FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

INGENIERÍA SANITARIA
GUIA DE LABORATORIO

PRÁCTICA 1
AISLAMIENTO Y RECUENTO DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS,
HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS PRESENTES EN DIVERSAS
MUESTRAS.

1. Objetivo general

Aplicar los conceptos y métodos básicos de la microbiología en el aislamiento,

crecimiento y recuento de bacterias y hongos.

2. Objetivos específicos
Comprender los fundamentos de las técnicas básicas de aislamiento y recuento de
microorganismos presentes en muestras sólidas y líquidas Aislar y observar el
crecimiento de microorganismos presentes en ambientes y superficies
Desarrollar las habilidades necesarias para realizar recuentos
microbiológicos a partir de muestras diversas

3. Marco teórico
Para el crecimiento de microorganismos en el laboratorio o fuera de él, es necesario
cumplir con los requerimientos nutricionales y condiciones fisicoquímicas que
permitirán un adecuado desarrollo. El medio de cultivo es un ambiente artificial que le
aporta los componentes necesarios para su crecimiento, por ejemplo, azúcares como
fuente de carbono y proteínas como fuente de nitrógeno entre otros. En cuanto a las
condiciones fisicoquímicas, tenemos condiciones de oxígeno, temperatura, pH, etc. Los
cuales se deben tener en cuenta para el desarrollo del microorganismo (Cuevas, s.f). Por
lo tanto, los medios de cultivo deben proveer el agua, los nutrientes y las condiciones
necesarias para un adecuado metabolismo microbiano. Una vez el medio ha sido
seleccionado y adecuadamente preparado de acuerdo con las especificaciones está listo
para ser utilizado para la propagación de el o los microorganismos de interés.
Para realizar un cultivo, se debe sembrar en el medio elegido la muestra problema. Si la
siembra se realiza en un medio de cultivo sólido, ya sea en la caja petri o en tubo, y si
hay los nutrientes adecuados para su crecimiento, el microorganismo se multiplica y
crece hasta formar lo que se denominan colonias. Estas son masas celulares que se han
multiplicado a partir de una única célula, que son visibles a simple vista y que pueden
contarse (Universidad Nacional del Nordeste, 2006; Universitat D’Alacant, 2017;
Cuevas, s.f); dichas colonias pueden ser descritas de acuerdo con sus características
macroscópicas como

Elaborado por: Luisa García, Modificado por: Lizeth

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borde, elevación, color, etc. Es importante mencionar que no todos los

microorganismos son cultivables, pero sí una gran cantidad de ellos, dentro de los que
se encuentran muchas bacterias, hongos y algas unicelulares.
Cuantificar la cantidad de microorganismos presentes en una muestra es relevante dado
que permite saber, si hay contaminación, establecer la cantidad inicial de un inóculo
microbiano o la cantidad presente en una muestra ambiental. Por lo general, se toma el
crecimiento de bacterias como ejemplo, ya que sirve para comprender el crecimiento de
levaduras, hongos y células vegetales y animales; el crecimiento de los virus se produce
de forma diferente. Cuando una célula aislada de un microorganismo comienza a crecer
sobre un substrato sólido como un medio de cultivo, el resultado del crecimiento al
cabo del tiempo es una unidad formadora de colonia (UFC) que se constituye de
múltiples células hijas de la inicial y que puede ser observada sin ayuda del
microscopio. Estas UFC pueden contarse y, de acuerdo con si la muestra se ha diluido o
no, realizar los cálculos correspondientes para determinar la cantidad de
microorganismos en una muestra dada.
Es importante recordar que el material que se inocula en el medio se denomina inóculo,
y que una vez el inóculo se siembra en el medio durante la incubación, las células
microbianas individuales se reproducen dando lugar a colonias diferentes, es decir que
cada colonia podría ser, presumiblemente, un cultivo puro de una sola especie de
bacterias. Si dos células microbianas procedentes del inóculo original quedan muy cerca
una de la otra sobre el medio de agar, las colonias que resultan quedan mezcladas o
muy juntas y para su estudio se hace necesario separarlas (Olivas, 2012)

