Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Escuela Profesional de Biología

BIOTECNOLOGÍA GENERAL
(BI-441)

Blgo. Fidel R. Mujica Lengua

PROFESOR PRINCIPAL

Ayacucho, 14 de setiembre del 2020

 UNIDAD IV
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Clase 1
Cultivo de tejidos vegetales
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
Introducción

La biotecnología vegetal ofrece una alternativa real para

la solución de un gran número de problemas relacionados
con el mejor aprovechamiento de las plantas por parte
del hombre.

Es sin duda una herramienta invaluable para incrementar

tanto la cantidad como la calidad de los alimentos de origen
vegetal, así como para obtener nuevos productos con
diversas aplicaciones a partir de las plantas.

Tiene como una de sus bases al Cultivo de Tejidos

Vegetales (CTV).
Concepto

Se llama CTV al conjunto de técnicas que permiten la

introducción, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte
de una planta, desde una célula hasta un organismo
completo, sobre medios de cultivo adicionados de hormonas
vegetales y bajo condiciones axénicas y controladas.

En general hay dos tipos de respuesta:

- Formación de una masa de células friables indiferenciadas

o tejido calloso (organogénesis o embriogénesis
indirecta).
- Formación directa de órganos o embriones
(organogénesis o embriogénesis directa).

Se basa en la totipotencia de las células vegetales.

Origen del cultivo de células y tejidos vegetales
Principios básicos

(1) Elección del explante:

Se llama explante al órgano, tejido o segmento

de tejido vegetal que va a ser utilizado para
iniciar el cultivo.

Mientras más joven y menos diferenciado sea

un tejido elegido como explante, más fácil será
su adaptación y respuesta al cultivo in vitro.
Elección del explante
(2) Elección del medio y condiciones de cultivo:

El medio de cultivo consiste en dos grupos de

componentes: componentes esenciales, como
los nutrientes minerales, fuente de carbono y
algunas vitaminas; y componentes opcionales,
que son las fitohormonas o fitorreguladores,
que determinan esencialmente el tipo de
respuesta del explante; además son importantes
las condiciones físicas del cultivo (luz, fotoperíodo,
temperatura y humedad).
 Timer para
fotoperiodo
De manera general, los medios de cultivo incluyen:
macronutrientes como: N, P, K, Ca, Mg y S;
micronutrientes como: Fe, Mn, Bo, Cu, Mo, Co y I.

Como fuente de carbono por lo común se utiliza la

SACAROSA (2-3%), ya que las células vegetales
cultivadas in vitro tienen una capacidad fotosintética
muy reducida o nula, por lo que su metabolismo es
heterotrófico.

Además requieren de vitaminas como tiamina y otras.

Un aspecto muy importante es el suministro de
reguladores del crecimiento, tales como:
Auxinas (promueven la elongación de las células)
AIA : Ácido indolacético
ANA : Ácido naftalenacético
AIB : Ácido indolbutírico

Citocininas (promueven la división y diferenciación celular)

BA : Benciladenina
6-BAP : 6-Bencilaminopurina
CIN : Cinetina
2iP : Isopentiladenina

Acido giberélico (promueve el crecimiento y elongación celular)

Acido abscísico (desarrollo, crecimiento, respuesta adaptativa)
Acido jasmónico (mecanismos químicos de defensa)
* Los medios de cultivo más utilizados, son:

Medio MS (Murashige y Skoog, 1962)

Medio LS (Linsmaier y Skoog, 1965)
Medio B5 (Gamborg, 1968)
Medio NN (Nitsch y Kitsch, 1969)
Medio N6 (Chu, 1978)
Medio WPM (Lloyd y McCown, 1980)
Medio DKW (Driver y Kuniyuki,1984)
 Medio MS
deshidratado
(3) Condiciones asépticas:

Es decir ausencia de contaminantes, lo que es

difícil evitar debido a la composición rica en
nutrientes de los medios, por lo que se suele
utilizar una Cabina de Flujo Laminar.
Equipos de aire limpio
Aplicaciones
• Micropropagación o clonación in vitro de plantas.

