 24 horas, los 100 mL son
escalados nuevamente a un volumen de 250 mL del mismo medio de cultivo.
Finalmente se escala a 2 L. NOTA: Todos los volúmenes escalados se incuban a
38 ° C y 150 rpm. Después de 2 días se presentan un crecimiento representativo
de células que servirán como inóculo. Se deshecha alrededor de 1 L de
sobrenadante, y el medio con células restante se divide en dos partes
aproximadamente iguales, 50 mL serán utilizados como inóculo para el proceso
en batch y el resto para el proceso en continuo con células inmovilizadas.
Se preparan 2.5 L del medio de cultivo pero esta vez el sustrato será jarabe
glucosado. Para preparar este medio es necesario conocer la concentración de
azúcares en el jarabe, puede utilizarse el método de DNS o Antrona y
posteriormente hacer la dilución correspondiente para que el jarabe quede a una
concentración de 100.0 g/L.

FERMENTACIÓN EN BATCH

Para esta fermentación se preparan 450 mL de medio de cultivo con jarabe

glucosado a este medio se le agregan los 50 mL del medio separado como
inóculo para este proceso y se incuba durante 12 horas a 35 ° C y 150 rpm;
pasado este tiempo, se toman 10 mL del sobrenadante, a esta muestra se le
realiza un análisis para determinar la concentración de sustrato por el método
DNS o Antrona. Se toman aproximadamente 100 mL del mismo sobrenadante
para ser destilados con el fin de concentrar el Etanol y determinar su
concentración.

FERMENTACIÓN EN CONTINUO

Las células que quedaron en los últimos 2 L de medio para crecimiento serán las
utilizadas en la inmovilización. Antes de montar la fermentación es necesario
inmovilizar las células.

INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

MATERIALES: Jeringa estéril, 150 mL de solución isotónica al 0.85 % (p/v)

(solución acuosa de NaCl), 190 mL de solución acuosa de Alginato de sodio al 3
% (p/v), 400 mL de solución acuosa de CaCl2 al 3 % (p/v). NOTA: Todas las
soluciones deben ser esterilizadas.

PROCEDIMIENTO

Después de tener una cantidad suficiente de células para inmovilizar, se descarta

el sobrenadante del medio de cultivo en el que han crecido. Las células que
quedan se centrifugan para obtener pellets libres de medio de cultivo y, se
resuspenden en una solución de NaCl estéril (solución isotónica).

La inmovilización se realiza mezclando una suspensión de levaduras en 100 mL

de solución isotónica estéril con una solución estéril al 2 % de Alginato de Sodio.
Se hace gotear esta mezcla mediante una jeringa estéril sin aguja sobre una
solución previamente esterilizada de CaCl2 al 3 %. Con una altura de gotea de 1
cm se pueden obtener esferas homogéneas de menos de 5 cm de diámetro.

MONTAJE DEL BIOREACTOR

Esterilizar durante 15 minutos y a 15 psi el reactor incluyendo las mangueras y la

tapa de este, además, esterilizar 2 L de medio del cultivo con jarabe glucosado.

En un ambiente estéril llenar completamente el reactor con las esferas de

levadura inmovilizada. llenar la columna con el medio de cultivo preparado con
jarabe y mantener durante 8 horas el proceso en batch para acondicionar las
células inmovilizadas. Pasado este tiempo, operar el reactor en continuo durante
12 horas a 37 ° C. Por último, tomar una muestra de 10 mL de medio de cultivo
para el análisis de azúcares y 100 mL para la destilación y determinación de la
concentración de Etanol.

Hacer cálculos de rendimiento en los dos procesos y comparar los resultados.

DETERMINACIÓN DE METANOL

Prueba cualitativa
Diluir la muestra a una concentración alcohólica entre 5 y 6% (G.L), tomar 50 ml
de la muestra diluida y destilar recolectando 40 ml en el mismo balón donde se
midió la muestra (balón de 50 ml). Ajustar a volumen con agua destilada.
Adicionar 1 ml de solución de KMNO4 a un erlenmeyer y enfriar en baño de hielo
por 15 minutos, agregar 0,5 ml del destilado. (Mantener en baño de hielo por 30
minutos), decolorar la solución con una pequeña cantidad de NaHSO3 (Bisulfito
de Sodio) seco (+/- 100 mg), añadir 0,5 ml de Ácido Cromotrópico y adicionar
lentamente y con agitación 7,5 ml de H2SO4 concentrado. Posteriormente se
pone el erlenmeyer en un baño maría a 60°C., durante 15 minutos (para
desarrollar color).

La aparición de un color que va del violeta al morado intenso indica la presencia

de metanol.

Prueba cuantitativa

Muestra
Proceder igual que la prueba cualitativa, pero dejar enfriar después del baño
maría. Llevar a volumen con etanol al 5.5 %, agitar y mantener siempre a
temperatura ambiente. Leer absorbancia a 575 nm.

Blanco
Tomar 1 ml de alcohol al 5.5 % llevarlo a un balón volumétrico de 50ml que
contiene 1 ml de KMnO4, colocar en baño de hielo y tratar igual que la muestra.

Solución estándar de metanol

Medir exactamente 1 ml de metanol y llevar a un balón volumétrico de 100 ml,
ajustar volumen con alcohol al 5.5 % de concentración = 1 % de metanol. Tomar
2.5 ml de la solución anterior y llevar a un volumétrico de 100 ml, ajustar volumen
con alcohol al 5.5 % de concentración = 0.025 % de metanol. Tomar 1 ml de esta
última solución y llevar a un volumétrico de 50 ml que contiene 1 ml de KMnO4 y
tratar en igual forma que la muestra y el blanco.
Leer la absorbancia del estándar.

Determinar la cantidad de metanol en la muestra como sigue:

% v/v metanol = A X 0.025 X F

A*
Donde: A: absorbancia de la muestra
A*: absorbancia del estándar de metanol
F: factor de dilución de la muestra.
Preparación de:
Alcohol del 5.5 %: A partir de etanol absoluto. Tomar 55.5 ml de etanol absoluto
y ajustar a 1 L con agua destilada.

GLOSARIO

GRADOS BRIX: Es el porcentaje de sólidos solubles presentes en el jugo o

material fermentecible, los cuales relacionan la gravedad específica de la solución
con la concentración equivalente de sacarosa pura.

PH: Medida de grado de acidez o basicidad de una solución.

FERMENTACIÓN: Consiste en el que el azúcar contenido en el mosto, ó su

mayor parte desaparece, ocupando su lugar el alcohol.

GRADO ALCOHOLIMÉTRICO: Porcentaje de alcohol etílico a 20°C.

BILBLIOGRAFÍA

POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, México. (1978). Pág.
359-376.
JAGNOW, G. Y David W.Bioctenología: inducción con experimentos modelos. Ed.
Acribia, Zaragoza-España (1991).
RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatología. Medellín, Enero de
1999.

Práctica No. 9
CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO y OBTENCIÓN DE
PROTEASAS

INTRODUCCIÓN

El incremento poblacional que resulta de la multiplicación celular, es un

componente esencial de la función microbiana, y con él se asocian, tanto el
crecimiento, como la generación metabólica; de hecho, las bacterias son
máquinas de duplicación constante en las que se incluyen reacciones cuya
finalidad es la formación de las macromoléculas necesarias para el ensamblaje de
las nuevas estructuras celulares de sus descendientes. Como en la mayoría de
los procariotes, el desarrollo de una célula individual es continuo hasta la división
en dos células nuevas (fisión binaria), el conocimiento de las características de
crecimiento de un microorganismo es muy importante, pues con ello se pueden
reproducir los procesos industriales y aumentar los rendimientos propios de los
procesos generadores de metabolitos.
En cultivos de producción por lotes (sistema batch), el aumento en la masa
celular como consecuencia del cambio en el número de células o absorbancia
(Abs) por unidad de tiempo (Velocidad de crecimiento), permite establecer una
curva típica de crecimiento (Figura 1) en la que se pueden observar las diferentes
fases de la misma: latencia (a), exponencial (b), estacionaria (c) y muerte celular
(d), y el grado de asociación de estas con la generación de metabolitos primarios
y secundarios, pues los primeros son aquellos que se forman durante el
crecimiento exponencial, mientras que los segundos, como las proteasas objeto
de la práctica, se producen casi al final de la fase exponencial de crecimiento y
son compuestos que no hacen parte del metabolismo energético de la célula.

El crecimiento microbiano se traduce en un incremento en la masa celular, en

donde la Velocidad de crecimiento, es el cambio en el número de células o
absorbancia (Abs), experimentado en unidad de tiempo.
Durante el crecimiento de los microorganismos, se generan una serie de
productos, llamados metabolitos, que pueden clasificarse como primarios y
secundarios. Los primarios son aquellos que se forman durante la fase de
crecimiento exponencial y además se forman como parte del metabolismo
energético de las células, mientras que los metabolitos secundarios se forman
casi al final de la fase exponencial de crecimiento y son compuestos que no
hacen parte del metabolismo energético de la célula. Como ejemplos de
metabolitos se encuentran etanol, proteasas, entre otras.

OBJETIVOS

ƒ Establecer una curva de crecimiento a partir de un cultivo controlado de

Bacillus
subtilis .
 ƒ Establecer el grado de relación entre la producción metabólica secundaria y
las diferentes fases de una curva de crecimiento microbiano .

REACTIVOS Y EQUIPOS

Microorganismo Bacillus subtilis, caldo nutritivo, solución de ácido tricloroacético,

caseína (leche), espectrofotómetro, agitador orbital, centrífuga, baño de agua,
erlenmeyer (250 mL), tubos de ensayo (3), pipetas estériles de 1 y 5 mL, papel
milimetrado.

PROCEDIMIENTO

Al inicio de práctica, cada uno de los grupos de trabajo debe alistar ciento treinta
(130) mililitros de un medio de cultivo nutritivo preparado según las indicaciones
del fabricante. Estos medios de cultivo se deberán repartir en tres tipos de
recipientes diferentes (un tubo de ensayo con cinco mililitros, un erlenmeyer con
cien mililitros y veinticinco mililitros repartidos en frascos pequeños a razón de
aproximadamente 3 militros) antes de su esterilización con las condiciones de
calor húmedo convencional para medios de cultivo (15 psi/ 121 ºC/ 20 minutos).

Una vez estériles los medios de cultivo, y con ayuda de una asa de cultivo, se
toma una muestra del microorganismo a utilizar en la práctica y se transfiere al
tubo de ensayo dispuesto con los cinco mililitros del medio de cultivo. Una vez
alcanzada la fase exponencial, este volumen completo se utiliza como inóculo del
erlenmeyer y se incuba a 28o C con una agitación orbital permanente de
aproximadamente 100 r.p.m. Con una periodicidad descrita por el profesor, se
deben tomar 2 mL de medio de cultivo y cuantificar la absorbancia con ayuda de
un espectrofotómetro (550 - 600 nm), utilizando como blanco el medio de cultivo
estéril que se almacena en los frascos pequeños. Para determinar la producción
del metabolito deseado (proteasas) durante el tiempo del cultivo, se toman
muestras con la periodicidad descrita por el profesor, se someten a fuerza
centrífuga (4.000 rpm, 10 minutos), y se almacena el sobrenadante para realizar
la siguiente prueba:

Se llenan 3 tubos de ensayo con 1 mL de solución de caseína o leche muy diluida

y se agregan según el caso:
Tubo 1 + 1 mL de agua (blanco)
Tubo 2 + 1 mL de medio de cultivo microbiano libre de células
Tubo 3 + 1 mL de medio de cultivo microbiano libre de células, previamente
sometido durante 2 minutos a 100ºC.

Se llevan los tres tubos a baño de agua (30ºC) durante30 minutos y se adiciona
un mililitro de ácido tricloroacético.

RESULTADOS
En esta práctica se utilizará como método para determinar el crecimiento
microbiano, la medida de la densidad óptica, para ello se registrarán los
resultados obtenidos en la siguiente tabla:

Lecturas Horas de cultivo Absorbancia (550 nm)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Reportar los datos obtenidos a partir de la acción del sobrenadante sobre la

proteína caseína.

6. GLOSARIO

• Crecimiento: incremento en el número de células.

• Crecimiento Exponencial: crecimiento de un microorganismo cuyo número
de células se duplica en un período constante de tiempo.
• Cultivo Tipo Batch o Monofásico: cultivo microbiano que funciona como un
sistema cerrado de volumen constante.
• Fase Estacionaria: período que sigue al crecimiento exponencial cuando la
velocidad de crecimiento de la población es cero.
• Fase Lag. Período anterior a la fase de crecimiento exponencial cuando las
células pueden tener un metabolismo activo pero aún no crecen.
• Proteasas: enzimas que degradan proteínas por hidrólisis.

7. BIBLIOGRAFÍA

Jagnow, G., David, W. Bitecnología. Introducción con experimentos. 1991.

