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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE RECURSOS NATURALES

RENOVABLES

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA FORESTAL

PROCEDIMIENTOS DE DESINFECCIÓN DE EXPLANTES -

SIEMBRA ASÉPTICA

CURSO : BIOTECNOLOGIA FORESTAL

ALUMNO : MIXAN CAMACHO, Jean Rommel

DOCENTE : Ing. Msc. HEMERYTH BARTRA, Jhinmy

SEMESTRE : VII

FECHA : 14/07/17

TINGO MARÍA – PERÚ


ÍNDICE GENERAL

Pag.
I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 1

II. REVISION DE LITERATURA...................................................................... 2

2.1. Explante ................................................................................................. 2

2.1.1 Semillas “Calycophyllum spruceanum (Benth.)” ............................. 2


2.2. Medios de cultivo ..................................................................................... 2

2.2.1. Agar ................................................................................................ 2


2.2.2. Asepsia........................................................................................... 3
2.3. Puntos a tener en cuenta para disminuir la contaminación por
manipulación ......................................................................................... 5

III. MATERIALES Y METODOS ....................................................................... 6

3.1. Lugar de ejecución .................................................................................. 6

3.2. Materiales ................................................................................................ 6

3.2.1. Equipos e instrumentos de Laboratorio .......................................... 6


3.2.2. Reactivos y sustancias ................................................................... 7
3.2.3. Material vegetativo ......................................................................... 7
3.2.4. Otros materiales ............................................................................. 7
3.3. Metodología ............................................................................................. 7

3.3.1. Preparación del área de trabajó ..................................................... 7


IV. RESULTADOS.......................................................................................... 10

V. CONCLUSION .......................................................................................... 11

VI. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA .............................................................. 12


1

I. INTRODUCCIÓN

La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas


dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las
plantas tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de
gérmenes, etc.), y el control de los factores que afectan el crecimiento.

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se trata


de establecer los cultivos in vitro, es la contaminación de los mismos con
diversos microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, toplasmas, entre
otros). El ambiente generado por explante-medio de cultivo-condiciones físicas
de incubación es altamente propicio para la proliferación de muchos de estos
microorganismos, pueden provocar la destrucción de los explantes.

El primer paso para la desinfestación del tejido es su lavado con


agua potable y en algunos casos un poco de detergente, de preferencia anti-
bacterial, esto se realiza con la finalidad de eliminar algunos contaminantes
localizados en la superficie del mismo.

Es importante considerar el origen del material a esterilizar, aquéllos


que provienen de campo, con porciones de suelo (raíces o tallo), pueden
presentar más problema durante este proceso que los que provienen de
invernadero y condiciones controladas.

Objetivos
 Familiarizarse con los procedimientos de establecimiento in vitro y
siembra de explante (Semilla de Capirona – Calycophyllum
spruceanum).
 Conocer las normas para el trabajo aséptico en el área de siembra.
 Identificar los puntos clave para disminuir la contaminación por
manipulación.
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II. REVISION DE LITERATURA

2.1 . Explante

Tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a un medio


artificial de crecimiento Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser
porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o
semillas.

2.1.1 Semillas “Calycophyllum spruceanum (Benth.)”

Son pequeñas, comprimidas, con alas laterales. El embrión bien


desarrollado con cotiledones foliáceos. Sus dimensiones incluyendo el ala varían
de 5 a 6 mm de largo, 1 a 2 mm de ancho y de 1 mm de altura. Entre 10-30
semillas por fruto y entre 3-6 millones de semillas por kg.

2.2. Medios de cultivo

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de


crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el
desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de estos es tan
grande que la variedad de medios de cultivo es enorme, no existiendo un medio
de cultivo universal adecuado para todos ellos, ni siquiera refiriéndonos a las
bacterias con exclusividad.

2.2.1. Agar

Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de


cultivo. En el agar bacteriológico el componente dominante es un polisacárido
que se obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la indudable ventaja de
que a excepción de algunos microorganismos marinos, no es utilizado como
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nutriente. Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100ºC y se gelifica


alrededor de los 40ºC, dependiendo de su grado de pureza.

2.2.2. Asepsia

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan


de establecer los cultivos es el de la contaminación de los mismos con diversos
tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus).

El procedimiento general consiste en inocular un medio de cultivo


gelificado (generalmente con agar, Gelrite o Phytagel®) con un fragmento de
tejido u órgano vegetal, llamado explante, previamente tratado para eliminar todo
organismo que se encuentre en su superficie (desinfestación).