• Producción in vitro de compuestos naturales de alto

valor y de interés para la industria farmacéutica y otras
en cultivos de células u órganos vegetales.

• Obtención de materiales mejorados mediante la

selección in vitro u otras técnicas.

• Conservación de germoplasma vegetal (p.ej., plantas

alimenticias, aromáticas, medicinales, ornamentales,
etc.) en condiciones de mínimo crecimiento o mediante
criopreservación.
San Miguel – La Mar (2017)
(2008)
(2017)
Erythrina edulis “basul”
1989
 1.- MICROPROPAGACIÓN IN VITRO

Consiste en la propagación asexual

de plantas utilizando las técnicas
de cultivo de tejidos in vitro.

Es una de las mayores

aplicaciones en biotecnología
vegetal, siendo la razón principal su
enorme productividad comparada
con las técnicas tradicionales de
propagación de plantas.
Ventajas
a) Es un sistema de propagación clonal, es decir, que mantiene
todas las características genotípicas del material inicial
seleccionado.

b) Es un sistema que se desarrolla dentro de un ambiente

controlado, por lo que no se ve afectado por factores
ambientales externos.

c) Se puede obtener un número ilimitado de plantas.

d) El espacio que se requiere es mínimo y el tiempo

empleado es relativamente coroto.

e) Las plantas que se obtienen están libres de bacterias, hongos y

nemátodos fitopatógenos; y con técnicas más específicas se
pueden liberar incluso de virus y viroides.
Etapas

Etapa 1. Selección de las plantas madre

Es una etapa preparativa, en la cual se seleccionan y
acondicionan las plantas madre que serán utilizadas
para iniciar los cultivos in vitro.

Etapa 2. Establecimiento de los cultivos axénicos

Referida a la elección del explante y la esterilización
del mismo para iniciar un cultivo axénico.

Etapa 3. Multiplicación del tejido

Aquí se realiza verdaderamente la micropropagación,
obteniéndose un gran número de nuevos brotes a partir
de cantidades mínimas de tejido.
Etapa 4. Elongación y enraizamiento
Consiste en que los pequeños brotes obtenidos formen
su sistema radical al mismo tiempo que se elonguen
para facilitar su manipulación y hacer más probable
su adaptación a las condiciones ambientales externas.

Etapa 5. Adaptación al medio externo

Debe ser lo más gradual posible, tanto en lo referente
a la disminución de la humedad relativa, al incremento
de la intensidad luminosa y al contacto con m.o. nocivos.

Frecuentemente las plantas generadas in vitro tienen

una cutícula poco desarrollada, el mecanismo de
cierre de los estomas está atrofiado, tienen menos
concentración de clorofila y no han desarrollado
mecanismos naturales de resistencia frente a patógenos.
Etapas de la micropropagación
 2.- CONSERVACIÓN DE GERMOPLASMA

Los bancos de germoplasma son colecciones de plantas

y variedades con características sobresalientes, de
importancia para la agricultura e industria, que se
mantienen en condiciones de mínimo crecimiento o
en criopreservación.

La preservación de este pool genético es importante para

el futuro de la agricultura y la industria, toda vez que las
diversas actividades humanas, tales como: aumento de
la actividad agrícola, sobreexplotación de bosques y selvas,
incremento de la población humana y su consecuente
necesidad de expansión territorial y la contaminación de
los ecosistemas, están modificando o destruyendo los
hábitats en los que se encuentra este pool genético.
 Presencia de investigación en 27
países de Sudamérica,
África, Asia y Sudamérica

Conserva in vitro la colección

mundial más grande de papa,
camote y sus parientes silvestres y
de raíces y tubérculos andinos
Viaje de Estudios 2016-I
Germoplasma de papa (CIP)
La Molina, Lima-Perú
Germoplasma de papa (CIP)
La Molina, Lima-Perú
Germoplasma de papa (CIP)
La Molina, Lima-Perú
Germoplasma de camote (CIP)
La Molina, Lima-Perú
Banco Mundial de Semillas de Svalbard (Noruega)

• Inaugurado el 2008, está situado en la isla de Spitsbergen, en el

archipiélago noruego de Svalbard, cerca de su capital, Longyearbyen.