Editorial Acribia. Zaragoza, España. 251p.
Madigan, M., Martinko, J., Prker, J. 2004. Brock. Biología de los
Microorganismos. Décima edición. Pearson Education S.A. Madrid. 1011p.
Martínez, M., Carrascal, A., Martínez, P. 1999 Manual de Laboratorio.
Introducción a la Biotecnología. Facultad de ciencias. Pontificia Universidad
Javeriana. Bogotá. 81p.
 Práctica No. 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO CON HONGOS

INTRODUCCION:
El ácido cítrico se obtiene por extracción natural de los jugos de frutas cítricas o
artificialmente por la transformación del azúcar realizada con algunos
microorganismos entre los que se destacan ciertas especies de hongos
correspondientes al género Aspergillus. Estos trabajos de producción metabólica
con hongos se iniciaron en la década de los años veinte con crecimientos
miceliares en superficie, continuaron algunos años mas tarde con procesos
sumergidos en cubas profundas y actualmente se llevan a cabo tanto en
superficie como en fermentadores de hasta 220 metros cúbicos de volumen. Lo
realmente valioso de este tipo de producción biotecnológica es que ha alcanzado
niveles muy importantes, pues por esta vía microbiológica se obtiene más del
99% de la producción mundial de este ácido orgánico que comercializado como
monohidratado o como anhidro, es utilizado fundamentalmente en las industrias
de alimentos y bebidas en las que aumenta o preserva el sabor de los jugos, de
los extractos de jugo de fruta, de los caramelos, de los helados y de las
mermeladas. En la industria farmacéutica (10% de la utilización total) se utiliza el
citrato de hierro y el ácido cítrico como preservante de sangre, o, en la
elaboración de tabletas, pomadas y en algunas preparaciones cosméticas. En la
industria química (25% del uso total) el ácido cítrico se utiliza como reemplazo de
polifosfatos, como agente antiespumante, como reblandecedor y para el
tratamiento de textiles, mientras que en la industria metalúrgica los metales puros
se producen como citratos metálicos.

OBJETIVO GENERAL.

Obtener ácido cítrico por cultivo de esporas de Aspergillus niger en medio de

cultivo enriquecido con sales apropiadas para la generación y crecimiento de la
biomasa.

MATERIALES Y REACTIVOS:
Aspergillus niger, jeringa desechable de 5 ml, agua estéril para inyección, gasa,
asa metálica, papel indicador del pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo,
mechero, erlenmeyer de 500ml y agitador orbital

Procedimiento:
Inicialmente y con ayuda de asa bacteriológica, se siembra Aspergillus niger en
un tubo de ensayo que contenga agar sabouraud previamente esterilizado con
calor húmero (15 psi/ 121 ºC/ 20 minutos), y se deja crecer durante
aproximadamente 10 días a temperatura ambiente. Paralelamente y esterilizado
bajo las mismas condiciones, se preparar un medio de cultivo líquido que por su
composición permita el crecimiento miceliar. Para lograr esto se utiliza un
erlenmeyer de 500 mililitros en el que se prepara un volumen final de 100 mililitros
(pH: 2) que incluye: sacarosa: 19.0g, nitrato amónico: 230 mg, dihidrogenofosfato
potásico: 100 mg, y sulfato magnésico: 0.03g

En la fermentación cítrica la conversión del azúcar es efectuada dentro de las

células vivas de los hongos, para lograr esto, el sustrato debe ingresar por
ósmosis y por lo tanto, en un recipiente profundo y de gran capacidad la
formación de ácido será relativamente lenta, puesto que la superficie de la capa
de hongos será pequeña en comparación con el volumen inversamente en el
empleo de recipientes de forma plana se consigue una gran superficie de micelio
y la conversión de azúcar a ácido cítrico se efectúa con gran rapidez. Para faciltar
esto y una vez esporulado el microorganismo en el medio de cultivo inicial (agar
sabouraud), a este se le agregan 5ml de agua estéril, se agita suavemente para
desprender las esporas (se ven a simple vista) y estas se transfieren al
erlenmeyer donde se encuentra el medio de cultivo. Finalmente se tapa el
erlenmeyer con algodón y se transfiere al agitador orbital (shaker, 150 r.p.m.) por
espacio de 14 a 20 días en los que se controla periódicamente el pH para facilitar
la obtención del metabolito. Una vez terminado el proceso, el medio de cultivo
(microroganismo incluido), se macera y filtra, resultando un licuado cuyo pH se
debe neutralizar con hidróxido de calcio. Una vez neutralizado, se calienta y se
añade un exceso del hidróxido, con el que probablemente se obtiene un
precipitado insoluble correspondiente al citrato de calcio. Tratando esta sal con
cantidades equivalentes de ácido sulfúrico diluido y filtrando, se obtiene un
precipitado de sulfato de calcio insoluble (sulfato de calcio) y un sobrenadante en
el que se precipitan algunos cristales que una vez lavados en frío (agua de hielo),
permiten realizar las pruebas cuali- cuantitativas necesarias para demostrar la
existencia del ácido cítrico.

Identificación cualitativa de citratos: a 15 mililitros de pyridina, se deben

agregar unos pocos miligramos de un citrato disuelto o suspendido en 1 mililitro
de agua. Una vez agregado, se adicionan 5 mililitros de anhidrido acetico y se
mezcla esperando que aparezca un color rojo propio de la presencia del citrato.
Para un ensayo cuantitativo, se debe consultar alguna farmacopea en la que se
encuentren técnicas específicas de análisis para este metabolito.

GLOSARIO

Cepa: Conjunto de células o cultivos con un origen común y que poseen una
dotación genética similar; cultivo puro de organismos, compuesto por la
descendencia de un único individuo.
Inóculo: Cultivo iniciador de un organismo, o una mezcla de organismos, añadido
a un medio para iniciar la producción de un número mayor.
Micelio: Parte vegetativa de un hongo filamentosos. Consta de una masa de
hifas.
Hifa: Filamento tubular que constituye la fase vegetativa de la mayoría de los
hongos y muchas algas.
Inoculación: Introducción de un pequeño número de microorganismos en un
medio, con la perspectiva de que a partir de éstos se desarrolle un número grande
de individuos, mediante crecimiento y reproducción.

BIBLIOGRAFÍA

CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiología Industrial. Editorial Acribia S.A.

Zaragoza España. 3ª edición. 1989.
JAGNOW, Gerhard. Biotecnología “Introducción con experimentos modelo”.
Editorial Acribia S.A. Zaragoza España. 1991.
PRESCOTT, S.C. Microbiología Industrial. Aguilar S.A. Ediciones Madrid.

Práctica No. 11
OBTENCIÓN DE PENICILINA Y COMPROBACIÓN DE SU ACCIÓN
ANTIBIÓTICA

Antibióticos
Las sustancias medicinales seguras tienen el poder para destruir a verificar el
crecimiento de organismos infecciosos en el cuerpo. Los organismos pueden ser
bacterias, virus, hongos, o los animales minúsculos llamados protozoa. Un grupo
particular de estos agentes se constituye de drogas llamadas antibióticos, desde
el griego anti ("contra") y bios ("vida"). Algunos antibióticos se producen desde
organismos vivientes tales como bacterias, hongos y moldes. Los otros son
totalmente o en parte sintéticos que es, producido artificialmente. La penicilina es
quizás el mejor antibiótico conocido. Su descubrimiento y luego desarrolla ha
permitido a la profesión médica tratar efectivamente muchas enfermedades
infecciosas, incluyendo algunas que alguna vez amenazaron la vida.

FABRICACIÓN
El natural; hace tiempo todos los antibióticos se hicieron desde organismos vivos.
Este proceso conocido como biosíntesis, se usa todavía en la fabricación de
algunos antibióticos. Realmente los organismos fabrican el antibiótico. La gente
involucrada solo provee las condiciones favorables para que los organismos
puedan hacer el trabajo y entonces ellos extraen la droga.

Sintético; Todos los tipos de penicilina poseen un núcleo químico idéntico llamado
anillo. La cadena química que es adjunta al anillo es diferente en cada tipo.
Cambiando las moléculas de la cadena, los científicos idean drogas con efectos
potencialmente diferentes sobre organismos diferentes. Algunas de estas drogas
son útiles para tratar infecciones, algunas no lo son.

Obtención y separación de antibióticos

Como se hallan y aíslan los microorganismos productores de los
antibióticos
La búsqueda directa de antibióticos se puede efectuar de dos maneras, cada una
de las cuales tiene particularidades propias aunque están ligadas entre sí, como
veremos de inmediato. Ellas son:

-Examen sistemático de cultivos puros de microorganismos, sea los que se

guardan en colecciones o recogidos al azar.
- La investigación de poblaciones microbianas mezcladas, sea del suelo, cloacas,
heces, aire, polvo, abonos, etc., previa una selección y de acuerdo con los
métodos idénticos a los empleados con cultivos puros.

Los métodos se han dividido en dos grupos, según sea el antagonista, cuya
capacidad se analiza, y el organismo frente al cual se prueba dicha propiedad, se
cultivan al mismo tiempo (implantación simultánea) o si el organismo de prueba se
siembra después que el antagonista ha desarrollado un cierto tiempo
(implantación sucesiva). Esta distinción que pudiera parecer trivial a primera vista,
es importante en la práctica, porque el primero de los métodos no puede mostrar
efectos positivos si se trata de la producción de un antibiótico incapaz de disolver
células antagonista, excepto que el antagonista crezca mucho más rápidamente.
Por el otro lado, si el organismo de prueba se introduce después que el antibiótico
se ha producido, será posible observar efectos tanto si la sustancia activa
bacteriostática, o sea, simplemente capaz de impedir el desarrollo del germen de
prueba, si es bactericida, es decir que mata a los organismos, o bien
bacteriolítica, con la propiedad de disolver otros microbios.

Asimismo pueden subdividirse dichos métodos de acuerdo a si el antagonista está

presente o ausente mientras el germen de prueba se está desarrollando. Este
hecho es de mucha importancia, ya que en determinados casos sólo hay
resultados positivos (es el caso de sustancias muy inestables) cuando el
antibióticos se forma continuamente durante el desarrollo del germen de prueba.

Organismos de prueba. La elección del antagonizado es un punto esencial para

poder apreciar en un estado inicial de las investigaciones cual es el campo de
acción del agente activo que se forma. Hay dos divisiones entre las bacterias
comunes respecto a su comportamiento frente a una técnica de tinción, la de
Gram, que permite una separación de notable utilidad en la clasificación de los
gérmenes. Los que retienen el colorante de genciana mordentado con iodo,
después de un lavado con alcohol o acetona, se llaman Gram positivos, y los que
lo pierden en iguales condiciones y pueden ser nuevamente coloreados con otro
tinte de contraste, se denominan Gram negativos.

Esta separación demuestra tener profundas bases en la fisiología y estructura de

las células y también en cuanto a la sensibilidad frente a distintos antibióticos,
pues hay algunos que obran solamente sobre organismos Gram positivos,
mientras otros (mucho menores en número) exclusivamente lo hacen sobre Gram
negativos. Aunque hay un importante grupo que actúa, en general sobre ambos
grupos de gérmenes.
Modo de acción de los microorganismos

La prescripción o elección de un antibiótico es más efectiva si se conoce la forma

de accionar del germen. Se debe reconocer que los microorganismos actúan
según diversos mecanismos. El conocimiento
de los mismos aplican no solamente la patogenia y la sintomatología de la
enfermedad sino también el éxito de la acción del antibiótico.

El poder de los gérmenes se clasifica de la siguiente manera:

Poder de virulencia: Se define como el poder de un germen para desarrollarse y
reproducirse en la intimidad de los tejidos.
Ejemplo: Neumococo, el cual instalado en el oído o en meninges, provoca
abundante supuración.
Muchas bacterias son vulnerables, pero casi todas están acompañadas por otras
propiedades: presión, temperatura.

Antibiótico: Ejerce su acción contra la virulencia ya fuere porque inmoviliza el

germen o lo destruye, según el mecanismo de acción bacteriostática o
bacteriolítica.

Toxinas
-Endotoxinas
-Exotoxinas

Las Exotoxinas proceden casi siempre de gérmenes Gram (+). Ejemplo:

Clostridium tetanis que segrega una potente toxina contra el sistema nervioso. En
este caso los resultados inmediatos con los antibióticos serán posibles, debido a
que el tratamiento deberá involucrar suero antitóxico específico. Frente a toxinas
de incorporación externa (botulinum) no hay terapia con antibióticos.

Las endotoxinas proceden casi siempre de bacterias Gram (-), son de naturaleza
liposacárida y poco antigénicas.
Esta se libra con la destrucción o autolisis del microbio.
Ejemplo: Bacilo de Eberth. Su destrucción libera endotoxina tífica.

Acción de los antibióticos

Los antibióticos se pueden aplicar por vía oral, parenteral o directamente
cutaneomucosa y puede generar dos efectos.

Bacteriostasis: inmoviliza vitalmente al germen, mientras se espera que la

inmunogénesis aporte los elementos defensivos necesarios.
Bacteriolasis: es la destrucción, lisis o muerte del germen.

CLASIFICACIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS

Antibióticos que actúan en la pared bacteriana. Ejemplo: penicilina, la pared
bacteriana protege a la célula contra los cambios osmóticos y contiene elementos
patógenos característicos de cada especie. Basamento químico de la pared
(micropéptidos) es una unión tridimensional de péptidos acetil-glucosamino y
acetil-murámico. Los Gram (+) 40-90% y los Gram (-) 4-10% de muramil péptidos.
Un antibiótico de este tipo impide la unión de ciertas estructuras químicas del
mucopéptido. Como consecuencia, la célula bacteriana, sin pared no resiste los
cambios osmóticos se hincha y estalla.

Antibióticos que actúan sobre la membrana celular:

La membrana celular se ubica debajo de la pared celular y es de gran
importancia. Este tipo de antibióticos puede alterar la permeabilidad y provocan
salinidad en el interior de la célula.