La finalidad de los desinfectantes es destruir o inhibir el crecimiento


de microorganismos patógenos, sin alterar la estructura celular de los tejidos
vivos. El desinfectante interactúa con la membrana celular del microorganismo,
seguida de la penetración dentro de la célula y luego su acción sobre un blanco,
alterando las funciones normales del microorganismo. (Sánchez et al., 2005)

En general el mecanismo de acción de los desinfectantes depende


de tres mecanismos básicos:

 Capacidad de coagular y precipitar proteínas,

 Alterar las características de permeabilidad celular,

 Toxicidad o envenenamiento de los sistemas enzimáticos de


las bacterias.

Estos pueden producir la muerte o inhibición celular de las bacterias


por oxidación, hidrólisis o inactivación de enzimas, con pérdida de los
constituyentes celulares. (Sánchez et al., 2005)

Los agentes desinfectantes más empleados en la micropropagación


vegetal, teniendo en cuenta su bajo costo, fácil adquisición y menor efecto
fitotóxico sobre los tejidos son el hipoclorito de sodio y el alcohol al 70%.
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2.2.2.1. Hipoclorito de sodio

El cloro es un potente agente germicida con amplio espectro de


actividad, frente a bacterias, esporas, hongos, virus y protozoos. Presenta
efectos bactericidas rápidos, es un agente oxidante que inactiva proteínas
enzimáticas. (Sánchez et al., 2005)

El hipoclorito tiene como mecanismo de acción sobre los


microorganismos la inhibición de las reacciones enzimáticas y desnaturalización
de las proteínas. (Sánchez et al., 2005). Este compuesto actúa como un solvente
de materia orgánica, especialmente de ácidos grasos, a quienes transforma en
sales de ácidos grasos (jabones) y glicerol, reduciendo la tensión superficial de
la solución remanente. Además, el hipoclorito de sodio neutraliza los
aminoácidos, formando agua y sales

2.2.2.2. Alcoholes

Son compuestos orgánicos del agua, conocidos desde la antigüedad


y usados como antisépticos de limpieza y desinfección. Además de la actividad
antimicrobiana, son un buen solvente de otros productos, entre ellos muchos
antisépticos y desinfectantes, potenciando su actividad. (Sánchez et al., 2005)

Los alcoholes poseen una rápida acción y amplio espectro de


actividad, actuando sobre bacterias gram-negativas y gram-positivas, incluyendo
micobacterias, hongos y virus, pero no son esporicidas. (Sánchez et al., 2005).
El mecanismo de acción consiste en destruir la membrana celular y
desnaturalizar las proteínas. Su eficacia Su eficacia está basada en la presencia
de agua, esto se debe a que estos compuestos acuosos penetran mejor en las
células y bacterias permitiendo así el daño a la membrana y rápida
desnaturalización de las proteínas con la consiguiente interferencia en el
metabolismo y lisis celular. (Sánchez et al., 2005)

Los alcoholes habitualmente usados son el alcohol etílico o etanol y


el alcohol isopropílico. Las concentraciones varían entre el 70% y el 96% para el
primero, y entre el 70% y el 100% para el segundo. Aunque sus aplicaciones son
5

idénticas se suele usar habitualmente el etanol por ser menos irritante. (Sánchez
et al., 2005).

2.3. Puntos a tener en cuenta para disminuir la contaminación por


manipulación

(Eskew et al., 1984) menciona, que la primera condición para la


realización de cultivo de tejidos vegetales es lo relativo a la asepsia, debido a
que los medios de cultivo ofrecen condiciones favorables también para el
desarrollo de patógenos (hongos y bacterias). Las causas de contaminación de
los cultivos establecidos in vitro son las siguientes: El aire o ambiente, el cual
puede contener en suspensión diversos microorganismos (esporas).

 Los tejidos vegetales, en su exterior o interior (tejido vascular)


pueden contener microorganismos que pueden o no ser
patógenos, bajo condiciones normales; sin embargo, cuando
el tejido o el órgano es cultivado in vitro, el crecimiento de los
microorganismos limita el desarrollo de las células.

 El medio de cultivo con un proceso de esterilización poco


efectivo (desde el lavado de la cristalería, condición de los
reactivos, esterilización en el autoclave).

 El cuerpo humano, limpieza de manos, en el pelo, respiración,


trabajo de poca precisión durante la exposición al fuego de
bisturíes, pinzas, cajas etc.
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III. MATERIALES Y METODOS


3.1. Lugar de ejecución

La siguiente práctica de desinfección de explantes y siembra


aséptica, se realizó en el laboratorio de Biotecnología Vegetal, perteneciente a
la Universidad Nacional Agraria de la Selva, Tingo María- Perú.