• Es un enorme almacén subterráneo con tres cámaras de semillas de

miles de plantas de cultivo de todo el mundo; su ubicación a 130
metros sobre el nivel del mar garantiza que el suelo esté seco.

• El material vegetal se conserva a una temperatura natural de -3 a -6

°C, pero cuenta con una refrigeración artificial hasta -18 °C para
asegurar la conservación de las semillas durante años.

• Las cámaras están construidas a prueba de erupciones volcánicas,

terremotos, de hasta grado 10 en la escala de Richter, de radiación
solar y en caso de fallo eléctrico, el permafrost (capa de suelo
permanentemente congelada) del exterior actuaría como refrigerante
natural.
Longyearbyen-Noruega

Cajas de almacenamiento de semillas en

estanterías de metal dentro de la cámara
 3.- CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES

Una vez obtenidos los callos a partir de algún explante, los

mismos pueden disgregarse para obtener una
suspensión de células.

Esta suspensión puede utilizarse para producir

directamente metabolitos secundarios de interés para la
industria farmacéutica y alimentaria o para generar
embriones somáticos, que son la base de las semillas
sintéticas (no cigóticas, viables, con endosperma y
cubierta seminal, p.ej.,caña de azúcar, yuca, papa, ajo,
etc.).
Tipos de cultivos de células vegetales

(a) Cultivo de células vegetales en suspensión:

Se cultivan células aisladas o pequeños acúmulos no

diferenciados, en medio líquido, bajo agitación continua,
donde las células muestran una alta tasa de división
celular y una homogeneidad relativamente alta.

Es útil para:
* Realizar estudios fisiológicos a nivel celular
* La producción in vitro de metabolitos de interés
* La selección in vitro de variantes deseables
(b) Cultivo de protoplastos:

Se cultivan en medio líquido células desprovistas

de pared celular (eliminada por métodos físicos
o utilizando enzimas hidrolíticas).

Es de utilidad para:
* Fusión de protoplastos
* Clonación
* Transformación (microinyección, electroporación).

(c) Cultivo de células gaméticas:

Se aislan y cultivan en medio sólido con el fin de

obtener tejidos o plantas haploides.
 4.- CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES
EN SUSPENSIÓN

En teoría, puede iniciarse a partir de un explante;

pero hay mayor éxito y rapidez si se inicia
con tejido calloso.

Estas células, aunque no están diferenciadas,

contienen toda la información genética
presente en la planta normal.

El mantenimiento de las células indiferenciadas

está dado por la manipulación del contenido
hormonal del medio.

Para otros fines, el tejido calloso, bajo otro esquema

de contenido hormonal en el cultivo, puede iniciar el
desarrollo de raíces, tallos y plantas completas.
Inoculación
El cultivo se inicia inoculando
tejido calloso (5-20%) a
matraces con medio nutritivo.

Estos matraces se colocan en

un agitador rotatorio para
facilitar la dispersión celular y la
oxigenación del medio.

Para fines de producción se

utilizan biorreactores

Ejemplo:
Para establecer cultivos en suspensión de Capsicum
annum “ají”, se utilizan inóculos de 5 g de tejido calloso en
50 ml de medio líquido contenidos en matraces de 250 ml y
se incuban a 25°C, a 120 rpm, por 2-3 semanas.
Equipo de agitación orbital
Biorreactor
Curva de crecimiento

El crecimiento del cultivo de células

vegetales en suspensión muestra
un comportamiento sigmoide,
comprendiendo las 5 fases
características del
Crecimiento.

El tiempo de generación puede

variar de 24 a 150 h y un cultivo por
lote toma unos 25 a 30 días.
 Fase inicial de reposo. Caracterizada por poca o nula
división celular, lo que mantiene la densidad constante,
hay una alta actividad de síntesis de proteínas y las
células mantienen una alta cantidad de citoplasma en en
relación al volumen de las vacuolas.