4. Evaluación conceptual (Pre-informe)

Consulte los siguientes conceptos relacionados con el tema de estudio:
a. Cuáles son las principales fuentes de Carbono y Nitrógeno empleadas para la
elaboración de medios de cultivo microbiológico. Mencione al menos dos de cada
uno.
b. Diferencias entre mesófilos, psicrófilos y termófilos.
c. ¿Por qué es importante mantener las condiciones de esterilidad durante
cualquier proceso microbiológico? Justifique su respuesta.
d. Describa y justifique si los medios empleados para la práctica se consideran medios
específicos, selectivos o nutritivos.
e. ¿Por qué es necesario conocer la cantidad de microorganismos presentes en un
ambiente o superficie determinada?
f. Diferencia entre siembra en superficie y siembra en profundidad

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 No olvide las referencias en cada caso

5. Materiales y métodos
 20 g de muestra problema sólida o liquida
 Erlenmeyer de 250 mL con 90 mL de agua peptonada
 Jeringa estéril de 10 mL, si es muestra liquida
 Plantilla de 10 x 10 cm para la toma de muestra de superficie.
 Isopos estériles
Tubo de ensayo con 4 mL de agua peptonada
 Tubos de ensayo taparosca con 9 mL de agua peptonada
 Pipetas de vidrio estériles de 2 mL
 Rastrillo de vidrio
 Cajas de agar nutritivo
 Cajas de agar PDA o rosa de bengala
 Vinipel
 Alcohol al 70% en atomizador
 Marcador sharpie
 Cámara fotográfica/celular
 Rollo de papel absorbente
 Mechero
 Encendedor o caja de fósforos
 Elementos de protección personal por persona: guantes, tapabocas y cofia
 Balanza
 Incubadora
 Espátula
 Agitador
 Vortex

a. Preparación para iniciar la práctica

1. Todos los estudiantes deben colocarse cofia y tapabocas antes de iniciar el proceso.
Los guantes sólo se colocan una vez se vayan a empezar a manipular los materiales
2. No se debe comer, beber o masticar chicle durante la realización de la práctica
3. Los estudiantes que tengan cabello largo deben verificar que la totalidad de este se
encuentre dentro de la cofia

b. Alistamiento del área de trabajo

Elaborado por: Luisa García, Modificado por: Lizeth

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1. Antes de usar los guantes los estudiantes deben retirar anillos, relojes, manillas, etc
que tengan y guardarlas adecuadamente.
2. Asperjar el área de trabajo con alcohol al 70% y con ayuda del papel absorbente
realizar la desinfección del área de trabajo con la solución desinfectante de alcohol
antes de empezar a trabajar. Esperar que el área esté seca.

c. Alistamiento del material

1. El material debe estar organizado y adecuadamente marcado en la superficie de
trabajo.
2. Se sugiere empezar con las diluciones seriadas, continuar con la toma de muestra de
la superficie problema y terminar con la toma de muestra del ambiente.

d. Aislamiento de microorganismos a partir de muestra sólida o liquida

1. Pesar 10 g de la muestra con la espátula limpia y diluirla en 90 mL de agua
peptonada. Agitar por 10 minutos hasta conseguir que la muestra se homogenice en
la solución con el agua peptonada. Esta sería la dilución 10-
1

2. Marcar cada tubo con las diluciones correspondientes empleando el marcador

Sharpie (10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ,10-6). En cada uno de los tubos tener 9 mL de solución
de agua peptonada estéril
3. Tomar con ayuda de la pipeta 1 mL de la dilución 10 -1 uy depositarla en el tubo
marcado como 10-2. Mezclar y homogenizar con ayuda del vortex o dando
golpecitos contra la palma de la mano.
4. Con una nueva pipeta tomar 1 mL de la dilución 10 -2 y agregarla a los 9 mL del tubo
marcado como 10-3. Repita este proceso hasta completar la dilución 10-6
5. Marcar las cajas con medio AN, PDA o Rosa de bengala con las diluciones
correspondientes empleando el marcador Sharpie (10-2, 10-4, 10-6, por ejemplo)
6. Con cuidado de no contaminar los medios, colocar 0,1 mL de la dilución
correspondiente en el centro de cada medio. Ayudándose del asa o rastrillo para
distribuirlo por todo el medio de cultivo. Realizar el procedimiento empezando
desde la menor dilución a la mayor dilución para poder usar una sola pipeta y un
solo rastrillo por muestra
7. Tapar los medios cubriendo las cajas con vinipel y llevar a incubar. Las cajas de AN
se dejarán a 37ºC por tres días y las de PDA se dejarán a 24ºC por una semana.
Buscar un lugar en el que la temperatura tienda a ser constante en el día y al que no
llegue luz directa. Puede utilizar una caja de cartón para