3.2. Materiales

3.2.1. Equipos e instrumentos de Laboratorio

 Vaso de precipitados

 Tubo de ensayo

 Pinzas

 Pipetas (10 ml. Y 5 ml.)

 Gradilla

 Papel filtro

 Mechero de Bunsen

 Placa Petri

 Cámara de siembra
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3.2.2. Reactivos y sustancias

 Frascos con medio de cultivo MS, suplementado con BAP 1mg/l y AIA
0.5 mg/l.

 Alcohol de 70

 Lejía

 Agua destilada

3.2.3. Material vegetativo

 Semillas de capirona “Calycophyllum spruceanum (Benth.)”

3.2.4. Otros materiales

 Un lapicero

 Una libreta de apuntes

 El manual de practicas

 Cámara fotográfica

 Internet

 Revistas

 Libros

3.3. Metodología

3.3.1. Preparación del área de trabajó

1. Día anterior a la siembra

 Preparar los materiales necesarios.


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 Aplicar lejía 1% en la cabina de flujo, suelo y áreas de trabajo.

 Encender la luz UV (OJO: radiación cancerígena, NO VER


DIRECTAMENTE Y DESALOJAR EL ÁREA INMEDIATAMENTE).

2. En la siembra

 Apagar la luz UV y esperar 10 minutos antes de entrar.

 Encender la cabina de flujo laminar 15 minutos antes de iniciar las


actividades de siembra.

 Aplicar alcohol 70° en toda la superficie del interior de la cabina.

 Desinfectar con alcohol 70° los materiales antes de colocarlos en el


interior de la cabina de flujo.

 Esperar que se disipe el alcohol y encender el mechero.

 Colocarse lentes de protección si se va a trabajar por periodos


prolongados.

 Retirarse los relojes o pulseras.

 Quitar el papel envoltorio de los instrumentos, frascos, etc. afuera de


la cabina de flujo laminar.

 Aplicar alcohol 70° en las manos frecuentemente, para evitar


contaminación por tocar superficies o instrumentos fuera de la cabina.

 Flamear en todo momento los instrumentos quirúrgicos.

 En caso de quemaduras, interrumpir inmediatamente la siembra y


aplicar los primeros auxilios o al servicio médico.
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3. Después de la siembra

 Retirar todos los materiales y limpiar la superficie de la cabina de flujo


laminar.

 Devolver el alcohol de 70° a sus frascos respectivos.

Desinfección y siembra de los expalntes:

1. Lavar generosamente (pero delicadamente) con agua y detergente neutro


los explantes. Usar un cepillo si es necesario.

2. Cortar, con una tijera limpia, los explantes de un tamaño ideal para poder
sumergirlos completamente en el frasco.

3. Sumergir por un tiempo determinado los explantes en alcohol 70°.

4. Llevar a la cabina de flujo laminar.

5. Sumergir por un tiempo determinado la semilla en lejía a una


concentración definida.

6. Enjuagar 3 veces con agua destilada, por un mínimo 3 minutos cada


enjuague.

7. Usar las pinzas y bisturíes estériles.

8. Sembrar la cantidad de semillas según el tamaño del envase.


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IV. RESULTADOS

4.1 Se familiarizó con los procedimientos del establecimiento in vitro y


siembra de explante (Semilla de Capirona – Calycophyllum
spruceanum).
Se llevó a cabo dichos procedimientos teniendo como referencia la
desinfección del explante, luego se trasladó a la sala de siembra las semillas,
introduciéndolos en cada uno de los 15 tubos de ensayos los cuales contenían
el medio de cultivo MS.

4.2 Del Conocimiento de las normas para el trabajo aséptico en el área


de siembra.
De las normas en las cuales se pusieron más énfasis fue que todo
el procedimento de siembra se realizó dentro de la cámara de flujo laminar,
manteniendo una distancia prudente, tanto el explante como el medio de cultivo
MS del fuego

4.3 Identificar los puntos clave para disminuir la contaminación por


manipulación.
Para ello los factores que influenciaron en el trabajo realizado es la
asepsia al personal encargado de la práctica (uso de guantes, mascarilla y el
lavado de manos con alcohol de 70°), el material vegetativo como el medio de
cultivo. En la siembra se tuvo muy en cuenta la desinfección de los materiales
usados; manteniendo el explante como el medio de cultivo MS a una distancia
prudente del fuego.
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V. CONCLUSION