Antibióticos que interfieren en la síntesis proteica:

Ejemplo: tetraciclinas, la proteinosíntesis es de vital importancia en la vida de la
bacteria y los diferentes pasos del mecanismo de obtención pueden ser
infectados por los antibióticos. Estos son bacteriostáticos y bactericidas. Sin
producción o con producción alterada mueren.

Antibióticos que impiden la formación de ARN: son los que interfieren a la

polimerasa y la inhabilitan

Los antibióticos en la conservación de los alimentos

Se han obtenido antibióticos de diversos microorganismos, a saber: bacterias no
esporuladas, bacterias aerobias esporuladas, actinomicetes y estreptomicetes,
hongos filamentosos, basidiomicetes y algas. Entre ellos pueden citarse:

1. De bacterias no esporuladas, por ejemplo: los pyos Ib, Ic, II, III y IV (de la
Pseudomona aeruginosa), la diplococcina (de streptococcus cremoris), etc.

2. De aerobios esporulados: la tirotricina (del B. Brevis), la bacitracina, la subtilina

(del B. subtilis), la gramicidina, la polimixina, entre otros.

3. De actinomicetes: la estreptomicina, la actinomicina, la estreptotricina, la

actinopmicetina, la actinorubina, etc.

4. De algas: la chorellina.

5. De hongos filamentosos: la penicilina (seis variedades), el ácido ponicilinico, la

citrinina, el ácido aspergílico, la flavacidina, la fumigación, etc.

6. De basidiomicetes: la pleutoina, la biformina, la clitocibina, etc.

7. El grupo de estreptomices ha sido el que dio un mayor número de antibióticos y

muy valiosos, principalmente el grupo de las tetraciclinas y la nistatina. Otros son:
la higromicina, la estreptogramina, la ruticina, la carbomicina, la cloromicetina, la
nistatina, etc.
Merece especial mención el grupo de las tetraciclinas, por la amplitud de espectro
y por ser las de mayor aplicación en la preservación de alimentos.
Las tetraciclinas son formadas por el Streptomyces aureofaceins y la nistatina por
el Streptomyces noursei.

La penicilina es un antibiótico que pertenece al grupo de los β-Lactámicos; los

cuales son inhibidores de la síntesis de la pared celular bacteriana. Se combinan
específicamente con las denominadas proteínas que unen penicilina de la célula
bacteriana e inhiben la actividad enzimática de estas proteínas produciendo la
muerte celular.

Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de

Penicillium y Aspergillus.

La fabricación de penicilina es un ejemplo del proceso típico de obtención de

antibióticos. El hongo utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillium
chrysogenum y es particularmente activo sobre el estafilococo, estreptococo y
neumococo, así como sobre la mayor parte de los microorganismos Gram.
Positivos, presentando escasa acción sobre los Gram. Negativos. La penicilina es
lábil en medio ácido y puede ser inactivada por hidrólisis del anillo β -Lactámico
con penicilinasas.

PENICILINA; FABRICACIÓN INDUSTRIAL

La fabricación de penicilina es un ejemplo del proceso típico de obtención de
antibióticos. El hongo utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillum
chrysogenum y es particularmente activo sobre el estafilococo, estreptococo y
neumococo, así como sobre la mayor parte de los microorganismos Gram.
Positivos, presentando escasa acción sobre los Gram. negativos.

Las 4 fases principales para la fabricación de penicilina son:

- Fermentación
- Separación del micelio del caldo fermentado y extracción de la penicilina por
medio de disolventes
- Purificación con disolventes y formación de la sal sódica de la penicilina
- Ensayos de control y almacenamiento.

PREPARACIÓN:
El caldo de cultivo para la fermentación se obtiene por infusión acuosa de maíz,
añadiendo de un 2 a un 3% de lactosa, y también se adicionan compuestos
inorgánicos conteniendo hidrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio,
nitrógeno y trazas de hierro, cobre y zinc. La adición de ciertos compuestos que
favorecen el crecimiento del hongo debe evitarse, ya que podrían ser tolerados al
administrar el producto, ni su eliminación sería económica. Después de buscar el
pH a 4.5-5.0, el medio de cultivo se pasa al fermentador, que está equipado con
un agitador vertical, con un sistema de introducción de aire esterilizado por
filtración y con serpentines para mantener la temperatura deseada. El hongo se
introduce por medio de conducciones estériles y con ayuda de airea presión.
Durante el crecimiento el medio se esteriliza con vapor a presión, y la temperatura
se mantiene entre 23 y 25°C.

El aire estéril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la agitación facilita su

uniforme distribución en el seno del líquido. Se requiere un volumen de aire por
minuto y por volumen de medio de cultivo. El proceso se controla a intervalos que
oscilan entre 3 y 6 horas; al cabo de unas 50 a 90 horas el crecimiento se va
haciendo más lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado por completo.
La masa se enfría a 5°C a causa de la inestabilidad de la penicilina a la
temperatura ambiente, y se separa el micelio en un filtro de tambor rotatorio.

Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas grandes dosis de penicilina;

solamente un pequeño porcentaje de personas desarrollan alergia.
OBJETIVO GENERAL:

Obtención de penicilina por inoculación de esporas de Penicillium chrysogenum

previamente sembradas en agar sabouraud – en medio de cultivo liquido que
contiene los nutrientes apropiados para la generación y crecimiento de la
biomasa.

MICROORGANISMO

Cultivo en agar inclinado de Penicillium chrysogenum (DSM 1.075), realizado en

agar Sabouraud-glucosa: glucosa: 40.0g, peptona: 10.0g, agar: 15.0g, agua
corriente: 1L (pH 5.6)

MATERIALES
1 jeringa desechable de 5 ml, agua estéril para inyección, algodón, gasa, asa de
siembra, papel indicador del pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo,
mechero Bunsen, erlenmeyer de 500ml

PREPARACIÓN DEL INÓCULO

PROCEDIMIENTO OPERATIVO:
Se debe repicar Penicillium Chrysogenum en un tubo de ensayo que contenga
agar sabouraud inclinado y dejarlo crecer durante 8 días, mientras este tiempo
transcurre se disuelven los componentes del caldo de cultivo (lactosa: 30.0g,
glucosa: 10.0g, extracto de levadura: 40.0g, nitrato sódico: 3.0g,
dihidrogenofosfato sódico: 0.5g, fenilacetato sódico: 0.3g, sulfato magnésico:
0.25g, sulfato de cinc: una punta de espátula, agua corriente: 1L) en un
erlenmeyer de 500ml, se ajusta a pH entre 5.5 y 6, se tapa con algodón y se
esteriliza en autoclave a 121oC por 15 minutos. Al día siguiente se procede a la
siembra, para ello, se debe limpiar la cabina correctamente, y llevar allí, el medio
autoclavado, guantes quirúrgicos, asa de siembra, jeringa desechable de 5 ml,
agua estéril para inyección, aspersor con alcohol, gasa y mechero; encender el
motor de la cabina y la lámpara germicida y dejar durante 20 minutos, luego
apagar la lámpara germicida , encender la lámpara fluorescente, incluir el inóculo
y proceder con la inoculación de la siguiente manera: Saque 5ml de agua para
inyección con la jeringa y descárguelos sobre el tubo donde se encuentra el
inóculo, agite un poco con cuidado de no regar nada y luego adicionar en el
erlenmeyer donde se encuentra el medio, realice el mismo procedimiento con 5 ml
más y tape con el algodón. Saque todo el material de la cabina, limpie bien con
alcohol y gasa, lleve el medio al agitador orbital (shaker) controle el pH cada 2 ó 3
días manteniéndolo a pH 5, durante 10 a 15 días.

Cristalización de la penicilina: Filtrar el caldo de cultivo; tomar el filtrado y

ajustar el pH a 2.0 con ácido fosfórico, añadir un volumen igual de éter enfriado en
un baño de hielo; luego adicionar unas puntas de espátula de sulfato sódico
anhidro, concentrar a vacío hasta reducir a 1/4 el filtrado, añadir un poco de
solución de éter disuelto en trietilamina. Filtrar y recoger los cristales obtenidos.

Cortar con perforadora pequeños círculos de papel de filtro e impregnarlos con el

filtrado del medio, luego colocarlos en una caja de petri, la cual previamente ha
sido sembrada con un microorganismo sensible a la penicilina, que puede ser:
Bacillus subitlis, Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens. Incubar a 28ºC por
24 horas; al día siguiente se comprueba la actividad de la penicilina por la
aparición de halos de inhibición alrededor de los discos de papel.

Preparación de las placas de ensayo

Microorganismos
Cultivos en agar inclinado de de microorganismos de ensayo: B. subtilis (DSM
402), Micrococcus luteus (DSM 348), Escherichia coli (DSM 348), Pseudomonas
fluorescens (DSM 50.090), Agar de ensayo para bacterias indicadoras:
Glucosa 2,0g
Peptona 10,0g
Extracto de levadura 1,0g
Agar 12,0g
Agua desmineralizada 1,01 pH 7

Aparatos
Asa de siembra y mechero Bunsen, espátula de Drigalski, pipetas desechables
(1ml estériles), solución de NaCl (0,9%, estéril), tubos de ensayo (estériles)

Procedimiento operativo
Suspender un asa de siembra de las bacterias de ensayo en 2ml de solución de
cloruro sódico estéril; pasar 0,1ml de la suspensión bacteriana a la placa con agar
de ensayo; extenderla regularmente con la espátula de Drigalski, secar las placas:
dejarlas a 45ºC en una incubadora o estufa abierta.

Duración: 20minutos
Colocar la tapa, tener listas las placas de ensayo.
Duración: 2 horas

Comprobación de la penicilina con un ensayo de difusión

Material: Placas de ensayo, discos de papel impregnados de penicilina

Aparatos: Pinzas, mechero Bunsen, estufa regla graduada

Procedimiento operativo
Colocar los discos de papel con penicilina sobre las placas de ensayo con las
pinzas esterilizadas a la llama (3-5 discos), incubar las placas de ensayo a 28ºC.
Duración: 24 horas

Control de las placas: se comprueba la actividad de la penicilina por la aparición

de halos de inhibición alrededor de los discos de papel.

Resultado
El diámetro del halo de inhibición es una medida de la acción (y concentración)
antibiótica de la penicilina obtenida. Los halos claros se miden con la regla y los
datos obtenidos se reúnen en una tabla. Si se tiene poca práctica, aunque la
manipulación haya sido cuidadosa pueden producirse errores, por lo que es
recomendable llevar a cabo cada experiencia por triplicado. Por ello, habría que
realizar la preparación para la cristalización de la sal de penicilina sólo cuando se
haya establecido con certeza la actividad antibiótica con el ensayo con el filtrado
de cultivo.

GLOSARIO

ANTIBIÓTICO: Sustancia natural de peso molecular relativamente bajo, producida

por un microorganismo, la cual en solución diluida inhibe el crecimiento o destruye
otros microorganismos.
HIDRÓLISIS: Rotura catalítica de macromoléculas o polímeros en sus
constituyentes con la incorporación de los elementos del agua.
BIOMASA: Masa celular producida durante la fermentación.

BIBLIOGRAFÍA

COOMBS, J. Diccionario de biotecnología. Editorial Labor, S.A. 1ª edición 1989.

España.
CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiología Industrial. Editorial Acribia S.A.
Zaragoza España. 3ª edición. 1989.

JAGNOW, Gerhard. Biotecnología “Introducción con experimentos modelo”.

Editorial Acribia S.A. Zaragoza España. 1991.
 Práctica No. 11
TRANSFORMACION BACTERIANA

INTRODUCCION

La transformación se puede definir como la variación hereditaria de una célula

bacteriana susceptible, originada por la captación de ADN desnudo libre en el
medio. Tras la transformación, la célula que ha recibido el ADN se suele
denominar transformante.

En los últimos años se ha logrado desarrollar sistemas artificiales para producir

"células competentes" en algunas de ellas (como Escherichia coli, Salmonella
typhimurium y algunas especies de Pseudomonas), lo cual ha hecho avanzar los
estudios genéticos, especialmente mediante manipulaciones in vitro: por ejemplo,
la transformación artificial de E. coli con ADN plasmídico es una de los métodos
básicos de la Ingeniería Genética.

La obtención de células competentes en E. coli consiste en ir concentrando un

cultivo recogido en fase logarítmica, mediante lavados sucesivos en una solución
fría (4ºC) de Cl2Ca, tras lo cual la mezcla de células y ADN se someten a unos 2
min. a 42ºC (choque por calor). Este tratamiento altera las envueltas (sobre todo
la membrana externa) y aumenta su permeabilidad al ADN. Los plásmidos entran
a la célula como moléculas de cadena doble intactas, mientras que los ADN
lineales, que entran de la misma forma, son degradados por nucleasas
citoplásmicas (RecBCD). Los transformantes se suelen seleccionar en base a la
resistencia a algún o algunos antibióticos conferidos por los plásmidos artificiales
usados en Ingeniería Genética.

OBJETIVOS

Producir células bacterias competentes para transformación

Transformar células de Escherichia coli con plasmidos que portan genes de

resistencia a antibióticos

A.- Preparación de células competentes.

1.- Tome con un palillo o punta de micro pipeta una sola colonia bacteriana e
inocúlela en un Erlenmeyer de 250 ml que contenga 30 ml de medio de cultivo
SOB.