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guardar los medios durante los días de observación o si hay disponibilidad de

incubadora se deben dejar en ella.
8. El crecimiento microbiano se debe anotar contando el número de colonias
encontradas en cada dilución. Recuerde seleccionar para el recuento las cajas que
presenten entre 30 y 300 colonias. Realice registro fotográfico del proceso
informando las UFC/g de acuerdo con el ejemplo de la figura 1. El contenido en
microorganismos por gramo se obtiene de multiplicar el número de UFCs obtenido
en una dilución, por su factor de dilución y dividirlo en el volumen de muestra
sembrado.

104= 150
104=160
No de colonias = 150+173/2=155 # colonias= 155
UfC /mL= 155 *1000/0,1 =15x106

UFC/mL o UFC/gr = No. de colonias * el factor de dilución

mL de la muestra sembrada

Figura 1. Recuento en placa de una muestra de agua contaminada. Fuente: Propia

e. Muestra de superficies
1. Seleccionar 1 superficie (por ejemplo, manos y celular)
2. Colocar la plantilla en el lugar seleccionado
3. Humedecer uno de los isopos estériles en los 4 mL de agua peptonada, sin que
quede excedente de líquido en el copito. Pasar el isopo cuidadosamente por toda la
superficie seleccionada.
4. Posterior a esto, distribuir con ayuda del isopo la muestra tomada en 1 caja de AN y
1 caja de PDA / Rosa de bengala
5. Tapar los medios y llevar a incubar (AN a 37ºC por tres días y PDA a 24ºC por una
semana)
6. El crecimiento microbiano debe ser revisado luego de una semana y se debe realizar
el recuento. Realice registro fotográfico del proceso.
7. Informe el recuento de las UFC/10cm2

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g. Muestra de ambientes (Control microbiológico del aire)

1. Seleccionar dos lugares que quiera estudiar respecto a sus condiciones
ambientales microbiológicas (baño, escaleras, esquina del lab,etc)
2. Llevar al lugar 1 caja de AN y 1 caja de PDA/Rosa de bengala
3. Dejar los medios abiertos en el lugar por 10 minutos
4. Tapar los medios y llevar a incubar (AN a 37ºC por tres días y PDA a 24ºC por
una semana)
5. El crecimiento microbiano debe ser revisado luego de una semana y se debe el
recuento obtenido. Realice registro fotográfico del proceso.
6. Repita el proceso en otra área. No olvide marcar los medios con el área
analizada
7. Informe el recuento teniendo en cuenta la siguiente fórmula:

UFC /min* cm2= UFC encontradas / (área de la caja Petri (63,62 cm2) * tiempo
de exposición (10 min)
UFC /min* cm N.º microorganismos por cm2 en cada minuto de exposición.
2:

(Vidal, 2019)

REFENCIAS
Olivas, E. 2012. Manual de prácticas de laboratorio de microbiología. Porgrama de
química. Universidad autónoma de ciudad Juarez. Disponible en
https://bivir.uacj.mx/Reserva/Documentos/rva2011296.pdf

Universitat D’Alicant. 2017. Introducción a las técnicas de cultivo en microbiología.

Disponible en https://ciencias.ua.es/es/extension-
universitaria/documentos/extension-universitaria/ven-a-hacer-
practicas/2017/microbiologia-introduccion-a-las-tecnicas-de-cultivo-en- microbiologia.pdf

Vidal, A. 2019. Toma de muestras superficies ambientales – Microbiología. Disponible

en https://www.youtube.com/watch?v=wBEtdClpRj4

Elaborado por: Luisa García, Modificado por: Lizeth