Fase logarítmica. Caracterizada por una división celular

acelerada, pero por lo general tiene una corta duración,
de unas 3 a 4 generaciones, aunque es variable.

Fase linear. Hay un incremento linear en la población de

células, se incrementa el peso fresco y seco de las
células debido al crecimiento de las mismas.

Fase de desaceleración progresiva. Desaceleración

gradual en la tasa de división celular debido al
agotamiento del medio y acumulación de desechos y
restos celulares.

Fase estacionaria. Ya no hay división ni crecimiento

celular, las células son muy vacuoladas y frágiles.
Producción de metabolitos secundarios

Constituye una alternativa frente a la problemática

de la extracción y producción tradicional de
principios activos (fármacos) a partir de plantas
completas nativas o cultivadas:

* Disponibilidad de materia prima

* Fluctuación de los abastecimientos y la calidad
* Consideraciones políticas (patentes)
 SHIKONINA
Se requiere esperar 48 meses
para que la planta de
Lithospermun erythrorhizon
acumule 1.4% de shikonina;
mientras en 24 días el cultivo de
células acumula 20%
de shikonina, por lo que es 800
veces más productivo
 TAXOL
Se requieren 67 Kg de
corteza seca de Taxus
brevifolia para obtener
1 g de taxol
 QUININA
Se requiere esperar
hasta 20 años para
que de la
corteza del árbol
Cinchona ledgeriana
se puedan
extraer niveles
apropiados de
quinina
Metabolitos secundarios de mayor interés

• TERPENOS
• COMPUESTOS FENÓLICOS
• COMPUESTOS NITROGENADOS

Terpenos

Se forman por la polimerización de unidades de

isoprenos y esteroides y se dividen en seis grupos:
monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos,
tetraterpenos y esteroles, dentro de los cuales se
encuentran carotenos, glicósidos cardiotónicos, taxol,
entre otros.
Compuestos fenólicos

Entre los compuestos fenólicos se incluyen los

ácidos fenólicos, cumarinas, flavonoides y taninos.

Las aplicaciones farmacéuticas de estos compuestos

son considerables, se refieren a sus efectos como
analgésicos, antibacterianos, antihepatotóxicos,
antioxidantes, antitumorales, inmunoestimulantes,
entre otros.
Compuestos nitrogenados

Son principalmente los alcaloides y glucósidos

cianogénicos.

Los alcaloides son un diverso grupo de compuestos con

cerca de 4,000 estructuras conocidas; estos son
fisiológicamente activos en humanos (cocaína, nicotina,
morfina) y por supuesto de gran interés en la industria
farmacológica.

Por otra parte, los glucósidos cianogénicos, se consideran

posiblemente, los metabolitos secundarios con mayor
relación en las funciones de defensa.
Otras sustancias de interés industrial

Entre las sustancias de interés industrial que pueden ser producidas

por cultivo de células vegetales en suspensión, se incluyen:
Fármacos
Colorantes naturales
Saborizantes
Fragancias, etc.

Los casos exitosos que operan comercialmente son tres:

1) Producción de shikonina
2) Producción de purpurina
3) Producción de ginsenoides.

Los dos primeros realizados por la compañía Mitsui Petrochemical Ind.

Ltd. y el tercero por la compañía Nitto Denko Corp.
Usos y precios de algunos metabolitos secundarios producidos
por cultivo de células vegetales en suspensión
La limitación para la mayoría de casos que se vienen
estudiando sigue siendo el bajo rendimiento, en
comparación al que se obtiene en el cultivo normal
de plantas completas.

Esto podría deberse a la falta de diferenciación celular en

este tipo de cultivos, lo cual dificultaría la expresión total
de los genes involucrados en las vías metabólicas
secundarias.

También existen investigaciones en biotransformaciones

y sistemas de inmovilización en diferentes matrices.
¡Gracias!