2.- Incube toda la noche a 37°C con agitación moderada (150 o 200 rpm)
3.- Tome un mililitro de cultivo bacteriano que usted ha crecido toda la noche e
inocúlelo en un Erlenmeyer de 500ml que contenga 50ml de medio de cultivo
SOB. Incube a 37°C a 250 rpm, hasta que la densidad óptica a 550 sea de
aproximadamente 0.3.

4.- Colecte el cultivo bacteriano en dos tubos estériles de polipropileno de 50 ml y

enfrié en hielo por 15 minutos.

5.- Precipite las bacterias mediante centrifugación a 3000 X g (5000rpn utilizando

un rotor Sorval SS-34) por 15 minutos a 4°C. Elimine el sobre nadante con
cuidado de no eliminar el precipitado bacteriano.

6.- Adicione 8 ml de tampón de transformación 1 (16 ml por 50 ml de cultivo

inicial). Resuspenda el precipitado con agitación suave, puede utilizar un vortex.

7.- Incube los tubos en hielo por 15 minutos.

8.- Precipite las bacterias como se describió en el paso 5.

9.- Resuspenda el precipitado bacteriano en 2 ml de tampón de transformación 2.

Almacene a 4°C no mas de 4 o 5 horas antes de ser utilizadas.

10.- Las células competentes pueden ser almacenadas a -70°C hasta por dos
meses. Para congelar las células siga el siguiente procedimiento:

Adicione 70 ul de Dimetil sulfoxido (DMSO) por cada 2ml de células competentes.

Mezcle suavemente y almacene la suspensión en hielo por 15 minutos.

Adicione otros 70 ul de DMSO, agite suavemente y regrese la suspensión a un

baño de hielo.

Dispense 100 ul de suspensión de células competentes a tubos eppendorf ,

sumerja los tubos eppendorf con las células en nitrógeno líquido e
inmediatamente almacene en una nevera de -70°C hasta que las necesite.

B.- Transformación

1.- Si las células han sido congeladas, descongélelas en hielo.

2.- Adicione aproximadamente 20 ul de DNA plasmidico a la fracción de células

competentes y mezcle suavemente con una micropipeta.

3.- Incube las células en hielo por 40 minutos.

4.- Someta las células a choque térmico, introduciéndolas en un baño maría que
este a 42°C por 45 segundos. No agite las células.
5.- Adicione 1 ml de medio de cultivo SOB (sin antibiótico) a cada tubo con las
bacterias transformadas e incube a 37°C con agitación suave por 45 o 60
minutos.

6.- Sirva entre 100 a 200 ul de las bacterias transformadas del paso anterior sobre
cajas de petri con LB-agar suplementado con antibiótico (cuyo gen de resistencia
se encuentra presente solo en el DNA del plasmado). Incube los transformantes
toda la noche a 37°C y evalué el crecimiento bacteriano.

C. Medios de cultivo y tampones.

Medio de cultivo SOB (1 litro)

Bacto triptona 20.0 g

Extracto de levadura 5.0 g
NaCl 0.6 g
KCl 0.5 g
MgCl2 10 mM (Vea mas abajo)
MgSO4 10 mM (Vea mas abajo)

Disuelva triptona, extracto de levadura, cloruro de sodio y cloruro de potasio en un

volumen fina de 990 ml de H2O destilada (dH2O). Esterilice mediante auto
clavado.

Justo antes de utilizar, adicione 10 ml del stock magnesio (vea mas abajo) al
medio de cultivo SOB para producir un medio 20 mM con respecto al magnesio.

Medio LB agar(1 litro):

Bacto triptona 10.0 g

Extracto de levadura 5.0 g
NaCl 10.0 g

Agite hasta que los solutos se hayan disuelto completamente. Ajuste a pH 7.0
con NaOH 5N. Adicione 15 g de bacto – agar lleve a 1 litro y autoclave.

Tampón de Transformación 1 (500 ml)

RbCl 6.0 g
MnCl2·4H2O 5.0 g
Acetato de potasio 15.0 ml (1 M stock, pH 7.5)
CaCl2·2H2O* 0.75 g
Glicerol 75.0 ml
Combine los reactivos en dH2O. Ajuste a pH 5.8 con 0.2 M de ácido acético.
Lleve a un volumen final de 500ml con dH2O. Esterilice mediante filtración con
una membrana 0.22 µm. Almacene a 4°C.

Tampón de Transformación 2 (500 ml)

MOPS 10.0 ml (0.5 M stock, pH 6.8)

RbCl 0.6 g

CaCl2·2H2O* 5.5 g
Glicerol 75.0 ml
dH2O a 500.0 ml

Combine los reactivos en dH2O. Lleve a un volumen final de 500ml con dH2O.
Esterilice por filtración utilizando una membrana de 0.22 µm. Almacene a 4°C.

* Si utiliza CaCl2 anhidro, utilice 0.57 g para el Tampón 1, y 4.15 g para el

Tampón 2.

Stock 2 M Mg2+ (100 ml)

MgCl2 20.3 g
MgSO4 24.7 g

Disuelva los reactivos en un volumen final de 100 ml de dH2O. Esterilice por

filtración utilizando una membrana de 0.45 µm. La solución resultante es 2 M con
respecto al Mg2+.

MOPS 0.5 M (100 ml)

Disuelva 10.47 g MOPS en dH2O. Ajuste a pH 6.8 con NaOH. Lleve a un

volumen final de 100 ml. Esterilice por filtración utilizando una membrana de 0.22
µm. El Tampón MOPS debe ser claro y sin color.

Acetato de potasio 1 M (100 ml)

Disuelva 9.82 g de acetato de potasio en dH2O. Ajuste a 7.5 con ácido acético.
Lleve a un volumen final de 100 ml. Esterilice mediante autoclave.

Bibliografía:

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/25_Micro.html

Sambrook, J., Fritsch, EF., Maniatis, T. 1989 Molecular Cloning: A laboratory

Manual. 2nd Ed. Cold Spring harbor Laboratory Press. New York, USA
 Práctica No. 12

EXTRACCIÓN DE ADN (Ácido desoxirribonucleico)

INTRODUCCIÓN

La extracción de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad

posible del ADN de alto peso molecular, libre de proteínas, carbohidratos y
otros inhibidores de enzimas.

Diferentes métodos de extracción han sido descritos para el aislamiento de

ácidos nucleicos, aquí se trabajara específicamente con la extracción de AND
vegetal, la presencia de algunos metabolitos secundarios y como interfieren
estos en el aislamiento del ADN.

En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extracción,

es necesario degradarla empleando métodos físicos o químicos. Los métodos
físicos son los más empleados, especialmente la congelación y la maceración.
Para bacterias y células desprovistas de pared, se emplean soluciones ricas
en detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares.

Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y

soluciones de alta (o baja) fuerza iónica para permitir que el ADN se libere en
el buffer.

La inhibición de nucleasas es un factor critico, esta se alcanza empleando

buffer1 con pHs poco óptimos para acción de estas enzimas y adicionando
agentes quelantes de iones como el EDTA (Ethylen diamin tetre acetato).

Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las

proteínas del ADN como fenol y cloroformo. Finalmente en ADN es
precipitado con alcohol y centrifugación. El ADN libre de proteínas y otros
compuestos celulares se disuelve en un buffer2 .

Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacáridos, para

separarlos de los ácidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer
extracción o sustancias como CTAB ( cetil trimethyammonium) que colabora
en la precipitación del ADN.

El pH durante el proceso de extracción debe ser óptimo, que evite la acción de

enzimas degradativas del ácido nucleico. La mayoría de los procedimientos
de extracción de ADN emplean soluciones taponadas con pH 7.0-9.0.

Para cuantificación del ADN se hace uso de la espectrofotometría

(absorbancia a una longitud de honda de 260nm), o la observación directa con
fluorescencia después de teñir el gel de extracción con bromuro de
etidio.(método de saram wrap, método del plato de agarosa, método del mini-
gel) o por fluorometria.

OBJETIVO

Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena

calidad y alta pureza.

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

Material del que se extrae el DNA ( se recomienda utilizar material fresco),

bisturí, mortero, balanza analítica, tubos de ensayo con tapa, centrífuga
refrigerada, baño agua (60 °C), pipetas de 5 ml, micropipetas y puntas, tubos
eppendorf, espectrofotómetro.

Buffer 1

• 50mM Tris-HCl (pH8.0)

• 5mM EDTA
• 350mM Sorbitol
• 0.1% Mercaptoetanol
• 10% polyetilienglicol

Buffer 2

• 50 mM Tris- HCl (pH 8.0)

• 5 mM EDTA
• 350 mM Sorbitol
• 0.1% Mercaptoetanol
• 1% Sodio Sarkosyl
• 710 mM NaCl
• 0.1% Cetiltrimetilamonio. (CTAB)

Otros reactivos

Cloroformo, alcohol Isoamilico, iIsopropanol, etanol 70%

PROCEDIMIENTO No. 1

• Pesar 70mg del tejido, llevarlo a mortero y macerar.

• Agregar 1ml de buffer1por cada 70mg de la muestra
• Agitar
• Centrifugar a 5000 rpm /10min en frió a 4°C
• Descartar sobrenadante
• Resuspender sólido agregando 500µl del buffer2 por cada 70mg de la
muestra.
 • Incubar a 60 °C por 15 minutos
• Adicionar un volumen de cloroformo: alcohol isoamilico en una
proporción 24:1
• Centrifugar a 5000rpm/10mit
• Transferir la fase acuosa a otro tubo
• Agregar 2 volúmenes de isopropanol frió -20 °C (para precipitar el ADN)
• Centrifugar y eliminar el Alcohol (isopropanol)
• Lavar con Etanol 70%
• Centrifugar y eliminar el Alcohol (etanol)
• Resuspender el precipitado en 300µl de Tris-Edta, agitar suavemente.
• Leer espectrofotómetro a 260nm. (50µg/ml ADN absorbancia de 1)

Nota: Para saber que tan puro es el ADN obtenido realizamos la siguiente
relación

ADN/Proteina =260nm/280nm

Un valor menor de 1.8 indica contaminación por proteínas.

MINIPREPARACION DE DNA PLASMIDICO

INTRODUCCION
Por lo general, los plásmidos son purificados a partir de cultivos (Crecidos en
medio líquido que contienen el antibiótico apropiado) que han sido inoculados con
una colonia bacteriana, tomada de un plato de agar. Muchos de los plásmidos
comúnmente utilizados, se replican a muy altas tasas y pueden ser purificados en
grandes cantidades a partir de bacterias transformadas que alcanzan la fase
logarítmica del crecimiento, en medio líquido.

Las bacterias se recuperan por centrifugación y son lisadas por uno de varios
métodos, incluyendo tratamiento con detergentes iónicos y no iónicos, solventes
orgánicos, álcali o calor. En la presente práctica utilizaremos el método de lisis
alcalina para la preparación de DNA plasmídico, debido a su facilidad de
implementación, rapidez y las altas cantidades de DNA obtenido.

OBJETIVO

Obtener DNA plasmídico de alta calidad a partir de cultivos bacterianos.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Tome con un palillo o punta de micropipeta una colonia bacteriana e inocúlela

en un tubo falcón de 50 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo LB
suplementado con 50 ug/ml de ampicilina. Ponga el cultivo en agitación a 250
RPM y 37oC toda la noche
2. Centrifugue 1.5mL del cultivo bacteriano crecido toda la noche a 12000 rpm por
1 minuto. Retire el sobrenadante.

3. Resuspenda el precipitado de células bacterianas en 100 ul de tampón GTE

(50 mM Glucosa, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8). Mezcle hasta que el
precipitado quede totalmente disuelto, utilice un vortex si es necesario.

4. Adicione 200 ul de solución de lisis (0.2 M NaOH, 1% SDS). Invierta el tubo

unas 6 a 8 veces.

5. INMEDIATAMENTE adicione 150 ul de una solución 5M de acetato de potasio

pH 4.8. Esta solución neutraliza el NaOH utilizado en el paso previo de lisis
precipitando simultáneamente el DNA genómico y el SDS. Centrifugue a 12000
rpm por 1 minuto.

6. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf, teniendo especial

cuidado en no remover el precipitado blanco. Precipite los ácidos nucleicos
utilizando un volumen de isopropanol e incubando en hielo por 10 minutos.
Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto.

7. Retire el sobrenadante de isopropanol y coloque con cuidado el tubo

eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe
asegurarse que todo el isopropanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado
en 400 ul de tampón TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Adicione 10ul de
solución de RNAse A (Stock de 20 mg/ml almacenado a -20 °C), agite e incube a
37 °C por 20 a 30 minutos para digerir todo el RNA.

8. Extraiga las proteínas de la solución que contiene el DNA del plasmido

utilizando un volumen igual de FCI (fenol/cloroformo/alcohol isoamilico). Agite
vigorosamente por 30 o 60 segundos. Centrifugue a 12000 rpm a temperatura
ambiente. Observe que la fase orgánica de FCI se localiza en la parte baja del
tubo eppendorf.

9. Remueva la fase acuosa (superior) que contiene el DNA del plasmado,

cuidadosamente, sin alterar la interfase blanca que se encuentra por encima de la
fase orgánica de FCI y transfiérala a un tubo limpio de 1.5 ml.

10. Para precipitar el DNA del plasmado, adicione 100 l de acetato de amonio
7.5 M y 1 ml de etanol, incube a -20°C por 15 minutos. Centrifugue a 12000 rpm
por cinco minutes a temperatura ambiente.