Se logró la familiarización teniendo en cuenta la desinfección del


explante, para luego ser trasladado a la sala de siembra las semillas,
introduciéndolos en cada uno de los 15 tubos de ensayos los cuales contenían
el medio de cultivo MS.
Se logró conocer las normas, pero las que más resaltaron en el
trabajo al momento de realizar la siembra fue que todo el procedimento se realizó
dentro de la cámara de flujo laminar, manteniendo una distancia prudente, tanto
el explante como el medio de cultivo MS del fuego.
Los puntos clave para disminuir la contaminación por manipulación
es la asepsia al personal encargado de la práctica (uso de guantes, mascarilla y
el lavado de manos con alcohol de 70°), el material vegetativo como el medio
de cultivo. En la siembra se tuvo muy en cuenta la desinfección de los materiales
usados; manteniendo el explante como el medio de cultivo MS a una distancia
prudente del fuego.
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VI. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Clavell, L; Rossi, L. 1994. Campanas de Flujo Laminar. Universidad Central de


Venezuela. Facultad de Farmacia

ROCA, W. y MROGINSKI, L. Cultivo de tejidos en la agricultura, fundamentos y


aplicaciones. Colombia: CIAT, 1991.

Sánchez L, Sáens E. 2005. Antisépticos y desinfectantes. Dermatología


Peruana. Volúmen 15. N° 2.
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ANEXO
14

Fig. 1 Filtrado de las semillas.

Fig. 2 Secado de la semilla.


15

Fig. 3 Atado del material vegetativo.

Fig. 4 Obtención del Hipoclorito de sodio.


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Fig. 5 Enrrazamiento de legía al 1% con agua estéril.

Fig. 6 Medio de cultivo MS para siembra de explante.


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Cuestionario
1. ¿Qué es la tasa de multiplicación?
Es la fase más importante y determinante en todo programa de
propagación in vitro, en ella se define no sólo el número de plantas o propágulos
a obtener, sino su calidad genética por ser esta fase en la que se producen las
variantes somaclonales. (Roca, W. 1991).
El objetivo de esta fase es la producción del mayor número posible
de propágulos (plantas, microtubérculos, microbulbillos) a partir de explantes
(meristemos apicales o axilares, yemas axilares o adventicias), ya establecidos
in vitro. (Roca, W. 1991).

2. ¿Por qué se utiliza alcohol 70° para desinfectar superficies o el


material vegetal?
Alcohol al 70% es uno de los agentes desinfectantes más
empleados en la micropropagación vegetal, teniendo en cuenta su bajo costo,
fácil de adquisición y menor efecto fitotóxico sobre los tejidos y es menos irritante
para el ser humano. (Sánchez et al., 2005)

3. ¿Qué otras sustancias se utilizan para la desinfección de explantes?


 Benlate
 hipoclorito de calcio [Ca (OCl)]2, del 6 al 12 %
 cloruro de mercurio (HgCl2) del 0.1 al 1.5 %. aunque este compuesto
es altamente tóxico y no es fácilmente removible del explante. (Roca,
W. 1991).

4. ¿Cuáles son los errores más frecuentes que causa la contaminación


en la siembra in vitro?
 Tocar la boca del tubo de ensayo con la mano.
 Sacar la mano de la cámara de siembra
 realizar el proceso de siembra lejos del fuego, etc.

5. ¿Qué son los filtros HEPA?


(Clavell, L; Rossi, L. 1994)son filtros de alta eficiencia capaces de
retener partículas ≥ 0,3 μm con una eficiencia mínima del 99,97% y resulatan
adecuados para retener los aerosoles que se generan cuando se realizan
procedimientos experimentales con agentes biologicos como
agitacion,centrifugacion o mezcla.

Cuando todo el aire que entra a la zona de trabajo es filtrado a


través de los filtros HEPA se produce un flujo unidireccional, ya que el aire se
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mueve a través del área de trabajo con una velocidad uniforme a lo largo de
líneas paralelas logrando un barrido o eliminación de las partículas presentes en
el mismo.

¿Cuál es la diferencia entre una cabina de flujo horizontal con una de flujo
vertical?

Cabina de flujo horizontal Cabina de flujo vertical


 Existe un grado menor de  El grado de turbulencia es
turbulencia. mayor.
 El flujo de aire golpea la superficie  El flujo de aire no golpea la zona
de trabajo. de trabajo.
 Genera mayor turbulencia  Genera menor turbulencia
alrededor de las piezas grandes. alrededor de las piezas grandes.
 El aire purificado ingresa a la  El aire purificador ingresa a la
cabina en una corriente cabina en una corriente
unidireccional horizontal. unidireccional vertical.
Fuente: Elaboración propia.

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