11. Retire el sobrenadante de etanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf

boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que
todo el etanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado de DNA en 50 ul de
Tampón TE. Corra una electroforesis en gel de agarosa al 1% y observe el DNA
del plasmido.
Para cuantificar el DNA realice una dilución 1/200 y lea la absorbancia a 260nm.

Medio LB agar(1 litro):

Bacto triptona 10.0 g

Extracto de levadura 5.0 g
NaCl 10.0 g

Agite hasta que los solutos se hayan disuelto completamente. Ajuste a pH 7.0
con NaOH 5N. Autoclave por 20 o 30 minutos.

Solución GTE

Solución stock volumen concentración final

Glucosa estéril 40% 2.27 ml 50 mM

EDTA 0.5 M, pH 8 2.0 ml 10 mM
Tris-HCl 1M, pH 8 2.5 ml 25 mM
ddH2O estéril 93.23 ml
Total 100.0 ml

Utilice todas las soluciones stock estériles. Almacene a 4°C.

Solución de lisis NaOH/SDS

Solución stock volumen concentración final

NaOH 1N 2.0 ml 0.2 N

SDS 10% 1.0 ml 1%
ddH2O estéril 7.0 ml
Total 10.0 ml

Solución de acetato de potasio 5 M.

Solución stock volumen

Acetato de potasio 5 M 60 ml
Ácido acético glacial 11.5 ml
ddH2O 28.5 ml
Total: 100 ml

Esterilice con filtro. La solución resultante es 3 M de potasio y 5 M de acetato y

tiene un pH aproximado de 4.8.

Tampón TE : Tris-Cl 10 mM, pH 7.5 + EDTA 1 mM

Se deben tener soluciones stock de Tris-Cl 1M (pH 7.5) y 500 mM de EDTA (pH
8.0).

GLOSARIO

ADN: Ácido desoxirribonucleico (ADN), material genético de todos los

organismos celulares y casi todos los virus. El ADN lleva la información
necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la replicación.

Tris: (hidroximetil amino metano) Es un tampón biológico. Su principal función

es mantener el pH de la solución estable (7.0 8.0).

EDTA: (Etilen diamino tetra acético) Es un agente quelante. Se encarga de

remover iones de magnesio que son esenciales para preservar l estructura de
la envoltura celular.

Cloroformo: Solvente orgánico que se encarga de remover residuos de

lípidos y fenoles en la muestra. Colabora en la desnaturalización de proteínas.

CTAB: cetil trimetil bromuro de amonio, detergente cationico que solubiliza las
membranas celulares, dependiendo de la concentración de cloruro de sodio en
la solución, permite la remoción de polisacáridos y otras macromoléculas. El
CTAB forma un complejo con el ADN y por lo tanto puede ser empleado para
precipitar ADN selectivamente.

Cloruro de sodio: colabora para equilibrar las fuerzas iónicas.

Mercaptoetanol: Antioxidante. Forma enlaces disulfuro, forma disulfuros

mixtos con las cadenas laterales de las proteínas. Evita color pardo en ADN
extraído.

Alcohol Isoamilico: Antioxidante. Reduce o imposibilita la formación de

interfases durante la extracción de ADN.

Etanol, Isopropanol: Alcoholes. En presencia de sales (temperatura de

aproximadamente –20 °C ) precipita ADN, reduciendo la constante dieléctrica
del solvente.

BIBLIOGRAFÍA

Perea Arango Irene, Pineda Tuirán Rosana, Arango Isaza Rafael, MANUAL
DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. 2002 U de A pg 11-16

Plant Tissue Culture and Biotechnology . June 1998 vol 4 N° 2 pg 76 -79

Sambrook, J., Fritsch, EF., Maniatis, T. 1989 Molecular Cloning: A laboratory

Manual. 2nd Ed. Cold Spring harbor Laboratory Press. New York, USA.
 Práctica No. 13
Electroforesis de DNA y de proteínas

Introducción:

Electroforesis es la migración de las moléculas cargadas presentes en una

solución acuosa como respuesta a la presencia de un campo eléctrico, dichas
moléculas son atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Dos fuerzas de
acción opuesta determinan la velocidad de la partícula en cuestión. Por un lado, la
fuerza eléctrica, que la atrae al electrodo, cuya intensidad es directamente
proporcional a la carga, y, de acuerdo a la segunda ley de Newton (F=m x a,
entonces a=F/m), le impone una aceleración directamente proporcional al
cociente carga/masa (q/m). Por otro lado, la fuerza de rozamiento, que se opone a
la migración con una intensidad que depende del tamaño y la forma de la
partícula y de las características del medio (viscosidad y estructura, por ejemplo).

La electroforesis se utiliza en el laboratorio para separar macromoléculas en

solución, en forma analítica (es decir, sólo para verlas) o preparativa (para
purificarlas). Los ácidos nucleicos tienen un fosfato cargado negativamente por
nucleótido. Como el peso molecular de los cuatro nucleótidos es similar, la
relación q/m es independiente de la secuencia y el tamaño de la molécula. Por lo
tanto la aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para cualquier
molécula de ácido nucleico. La única diferencia en velocidad de migración estará
dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea de su forma y de su
tamaño. En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier
molécula, entonces las distintas moléculas tendrán una velocidad que sólo
dependerá de su tamaño, es decir, de su longitud en pares de bases. Sin
embargo, si tratáramos de separar moléculas de DNA doble cadena en una
electroforesis en una solución acuosa, nos encontraríamos con que el rozamiento
impuesto por ésta es tan pequeño que todas las moléculas migrarían juntas.
Además, durante la electroforesis, las moléculas se separarían unas de otras por
difusión, impidiendo el análisis. Para lograr una separación eficiente, se utiliza un
medio soporte que aumente considerablemente la fricción recibida por las
macromoléculas y reduzca la difusión a un mínimo. Este medio suele ser una red
molecular de algún polímero orgánico, conocida como gel, por su consistencia
gelatinosa. Los más utilizados en laboratorios de biología molecular son de
poliacrilamida, una red molecular estabilizada por uniones covalentes, y agarosa
(un derivado del agar-agar), un polisacárido extraído de un alga que forma, al
disolverlo, una red estabilizada por interacciones no covalentes. Las mezclas de
DNAs de distinto tamaño se hacen migrar (desplazarse) a través del gel durante
un cierto tiempo y se obtiene una separación en la que la distancia migrada por
una molécula dada es inversamente proporcional al logaritmo de su peso
molecular (o de su longitud en pares de bases). El tamaño de una muestra
desconocida puede estimarse corriendo en paralelo muestras de longitud
conocida.
Cuando se hace un análisis electroforético de muestras de ácidos nucleicos que
no poseen todos la misma forma, debido, por ejemplo, a la presencia de
estructuras secundarias que dependen del apareamiento interno, o sea, de la
secuencia (RNA o DNA simple cadena), es necesario, para determinar su peso
molecular, homogeneizar su estructura. Para ello se utilizan agentes
desnaturalizantes fuertes que destruyan la estructura secundaria, por ejemplo
urea, formamida, formaldehído o pH básico (para DNA).

En el caso de las proteínas el problema es más complejo porque no sólo distintas

moléculas de igual tamaño (peso molecular) tienen formas distintas sino que
además la carga (y con ella el q/m) varía mucho de una a otra, además, como son
compuestos anfotéricos, su carga neta está determinada por el pH del medio en
que se encuentren, en una solución con un pH superior a su punto isoeléctrico
estarán cargadas negativamente y en un campo eléctrico migrarán hacia el
ánodo(+) pero si el pH del medio es inferior a su punto isoeléctrico, migrarán hacia
el cátodo(-). Para igualar la relación q/m y la forma de todas ellas se utiliza un
detergente cargado negativamente, el dodecil sulfato de sodio (SDS), que las
desnaturaliza y las recubre en cantidad proporcional al tamaño, proveyéndoles un
gran número de cargas que hacen que las propias sean despreciables y que el
q/m de todas las moléculas se equipare. El SDS envuelve al polipéptido en una
relación de masas 1,4:1 y el polipéptido queda cargado negativamente con una
carga proporcional a su longitud. Usualmente es necesario reducir los puentes de
disulfuro de las proteínas para permitir la unión cuantitativa del SDS, esta
reducción se lleva a cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. Sólo en estas
condiciones es posible determinar el tamaño de un polipéptido en un gel, en el
que tendrá una migración inversamente proporcional al logaritmo de su peso
molecular.

Objetivo general:
Preparar, realizar una electroforesis de DNA en gel de agarosa y otra de proteínas
en gel de poliacrilamida e interpretar los resultados.

Procedimiento experimental:

Reactivos para electroforesis de DNA en gel de agarosa:

Buffer Tris-borato (TBE) pH 8.0 sln 5x: Preparación: Disolver 54g de Tris base,
27,5g de ácido bórico, 20mL de una solución de EDTA 0.5M ajustar pH y ajustar
volumen a 1L, guardar en frasco ámbar bajo refrigeración.

Preparación del molde para preparar un gel horizontal: Sobre una placa de vidrio
limpia y desengrasada de tamaño adecuado haga un marco con cinta de
enmascarar para que quede con una profundidad de mínimo 7mm teniendo la
precaución de que quede bien sellado.

Preparación del gel de agarosa: Preparar una solución de agarosa al 0.8% en

buffer TBE. Agregar la cantidad adecuada de agarosa en polvo al volumen de
buffer TBE medido, calentar hasta que la agarosa se disuelva (quede translúcida
la solución). Verter la solución en caliente sobre el molde previamente preparado
y colocar la peineta sin traspasar el gel; es decir, teniendo la precaución que los
dientes que formarán los posuelos queden a una distancia de 0,5-1 mm por
encima de la base del gel para que los posuelos queden completamente sellados.

Después de que el gel se enfríe y solidifique, retire cuidadosamente la peineta y la

cinta de enmascarar con la que hizo el molde del gel y coloque el gel en el tanque
de electroforesis.

Agregue suficiente buffer TBE para cubrir el gel 1mm por encima de su parte
superior.

Mezcle las muestras de DNA que están suspendidas en TE con buffer de carga
(una solución de sacarosa al 40% con azul de bromofenol al 0.25% preparado en
agua) en una proporción 1:1.

Coloque lentamente las muestras mezcladas con el buffer de carga en los

posuelos dentro del gel de agarosa con la ayuda de una micropipeta.

Complete el montaje teniendo la precaución de que el polo positivo este al lado

opuesto del sitio de siembra, aplique la corriente eléctrica (3-5V/cm) hasta que el
color haya migrado casi hasta el final del gel (unos 10cm), suspenda la corriente
eléctrica, retire el gel y sumérjalo 45 minutos en una solución con bromuro de
etidio (en buffer o agua) con una concentración de 0,5 µg/mL.

Tenga la precaución de usar guantes cuando manipule el gel o las soluciones ya

que el bromuro de etidio es un poderoso mutagénico.

Coloque luego el gel sobre un transiluminador ultravioleta (UV) y observe las

bandas de DNA protegiendo los ojos de la radiación UV.

Reactivos para electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida:

Precaución, la acrilamida y bisacrilamida como monómeros son potentes

neurotoxicos acumulativos que se absorben rápidamente por la piel, no pipetear
con la boca ni manipular las soluciones sin usar guantes.

Buffer Tris-HCl pH 8.9 (solvente para poliacrilamida y persulfato de amonio):

Preparación: Disolver 36.6 g de Tris(hydroxymethyl)-aminometano p.a. (V-12) en
850 mL de agua destilada, ajustar pH y ajustar volumen a 1 L, guardar en frasco
ámbar bajo refrigeración.
Preparación de los geles:

Gel de corrida (Sln. 1A):

Para 50 mL: 9,2 g de acrilamida, 0,184 g de bisacrilamida y llevar a 50 mL con

buffer Tris-HCl, mezclar bien, filtrar y empacar en frasco ámbar bajo refrigeración.

Gel de separación (Sln. 1B):

Para 50 mL: 4,2 g de acrilamida, 0,184 g de bisacrilamida y llevar a 50 mL con

buffer Tris-HCl, mezclar bien, filtrar y empacar en frasco ámbar bajo refrigeración

Solución de persulfato (Sln. B):

Para 50 mL: 0,125 g de persulfato de amonio, llevar a 50 mL con buffer Tris-HCl,
mezclar bien, no filtrar y empacar en frasco ámbar bajo refrigeración.

Buffer Tris-Borato pH 8.8 (para los tanques):

Para 1 L: 7,86 g de Tris(hydroxymethyl)-aminometano p.a. (V-12), 1.925 g de
ácido bórico p.a. (AC-3). Disolver el Tris en 600 mL de agua destilada, agregar el
ácido bórico hasta disolverlo completamente, ajustar a volumen de 1L con agua
destilada, mezclar bien y guardar bajo refrigeración.

Colorante (Amido Black) (150 mL):

1 g de Amido Black, 15 mL de ácido acético, 67 mL de metanol y 67 mL de agua
destilada.

Preparación de los geles de poliacrilamida para electroforesis de proteínas:

Seguir las instrucciones del docente o técnico del laboratorio para ensamblar el
montaje.

Gel de corrido:
10 mL de Solución 1A, 10 mL de solución B y 40 µL de TEMED, mezclar y
rápidamente verter entre las placas de vidrio, agregar un poco de agua en la
superficie para evitar el contacto con el aire, dejar polimerizar o gelificar.

Gel de separación:
3 mL de solución 1B, 3 mL de solución B y 20 µL de TEMED, mezclar y
rápidamente verter entre las placas de vidrio sobre el gel de corrido habiendo
retirado previamente el agua, colocar la peineta del tamaño adecuado para formar
los posuelos evitando la formación de burbujas. Dejar polimerizar o gelificar y
retirar la peineta con precaución para no dañar el gel, inmediatamente lavar los
posuelos con agua.

Preparación de las muestras:

10 µL de plasma o suero y 10 µL de una solución de sacarosa al 40% con azul de
bromofenol al 0.25%, mezclar.
Terminar de ensamblar el montaje, agregar suficiente buffer Tris-Borato pH 8.8
para cubrir los posuelos. Con la ayuda de una jeringa colocar las muestras en los
posuelos, complete el montaje teniendo la precaución de que el polo positivo este
al lado opuesto del sitio de siembra, aplique la corriente eléctrica hasta que el
color haya migrado casi hasta el final del gel, suspenda la corriente eléctrica,
retire el gel y sumérjalo al menos una hora en la solución de colorante Amido
Black, luego desteñir el gel sumergiéndolo en una solución de metanol al 20% en
agua y acido acético al 10%. Observar las bandas de proteínas de color azul
oscuro.

Referencias:

Maniatis, T, Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular Cloning - A Laboratory Manual.

Seventh impression. Cold Spring Harbor Laboratory. pp. 150-185. United States of
America, 1982. ISBN: 0-87969-136-0

Perea, I., Pineda, R., Arango, R. Manual de Técnicas de Biología Molecular.

Posgrado en Biotecnología. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín.
2002

Corzo, J. Curso de doctorado “Electroforesis”. Departamento de Bioquímica y

Biología Molecular, Universidad de la Laguna. España, 2004. Tomado de:
http://webpages.ull.es/users/fcorzo/electroforesis/listado.htm

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida. Métodos en Biología Celular.

Universidad de Barcelona. 2004. Tomado de:
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm

López, C. Electroforesis de proteinas del suero humano en gel de poliacrilamida

bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Universidad de Antioquia,
departamento de Química, Laboratorio de Cromatografía CNQ-533. 2004.
Tomado de: http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/cnq533g.html

Electroforesis de dna plasmídico en gel de agarosa. 2004. Tomado de:

http://orbita.starmedia.com/~animalia/cosas/3electroforesis.htm

Electroforesis de ácidos nucleicos en gel. Diagramas animados de técnicas y

procesos bioquímicos. Complementos de Bioquímica y Biología Molecular.
Universidad de Alcalá. España. 2004. Tomado de:
http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/elfo/electrof_txt.htm

Electroforesis en geles de agarosa. Introducción a la Biología Molecular y Celular.

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular, Universidad de Buenos
Aires. Argentina. 2004. Tomado de: http://therion.dna.uba.ar/ibmc/Agarosa.htm
 Práctica No. 14
Esterilización

Microorganismo: Saccharomyces cerevisae

Introducción
El control de microorganismos mediante procesos de esterilización, tiene especial
importancia en el laboratorio, dado que la escogencia del método a utilizar y del
material a procesar me definen la eficacia del proceso de eliminación microbiana
y por ende garantizan la no contaminación de muestras o cultivos, hechos
fundamentales en la validez de un resultado en el laboratorio.

Marco Teórico
• Agentes físicos: Los factores ambientales como son la temperatura y la
humedad son fundamentales para el desarrollo de bacterias, de forma tal que
la alteración del de este ambiente causa inhibición o muerte de los
microorganismos. Se cuenta actualmente con diferentes agentes físicos para
el control de microorganismos en la industria y en el área de la salud, los más
usados son: calor seco y húmedo, radiación, y filtración.

• Calor húmedo – Autoclave: El calor como vapor a saturación y a presión

ejerce acción bactericida incluyendo la destrucción de esporas, este es el
método de esterilización mas utilizado dado que ofrece las ventajas de mayor
capacidad de penetración y distribución homogénea en el recipiente de
esterilización (autoclave), este calor a presión actúa desnaturalizando las
proteínas, ácidos nucleicos y fragmentando las membranas celulares. Se
recomienda la utilización de este método para la esterilización de material
contaminado y de medios y soluciones siempre y cuando este proceso no
altere su naturaleza. Algunos materiales no deben someterse al acción de la
autoclave, entre ellos sustancias que no se mezclen con agua como grasa y
aceite por su dificultad de penetración, algunos medios de cultivo lábiles a
altas temperaturas y materiales plásticos y metálicos que pueden deteriorase;
en el caso de los medios de cultivo sensibles a calor se ha utilizado la
esterilización fraccionada o filtración.

• Radiaciones: Las ondas electromagnéticas, acústicas o de partículas

subatómicas producen daño en el material genético de la bacteria que puede
causar su muerte, este es el método de esterilización en frío, se utiliza mas
frecuentemente en la industria de alimentos y en la farmacéutica. La luz
ultravioleta emplea lámparas en la que se emite a una longitud de onda entre
30 y 40 nanómetros, estas radiaciones son absorbidas por el ácido nucleico de
 la bacteria y por lo tanto tiene acción letal, el uso mas amplio de este método
es en salas de quirófano, medios de cultivo y en cámaras de bioseguridad en
el laboratorio.}

Loas rayos X son letales para las células microbianas y los seres vivos
superiores, por su alto costo y mala difusión de las radiaciones que afectan al
usuario son de poco uso en el control microbiano.

Los rayos gama tienen mucha energía y poder de penetración, son emitidos
por isótopos radioactivos como el Co60 , son letales para todas las formas de
vida, se ha utilizado alimentos empacados pero su uso en el área hospitalaria
es limitado a algunos procedimientos de diagnóstico.

Los rayos catódicos o haz de electrones son microbicidas a velocidades

extremas, se usan parea esterilizar material quirúrgico, drogas o otros
materiales tienen como ventaja que estos pueden esterilizarse después de
empacados a temperatura ambiente.

Objetivos
Comprender el fundamento del método de esterilización físico: calor a vapor
presión, su importancia y utilidad dentro de procesos industriales.
• Aprender el funcionamiento básico del autoclave.
• Comprender el fundamento y utilidad de la LUV.
• Evaluar y analizar el comportamiento del medio líquido preparado y
esterilizado, así también el medio: PCA expuesto a LUV y cámara de flujo
laminar más incubación a 37° C; y exposición a ambiente.

Materiales

• Agua destilada
• Cajas de petri con medio servido (PCA)
• Cajas de petri sin medio
• Reactivos
Medio melaza: Extracto de levadura y melaza (realizar los cálculos)
 Práctica No. 15
CULTIVO Y MANEJO DE MICROORGANISMOS

En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mínimos para

el manejo de microorganismos. Sobra decir que todo microorganismo en el
laboratorio se debe manipular como si este fuera potencialmente perjudicial para
la salud.
En la práctica cuando se manipulan microorganismos provenientes de muestras
ambientales se debe tener especial cuidado en no perder microorganismos en las
diferentes etapas de aislamiento, como tampoco permitir la contaminación.

Marco Teórico

Microorganismos: La observación de los microorganismos se valora en dos

aspectos ; el aspecto microscópico en el que se evalúa color , forma y tamaño
de las colonias, y, el aspecto microscópico en el que se evalúa la forma ,el
tamaño y propiedades de la pared del microorganismo como tal Estas
apreciaciones le permitirán al microbiólogo determinar aspectos como:

Pureza del cultivo, ya que las colonias observadas deben ser de un solo tipo y la
morfología microscópica debe presentar uniformidad en el tamaño, absorción de
la coloración y forma de los microorganismos evaluados

Composición de la pared, ya que la coloración de gram utilizada para la

observación microscópica, da cuenta de los componentes presentes en la pared
celular; puesto que al ser negativa el microorganismo en esta tendría mayor
porcentaje de lipopolisacaridos, mientras que al ser positiva, indicaría que el
microorganismo en esta estructura presenta mayor porcentaje de péptidoglicanos.

Viabilidad, dado que la observación en fresco, permite ver el movimiento

microbiano.

Preparaciones
Preparaciones no coloreadas: Con este método se observan los
microorganismos vivos, lo que permite detectar el tipo de movilidad y la viabilidad
de los mismos.

Preparaciones coloreadas: Como los microorganismos son incoloros y tienen el

mismo índice de refracción del agua, es necesario utilizar colorantes para
poderlos visualizar. Los métodos para observar los microorganismos proporcionan
las siguientes ventajas:
***Un contraste entre la bacteria y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar
los tipos morfológicos microbianos.
*** Una visualización de las estructuras internas y externas tales como. Espora,
equivalente nuclear, gránulos citoplasmáticos, pared celular, cápsula y flagelo.
Una de las coloraciones mas utilizadas en el laboratorio, para la identificación de
microorganismos es la coloración de Gram, por tal razón se verá en detalle.

Coloración de Gram
La coloración de Gram es un método que ha permitido la división de las bacterias
en dos grupos: El de gram positivas y el de las gram negativas. La técnica esta
basada en la capacidad de las bacterias para retener el colorante cristal violeta
durante la decoloración con el alcohol acetona.

Las bacterias gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo
el color púrpura propio del cristal violeta.

Las bacterias gram positivas no se decoloran y retiene el color violeta. Después

de la decoloración, se utiliza la safranina , que es un colorante de contraste de
color rojo, dicho colorante da un color rosado a las células decoloradas.

Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de peptidoglicano como
estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmática, y las Gram
negativas, encima de ésta, presentan una delgada capa de peptidoglicano, a la
que se superpone una capa de lipopolisacáridos-lipoproteína, denominada
membrana externa. La presencia de esta membrana diferencia actualmente dos
divisiones en sistemática bacteriana: las que no lo poseen, Gram (+) y las que sí,
Gram (-). La diferencia entre ambos grupos es pues de enorme importancia
taxonómica. En el comportamiento como patógenos y en la sensibilidad
antibacteriana difieren sustancialmente; de ahí que la realización rápida de una
coloración de Gram, reviste enorme importancia en los procesos biotecnológicos y
en la bacteriología clínica.

Medios de cultivo
Un cultivo microbiológico, puede realizarse para diferentes fines, por ejemplo:
aislamiento e identificación de una bacteria, pruebas de esterilidad de diferentes
productos, análisis microbiológico de aguas, alimentos ambientes etc.
Estos pueden denominarse como sustratos sobre los cuales los microorganismos
encuentran los elementos nutricionales necesarios para realizar su metabolismo
en forma similar a como lo hacen cuando se encuentran en la naturaleza.
En ellos las bacterias crecen y se reproducen dando como resultado la formación
de colonias en los medios sólidos y enturbiamiento, grumos, natas, velos o
producción de gas en los líquidos
Muestreo y Cultivo de Microorganismos:
En el caso del muestro de microorganismos, se debe tener en cuenta la fuente de
la cual se va a extraer, es decir si el medio en el que se encuentran corresponde a
un suelo, a una corriente de agua o a un alimento en especial, esto con el fin de
utilizar medios de cultivo similares al hábitat natural de la bacteria para de esta
forma garantizar su recuperación, la cual se constituye como el primer paso
dentro de un muestreo convencional.
Posteriormente se pasa a analizar los tipos de microorganismos obtenidos, esto
se logra con técnicas de aislamiento y selección.
En el aislamiento simplemente lo que se busca es obtener colonias separadas
con el fin de evaluar sus características macro y microscópicas y finalmente, si se
considera de interés proceder a su purificación y crioconservación. Lo anterior
puede realizarse mediante la siembra en medios específicos de las diluciones
seriadas del material que se cree, presenta los microorganismos buscados. El
número de diluciones depende de la carga microbiana, a mayor carga, mayor
será el número de diluciones a efectuar.
En la selección, se hace lo mismo que en el aislamiento, la diferencia es que se
emplean medios de cultivo selectivos, los cuales permiten el crecimiento de un
tipo de microorganismos e inhiben el desarrollo de otros, lo que facilita la
separación del mismo. Este procedimiento se efectúa, cuando se conoce tanto el
microorganismo como su metabolismo como tal, dado que por lo regular la
selectividad de este tipo de medios radica en la presencia de antibióticos o
reactivos que suelen ser tóxicos, por lo que la elección del medio depende de las
características del agente microbiano con el que se desea trabajar.
Luego de aislado y /o seleccionado, la bacteria, moho o levadura, debe ser
purificado, se parte de la premisa que una colonia, es un conjunto de células que
provienen de una misma célula madre, por lo tanto debe garantizarse lo anterior
sometiendo a tal colonia a evaluaciones macroscópicas (uniformidad en las
características) y microscópicas (que la totalidad de las estructuras observadas
presenta la misma forma, apetencia tintorial y agrupación).
En caso de que pueda realizarse la purificación, se pretende aumentar la biomasa
del microorganismo, para lo que se hace crecer en un medio de enriquecimiento
que estimule su crecimiento y finalmente se pasa a crioconservación, mediante
técnicas como la de nitrógeno líquido ó conservación en glicerol.

Objetivos

• Mostrar al alumno las diferentes técnicas de manipulación de

microorganismos, para lo cual se partirá de un pool de tres microorganismos
(E. coli, Saccharomices. c y Bacillus sp).
• Sembrar en medio PCA la suspensión con el contenido de los tres
microorganismos (E. coli, Saccharomices. c y Bacillus sp.)
• Observar y describir las características morfológicas de las colonias.
Materiales

• Cajas de petri con PCA

• Colorantes para Gram
• Mecheros
• Micropipetas de 100 y 1000 ul
• Pipetas de vidrio de 10 ml estériles
• Puntas para pipetear de 200 y 1000 ul estériles
• Solución salina y/o solución peptonada estériles
• Suspensión con microorganismos
• Tubos tapa rosca estériles
• Tubos con perlas de vidrio estériles

Procedimiento

Para el cultivo:

• Tome 1 ml de la suspensión suministrada

• Realice las diluciones: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 con solución salina
estéril.

1 2 3 4 5 6
1:10 1:100 1:1000 1x104

™ Lleve 9 ml de agua peptonada o solución salina a todos los tubos.

™ Agregue 1 ml de la suspensión que contiene los microorganismos al tubo uno
y agite en el vortex.
™ Del tubo uno sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 2, agitar.
™ Del tubo dos sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 3, agitar
™ Repita el procedimiento hasta completar el tubo 6

• De cada dilución tome 100 ul y agréguelos a la caja de petri

• A cada caja agregue entre 15-20 perlas de vidrio y realice un movimiento
circular para dispersar todo el contenido agregado.
• Incube por 16 horas a 37°C, (observe al día siguiente)

• Observe la morfología de las colonias a nivel microscópico y descríbalas

según: Tamaño, color y forma.
Para coloración de gram:

• Tome colonias separadas de acuerdo a su morfología y realice coloración de

gram.
• Describa su forma (cocos, bacilos, espiral), el tipo de agrupación y clasifíquela
según la absorción de la coloración en gram+ ó en gram -.

Práctica No. 16
DEGRADACIÓN DE COLORANTES CON HONGOS
LIGNINOLÍTICOS

INTRODUCCION
Existe una gran cantidad de organismos (bacterias y hongos) degradadores de
celulosa y hemicelulosa, pero muy pocos con la capacidad de desdoblar la ligina;
de hecho, los únicos con la capacidad de hacerlo son un grupo de basidiomicetes
poseedores de un complejo enzimático compuesto por enzimas oxidasas y
peroxidasas, que al catalizar las primeras reacciones pueden generar moléculas
más pequeñas que se incorporan a los ciclos metabólicos del organismo. Entre
las peroxidadas, las mas importantes en la mineralización de la lignina son la
lignina peroxidasa (LiP), la manganeso peroxidasa (MnP), y peroxidasa versátil
(PV). MnP y PV tienen un grupo hemo como cofactor y emplean H2O2 como
primer aceptor de electrones, mientras que la LiP puede oxidar directamente
sustratos aromáticos no fenólicos, como el alcohol veratrílico. La MnP puede
oxidar sustratos del tipo fenólico a través de Mn2+ pero también puede hacerlo con
aquéllos del tipo no fenólico a través de los productos de peroxidación de ácidos
grasos insaturados, mientras que la PV comparte las propiedades catalíticas con
las descritas anteriormente, pues puede oxidar el Mn2+ a Mn3+ (como lo hace la
MnP) y también oxida compuestos no fenólicos (como lo hace la LiP), La lacasa
es una oxidasa ampliamente distribuida entre los hongos de pudrición blanca con
cuatro átomos de cobre como cofactor y cuyo aceptor de electrones es el O2
dando agua como producto. La enzima oxidada ataca principalmente sustratos
fenólicos, pero en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (1-HBT), 2,2’-azinobis [ácido
3-etilbenzothiazoline- 6-sulfónico] (ABTS) o ácido violúrico [10,11] éstos actúan
como cooxidantes y capacitan a la enzima para atacar sustratos menos oxidables
como los de tipo no fenólico.

Los colorantes sintéticos son ampliamente utilizados en muchas industrias (textil,

papel, cosmética, farmacéutica y alimentaria), por su fácil uso, bajo costo y alta
estabilidad, sin embargo, algunos estudios sugieren que estos colorantes
pueden ser tóxicos, carcinógenos y generadores de reacciones alérgicas y
asmáticas en personas susceptibles. Adicionalmente, estos colorantes no son
removidos por los tratamientos tradicionales de manejo de aguas residuales y por
ello, en muchos países se utilizan microorganismos degradadores que separan
los enlaces azo de su respectivo azocolorante y produce la decoloración de los
productos. Para este fín, los microorganismos generalmente emplean su sistema
ligninolítico, compuesto por enzimas oxidativas producidas en respuesta a la
limitación de nutrientes, y con poca especificidad por el sustrato como la
Ligninaperoxidasa (LiP), la Manganesoperoxidasa (MnP) y la polifenoloxidasa o
lacasa).

OBJETIVO GENERAL.
Evaluar la actividad ligninolitica de las enzimas producidas por hongos
ligninoliticos crecidos en condiciones de cultivo.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

- Determinar la capacidad ligninolitica de los hongos utilizando el colorante azul

de coomassie como sustrato, y modificando variables como el pH y la adición de
manganeso.

-Realizar un gráfico que permita visualizar la degradación en el tiempo del

colorante azul de coomassie

MATERIALES Y REACTIVOS

Cajas de petri, erlenmeyers de 125 ml, torundas de algodón, extracto de malta,

agar-agar, glucosa, tartrato de amonio, tween 80, alcohol veratrílico, manganeso,
acido tartárico, NaOH, azul de coomassie (colorante).

PROCEDIMIENTO

Inicialmente y con ayuda de asa bacteriológica, se siembran algunas fragmentos

de un hongo ligninolítico, en un medio de cultivo (agar al 1.5 % y extracto de malta
al 3.0%) previamente esterilizado con calor húmero (15 psi/ 121 ºC/ 20 minutos).
Paralelamente y esterilizado bajo las mismas condiciones, se preparar un medio
de cultivo líquido que por su composición permita la expresión enzimática. Para
lograr esto se utiliza un erlenmeyer de 500 mililitros en el que se prepara un
volumen final de 100 mililitros que incluye: glucosa 1g, tartrato de amonio 0.02 g,
tween 80 0.05 g, alcohol veratrilico 2.5 mmol (0.02 mL de alcohol veratrílico
1.25M), manganeso a 40 ppm (4ml de solución de manganeso de concentración
inicial 1000ppm), ácido tartárico 0,3 g y un pH: 4.5 previo a la adición de un
colorante (azul de coomassie) al 0.002%. En caso de no utilizar agua como
blanco de calibración, se debe preparar un poco mas de este medio y esterilizarlo
en pequeñas alícuotas.

Una vez ha esporulado el microorganismo en el medio de cultivo inicial (agar

malta), se cortan 4 o 5 pequeños fragmentos de agar (hongo incluido), se
transfieren al medio de expresión enzimática y se somete a agitación orbital
(aproximadamente 150 r.p.m.), en temperatura ambiente y por espacio de una o
dos semanas aproximadamente. En este lapso de tiempo, se deben tomar
pequeñas alícuotas del medio a partir del cuarto o quinto día, y con ellas realizar
unas cuantificaciones espectrofotométricas (598 nm) que faciliten la elaboración
de un gráfico que evidencie el decoloramiento progresivo del color.

BIBLIOGRAFÍA

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basidiomycetes for enzymes involved in lignin degradation. Mycol Res 1995; 99:
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2. Kirk TK, Farrell RL. Enzymatic “combustion”: the microbial degradation of lignin.
Annu Rev Microbiol 1987; 41: 465-505.
3. Kirk TK, Connors WJ, Zeikus JG. Requirement for a growth substrate during
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Phanerochaetechrysosporium. Appl Environ Microbiol 1992; 58: 2402-2409.
5. Tuor U, Wariishi H, Schoemaker HE, Gold MH. Oxidation of phenolic
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6. Soares GM, de Amorim MT, Costa- Ferreira M. Use of laccase together with
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7. Hess J, Leitner C, Galhaup C, et al. Enhanced formation of extracellular laccase
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9. Levin, L, Papinutti, L., Forchiassin, F. Evaluation of Argentinean white rot fungi
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Bioresource Technology 94. pp. 169–176 (2004)
10. Camarero, S., Sarkar, S., Ruiz-Dueñas, F., Martínez, M., Martínez, A.
Description of a Versatile Peroxidase Involved in the Natural Degradation of Lignin
That Has Both Manganese Peroxidase and Lignin Peroxidase Substrate
Interaction Sites. The Journal of Biological Chemistry. 274(15), 10324–10330.
(1999)
11. Yonni, F., Moreira, M.T., Fasoli, H., Grandi, L., Cabral, D. Simple and ea
 ANEXO

Cuantificación de variables con importancia en los procesos que se realizan

en el laboratorio

DETERMINACIÓN DE AZUCARES TOTALES POR EL MÉTODO DE ANTRONA

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN BASE DE ANTRONA

La vidriería a utilizar debe estar previamente lavada con solución de ácido

sulfúrico al 10%.

Tomar 100 mL de ácido sulfúrico al 96% en un recipiente ámbar o en un

erlenmeyer previamente cubierto con papel aluminio para evitar que la solución
final de Antrona en ácido reaccione con la luz. A los 100 mL de ácido adicionarles
200 mg de Antrona sólida y llevar a agitación hasta obtener una solución
homogénea. Para la manipulación de este reactivo es necesario utilizar tapabocas
y guantes debido a su alta toxicidad.

ELABORACIÓN DE CURVA ESTANDAR

Pesar 0.25 g de glucosa y llevarlo a un volumen final de 50 mL para obtener una

solución de concentración 5 g/L. Tomar una alícuota de 0.5 ml de esta solución y
llevarlos a un volumen final de 50 mL para obtener una solución de concentración
0.05 g/L. Con esta última solución preparar las siguientes diluciones en tubos de
ensayo, utilizar micropipeta de 1 mL para esto.

Volumen de solución Volumen de

Solución Concentración [g/L] madre (mL) agua destilada
(mL)
Blanco 0 0 1.5
1 0.005 0.15 1.35
2 0.01 0.30 1.20
3 0.015 0.45 1.05
4 0.02 0.60 0.90
5 0.025 0.75 0.75
6 0.03 0.90 0.60
7 0.035 1.05 0.45
8 0.04 1.20 0.30
9 0.045 1.35 0.15
10 0.05 1.50 0
Conservar en un baño de hielo durante todo el tiempo que se demore el
tratamiento de las diluciones puesto que la reacción con el reactivo de Antrona es
demasiado exotérmica.

Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 3 mL del reactivo de

Antrona incluyendo el blanco; agitar en vortrex hasta obtener soluciones
homogéneas. Llevar todas las soluciones al baño termostático a temperatura
de 80 – 90 ° C durante 10 minutos. Pasados 10 minutos exactos de
calentamiento llevar las soluciones a un baño de hielo hasta que las
soluciones se enfríen completamente. Agitar nuevamente y esperar 15
minutos hasta que las burbujas de aire desaparezcan.

Leer absorbancia de todas las soluciones a 625 nm y realizar una curva de

concentración de glucosa en g/L versus Absorbancia y hacerle un ajuste lineal.

DETERMINACIÓN DE AZUCARES POR EL MÉTODO DE DNS

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN BASE DE DNS

Se preparan 20 mL de una solución de NaOH al 2 N con NaOH sólido en un
erlenmeyer de 200 mL y llevar a agitación hasta obtener una solución
homogénea. A esta solución se le adicionan 30 gramos de Tartrato de Sodio y
Potasio y se completa el volumen a 100 mL. Para la adición del DNS, se debe
tener en cuenta, que este en solución es reactiva a la luz; por lo tanto es
necesario utilizar un recipiente ámbar o en su defecto cubrir el erlenmeyer con
papel aluminio. Por último a esta solución se le añade 1 gramo de DNS (ácido
3 – 5 dinitrosalicílico). Para la manipulación de este reactivo es necesario
utilizar tapabocas y guantes debido a su alto poder cancerígeno.

ELABORACIÓN DE CURVA ESTANDAR

Pesar 0.1 g de glucosa y llevarlos a un volumen final de 50 mL para obtener

una solución de concentración 2 g/L. Tomar una alícuota de 5 ml de esta
solución y llevarlos a un volumen final de 25 mL para obtener una solución de
concentración 0.4 g/L correspondiente a la solución madre. Con esta última
solución preparar las siguientes diluciones en tubos de ensayo, utilizar
micropipeta de 1 mL para medir estos volúmenes.

Volumen de Volumen de
Solución Concentración [g/L] solución agua
madre (ml) destilada (ml)
Blanco 0 0 2.0
1 0.04 0.2 1.8
2 0.08 0.4 1.6
3 0.12 0.6 1.4
4 0.16 0.8 1.2
5 0.20 1.0 1.0
6 0.24 1.2 0.8
7 0.28 1.4 0.6
 8 0.32 1.6 0.4
9 0.36 1.8 0.2
10 0.40 2.0 0

Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 2 mL de la solución de

DNS incluyendo el blanco; tapar con papel vinipel todos los tubos para evitar
pérdidas por evaporación (En el caso de no poder trabajar inmediatamente con
las soluciones guardar todos los tubos en un lugar oscuro para evitar que el DNS
comience a reaccionar).

Llevar todas las soluciones al baño termostático a temperatura de 80 – 90 ° C

durante 5 minutos. Pasados 5 minutos exactos de calentamiento llevar las
soluciones a un baño de hielo durante otros 5 minutos o hasta el momento en que
se dispone a hacer las lecturas.

Leer absorbancia de todas las soluciones a 540 nm, realizar una curva de
Concentración de glucosa en g/L versus Absorbancia y hacerle un ajuste lineal.

DETERMINACIÓN DE PROTEINA SOLUBLE ( MÉTODO DE LOWRY)

El método más exacto para determinar concentración de proteína es

probablemente la hidrólisis ácida seguida por la determinación de aminoácidos.
La mayoría de los otros métodos son sensibles a la composición de aminoácidos
de la proteína, por lo que no se pueden obtener concentraciones absolutas. El
método de Lowry no es una excepción, pero su sensibilidad es moderadamente
constante de proteína a proteína y ha sido tan ampliamente usado, que se
constituye en el método de elección para mezclas de proteínas y extractos
crudos.

El método se basa en la reacción de Biuret, donde el enlace peptídico reacciona

con el cobre bajo condiciones alcalinas produciendo ion cuproso, el cual
reacciona con el reactivo de Folin vía aminoácidos aromáticos. La reacción
produce un complejo de color azul, que depende principalmente de Tyrosina y
Triptofano. El método es sensible hasta niveles de 0.01 mg de proteína / ml, pero
es mejor para concentraciones de 0.01 – 1.0 mg/ml.

Reactivos

Reactivo A: En un beaker pequeño pesar 20.0 g de Na2CO3 y 4.0 g de NaOH.

Transvasar a un balón volumétrico de 1.0 L y completar volumen con agua
destilada.
Reactivo B-1 En un beaker pequeño pesar 1.0 g de CuSO4.5H2O, transvasar a un
balón de 100 ml y completar volumen con agua destilada.
Reactivo B-2 En un beaker pequeño pesar 2.0 g de Tartrato de Na-K, transvasar a
un balón de 100 ml y completar volumen con agua destilada.
Reactivo C: En un recipiente apropiado mezclar en el siguiente orden 1 ml de
Reactivo B-1, 1 ml de Reactivo B-2 y 100 ml de Reactivo A. Preparar esta
solución diariamente.
Reactivo de Folin Coplcateau – 2.0 N: Reactivo grado analítico, marca Merck.
Fenol 1.0 N: En un recipiente apropiado diluir un volumen del reactivo de Folin
Ciocalteau (2.0 N) con un volumen igual de agua destilada.
Ácido Tricloroacético 10 % p/v: En un beaker pequeño pesar 10 g del reactivo y
transvasar a un balón volumétrico de 100 ml.

Preparación de la muestra: Filtrar o centrifugar la muestra de cultivo, con el fin

de remover los sólidos presentes. Usar el líquido sobrenadante.

Precipitación: Colocar 2.0 ml de muestra en un tubo de centrífuga cónico de 15

ml. Añadir 2.0 ml de ácido tricloro acetico al 10 % p/v. Mezclar en un vortex.
Incubar de 30 – 60 minutos en la nevera. Centrifugar durante 25 minutos a 2000
r.p.m. Descartar el supernadante y disolver el pelet en 2.0 ml del Reactivo A.

La proteína soluble también puede precipitarse por adición de 4.0 ml de acetona a

2.0 ml de muestra. En este caso el pelet se disuelve en un buffer apropiado, de
acuerdo al medio en el que se desee evaluar la proteína. Este procedimiento se
usa para medir la concentración de enzima en muestras que contienen altas
concentraciones de azúcar que interfieren con el ensayo de celulasa

Derivatización de la proteína soluble: En un tubo de ensayo colocar 0.5 ml de

muestra (debe contener entre 0.05 g –1.0 mg de proteína /ml). Añadir 5.0 ml del
reactivo C y mezclar con vortex.. Dejar en reposo durante 10 minutos. Luego
añadir 0.5 ml del reactivo de Fenol 1.0 N y mezclar con vortex. Esperar 30
minutos y leer la Absorbancia a 750 nm contra un blanco reactivo.

Curva de calibración: Solución Stock de Albúmina de Suero Bovino (A.S.B.): En

un beaker pequeño pesar 0.5 g del reactivo grado analítico, transvasar a un balón
volumétrico de 50 ml y completar volumen con agua destilada. Agitar. Conservar
esta solución en el congelador (0 – 5 ºC). La solución preparada tiene una
concentración final de 10000 ppm.

Soluciones estándar de Albúmina de Suero Bovino: A partir de la solución stock

tomar alícuotas de 0.125, 0.250, 0.750, 1.25 1.75 y 2.5 ml. Transferir cada
alícuota a un balón volumétrico de 25 ml. Completar volumen con agua destilada
y agitar. Las soluciones preparadas tienen una concentración de 50, 100, 300,
500, 700 y 1000 ppm de A.S.B. Dichas concentraciones se encuentran en el
rango recomendado para el ensayo (0.05 – 1.0 mg/ml). Almacenar los estándares
en el congelador.

Curva de Calibración: En tubos de ensayo para centrífuga, tomar alícuotas de

cada uno de los estándares y centrifugar a 7500 r.p.m. durante 12 minutos.
Del sobrenadante tomar 2.0 ml en otro tubo de ensayo y adicionar 2.0 ml de ácido
tricloro acetico al 10 %. Agitar con vortex y llevar a la nevera durante 45 minutos.
Retirar de la nevera y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 25 minutos . Descartar
sobrenadante. Al residuo adicionar 2.0 ml del Reactivo A. Mezclar con vortex. De
la solución anterior se toman 0.5 ml en un tubo de ensayo y se adicionan 5.0 ml
del Reactivo C. Agitar con vortex y dejar en reposo durante 10 minutos. A la
solución anterior añadir 0.5 ml del reactivo de Folin 1.0 N. Agitar y esperar 30
minutos. Finalmente leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 750
nm contra un blanco reactivo.

Blanco reactivo: En un tubo de ensayo tomar 2.0 ml de agua destilada y proceder

de igual forma como en el numeral 5 c.

Curva de Calibración: Construir un gráfico de Absorbancia versus concentración

para cada uno de los estándares. Trazar la mejor línea recta, por el método de los
mínimos cuadrados (regresión lineal). Verificar que existe una relación lineal entre
la Absorbancia y la concentración para el rango establecido (coeficiente de
correlación mayor a 0.95). Obtener la ecuación para la línea recta con el fin de
interpolar los valores de absorbancia obtenidos para cada muestra ensayada.

Contenido de proteína en la muestra ensayada: Una vez obtenido el valor de

Absorbancia para la muestra, este se interpola en la curva de calibración, con el
fin de obtener la concentración de proteína en ppm, para la solución leída. Si la
muestra leída es producto de diluciones previas sobre la muestra de interés, el
valor obtenido se multiplica por el factor de dilución correspondiente.

C final = C interpolación * F.D.

C final = Concentración de proteína en el problema,

C interpolación = Concentración obtenida por interpolación de la absorbancia de la muestra leída,
en la curva de calibración.
F.D. Factor de dilución.

Datos experimentales: Los siguientes datos se obtuvieron en un espectrofotómetro Espectronic 20, marca instruments, de
pantalla digital. Las muestras ensayadas consisten en medios de cultivo de hongos ruminales, evaluados para actividad
celulolítica.

# Estándar [Estándar] Absorbancia

1 50 0.074
2 100 0.134
3 300 0.346
4 500 0.548
5 700 0.709

Ppm Absorbancia
50 0.074
100 0.134
300 0.346
500 0.548
700 0.709
Para un extracto enzimático ensayado, se obtuvo una absorbancia de 0.548, que
al Interpolarse en la curva de calibración, corresponde a 518.6 ppm de proteína
en la muestra leída.

Bibliografía

Ghose T. K. Measurement of cellulase activities. International Union of Pure and

Applied Chemistry. Applied Chemistry Division Commission on Biotechnology.
Walker John. Basics protein and peptides protocols. Chapter 1. The Lowry Method
for protein quantitation. Humana Press. Totowa, New Jersey.

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO

MICROBIANO POR EL MÉTODO DE PESO SECO

Se siembra el microorganismo de interés en agar (sobre medio sólido) para

permitir el crecimiento de cepas aisladas.Luego de observar un crecimiento
representativo del microorganismo, se procede a extraer una cepa aislada del
cultivo en caja y sembrarla en un caldo de cultivo rico, que permita la adaptación a
un nuevo ambiente y el crecimiento de las células (este proceso se denomina
inocular). Este caldo se prepara en un erlenmeyer y corresponde al 10% del
volumen total con el que se desea trabajar posteriormente.

El inóculo se pasa a otro erlenmeyer que corresponde a un medio de cultivo con

un volumen específico de trabajo deseado. Se vierte el inóculo en este medio
recientemente preparado, y se deja en suspensión con agitación y calentamiento
hasta observar que los microorganismos han crecido lo suficiente, lo cual se hace
apreciable cuando el medio del cultivo se torna turbio.

Después de obtener un medio de cultivo con una cantidad de células

representativa se procede a centrifugar toda la suspensión, se descarta el
sobrenadante y se lava con solución salina al 0.9 %; esta nueva solución se
suspende y corresponde a la solución madre.

Se extraen alícuotas de la solución madre para concentraciones (%v/v) de 100,

50, 40, 30, 20, 10, 0 %; para ello se toman 25, 12.5, 10.0, 7.5, 5.0, 2.5, 0.0 ml
respectivamente, estos volúmenes se llevan a 25 ml (en balón volumétrico).

Se toma un papel filtro por cada dilución y para cada uno un trozo de papel
aluminio, este último se usa como soporte para el papel filtro por lo tanto no debe
ser cambiado con ningún otro a fin de no generar errores en el peso obtenido. Los
papeles filtro y aluminio se pesan y se marcan con las diluciones de cada una de
las soluciones; el papel filtro se pesa tanto seco como húmedo.
Se prepara el montaje para filtración al vacío que presenta los siguientes
elementos: un erlenmeyer, una manguera con tornillo, un embudo, un tapón de
caucho, una malla metálica, un tubo, una pinza y una bomba de vacío. Se retira el
tornillo de la manguera y se conecta a un orificio que se encuentra en la parte
superior del erlenmeyer, se pone nuevamente el tornillo y se aprieta fuertemente,
el extremo opuesto de la manguera se conecta a la bomba de vacío por medio de
un orificio que se encuentra en la parte superior de la bomba; luego, se toma el
embudo y se inserta en el orificio del tapón de caucho, este montaje se une a la
boca del erlenmeyer y se asegura, en la parte superior del embudo se adhiere la
malla metálica y sobre esta se sujeta con la pinza el tubo.
Posteriormente, de cada solución, se toman 10 ml y se llevan al equipo; luego de
filtrar cada solución, se pesan los papeles filtro para obtener el peso húmedo de
las células y se transfieren a la estufa de 90 – 105 ° C, después de secados se
pesan nuevamente y se obtiene el peso seco de muestra. Este último paso debe
repetirse hasta obtener un peso seco constante.

Se hace el análisis por espectrofotometría, midiendo la absorción de la muestra a

una longitud de onda de 600 nm. Y se realiza una curva de peso seco vs.
absorbancia.

MANTENIMIENTO DE COLONIAS DE Drosophila melanogaster (cepa canton)

(Díptera: Drosophilidae)

1. MATERIALES Y EQUIPO
Ejemplares adultos de Drosophila melanogaster, viales de vidrio de 60 mL,
algodón, gasa, pincel suave, CO2, cartulina blanca, bandejas plásticas, lámpara,
estereoscopio, recipientes termorresistentes para preparar el alimento (capac 1
L), embudo, balanza, pipetas de 10 mL, probeta de 100 mL, estufa
Ingredientes para un litro de alimento:
Levadura fleishmann seca....... .....30 mL
Harina de maíz..............................100 g
Agar agar.........................................6 g
Melaza...........................................80 mL
Acido propiónico ......................... 5 mL
Agua............................................900 mL

2. PREPARACIÓN DEL ALIMENTO

El agua se divide en dos porciones. La primera se agrega a la levadura y se

mezcla muy bien. Luego se agrega la harina de maíz y se continúa con la
agitación hasta obtener una mezcla homogénea.
A la segunda porción de agua se le agrega el agar y se calienta hasta hervir. En
este momento se adiciona la porción de agua que contiene la levadura y la harina,
además se agrega la melaza y se mezcla muy bien. Sin dejar de mezclar, se
adiciona el ácido propiónico y antes de que espese por completo, se retira del
fuego y se sirve en los viales de vidrio de 60 mL. Estos se cubren con tapones de
algodón y gasa limpios hasta el día siguiente para que la mezcla se solidifique
completamente. Se realiza entonces el repique de la colonia.

3. REPIQUE DE LA COLONIA

Los viales con el alimento ya solidificado deben estar rotulado con la fecha. De un
cultivo anterior, se pasan todos los ejemplares a un vial limpio sin alimento y se
duermen utilizando CO2. Luego se pasan a una cartulina blanca y bajo el
estereoscopio y con la ayuda de un pincel, se seleccionan los ejemplares que van
a los nuevos recipientes en una proporción de 3 machos y 7 hembras ca cada
nuevo vial. Este procedimiento se conoce como repique y debe realizarse
semanalmente. Los individuos se dejan máximo 15 días y luego se descartan
sumergiéndolos en alcohol, filtrándolos y disponiéndolos con los residuos sólidos
orgánicos.

4. RENOVACIÓN DE LA COLONIA

Dos veces al año, se adquieren nuevos ejemplares de Drosophila melanogaster

provenientes del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia, para renovar
la colonia y evitar endogamia.