BIOTECNOLOGIA VEGETAL

CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES

1 MARCO TEORICO

La biotecnología vegetal usa las ciencias y la tecnología en favor de las plantas,

metabolitos, productos, etc. La biotecnología vegetal es una de las más grandes
aplicaciones de la biotecnología

Las plantas poseen una característica individual que es la totipotencia; a partir

de esta totipotencia la planta se puede reproducir asexualmente, esto quiere
decir sin necesidad de fusión de células sexuales o gametos.

¿Qué es totipotencia?

Esto quiere decir que a partir de cualquier célula meristematica de la planta

podemos obtener órganos nuevos posteriormente un organismo completo .El
cultivo de tejidos vegetales implica un material vegetal diverso como puede ser:

Tejidos, órganos, plantas completas, células, protoplastos (células desprovistas

de la pared celular).
APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE CULTIVO:

 Propagación masiva de plantas; ya sean porque se encuentran en peligro

de extinción o por su difícil cultivo por otros métodos.
 Clonación de individuos; con el fin de que permanezcan sus
características genéticas durante todo el año.
 Obtención de plantas libres de virus; para esto se necesita un medio de
cultivo estéril con condiciones ambientales controladas.
 Producción de semillas sintéticas.
 Conservación del germoplasma (variabilidad genética de una población
de vegetales).
 Obtención de metabolitos secundarios.
 Producción de híbridos.
 Plantas mejoradas genéticamente, pueden ser los transgénicos.
 Germinación de semillas
 Producción de haploides
 Posteriores estudios fisiológicos

La capacidad de una célula diferenciada de generar tejidos nuevos y

posteriormente un organismo nuevo, disminuye con el grado de diferenciación
de la célula; pero esto puede cambiar si se tiene a esta célula en un medio de
cultivo que favorezca la generación de tejidos. Las células vegetales en un
medio de cultivo adicionado con hormonas vegetales y en condiciones asépticas
pueden dar 2 respuestas:
 Organogénesis o embriogénesis indirecta: Una des diferenciación celular
generar el crecimiento de un callo; este callo si se le lleva a condiciones
adecuadas puede dar a la formación de órganos o un organismo vegetal.
 Organogénesis o embriogénesis directa: una respuesta morfo genética puede
dar a formación unos órganos (organogénesis) o embriones somáticos.

ETAPAS DE UN CULTIVO IN VITRO

 Selección: escoger la plantea a la que se le extraerá el explanto

 Establecimiento invitro :en esta etapa se tiene que desinfectar el explanto ,
esta consiste en:
 Lavar con detergente tuvven o agrimicin
 Lavar con agua estéril (agua destilada llevada a la autoclave)
 Echar etanol al 70%
 Reposar con hipoclorito de sodio (lejía) por 10 min
 Lavar con agua estéril

Una vez desinfectado se procede a la adaptación del medio artificial en el cual

se también se necesitara un medio estéril.

 Propagación o multiplicación: para generar masa suficiente en brotes,

para la posterior regeneración de un número de plantas, en este proceso
habrá una mayor cantidad de cito quininas que son las encargadas de
hacer crecer brote
 Enraizamiento en esta etapa lo que abunda son las auxinas que son las
encargadas de hacer crecer las raíces, para este proceso se le tuvo que
haber cambiado a otro medio donde haya mayor cantidad de auxina,
esto se realizó con el fin de que los brotes o embriones somáticos se
conviertan en plántulas completas.
 Rusticación en este proceso la plántula que fue cultivada invitro se
adaptara a un ambiente exvitro para luego sembrarla como una planta
normal.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

A menor edad de la planta mayor potencial de regeneración, este puede variar

según su genotipo y las condiciones ambientales que se les dé al explanto

Se emplea un menor tiempo en el cultivo invitro que en la propagación en

tierra

EQUIPAMIENTO
Para poder realizar un cultivo invitro se necesita cuidados de esterilidad para
esto se necesitan estos equipos

Flujos laminares de trabajo: son estaciones de trabajo que hacen circular aire
filtrado y estéril
Soporte para explanto: este puede ser solido o liquido el cual contiene:
Un agente gelificante inerte que puede ser (agar, gelrite,etc).

Nutrientes (hidratos de carbono vitaminas).

Macronutrientes y micronutrientes estos son esenciales para la supervivencia de

la planta.

Agentes reguladores de crecimiento que pueden ser hormonas vegetales; estas

hormonas ayudaran a obtener un órgano específico de la planta o también una
planta completa a partir del ex planto seleccionado.

Intercambio: Algunos nutrientes pueden ser remplazados por extractos

vegetales como es el jugo de coco ,jugo de tomate que contienen altas
cantidades de nutrientes , vitaminas, proteínas, macronutrientes,
micronutrientes que ayudaran al crecimiento del explanto , aparte que este
remplazo de material ayudara a economizar este cultivo invitro.

IMPORTANTE

Para un correcto cultivo invitro se debe tener en cuenta diferentes factores como
es:

 El pH del medio de cultivo debe estar entre los valores de 5 -6.5pH

 Regulación de la temperatura
 Regulación del fotoperiodo, el fotoperiodo son las horas luz y las horas
oscuridad

Se puede generar la formación de diferentes órganos o la formación vegetal con

un balance hormonal o con condiciones de cultivo especiales. Sí se desea el
crecimiento de brotes, la relación de cito quininas /auxinas debe ser mayor a
uno; si se desea el crecimiento de raíz, la relación entre citoquininas /auxinas
debe ser menor a uno, pero si se desea el crecimiento de callos, la relación entre
citoquininas /auxinas debe ser uno.

2. OBJETIVOS

2.1 Entender los principios básicos y técnicas para el cultivo invitro de tejido
vegetales.

2.2Conocer el manejo apropiado del material vegetal para el cultivo invitro.

2.3Ejercitarse en el manejo correcto de los materiales e insumos necesarios.

2.4Entender la utilidad y el manejo básico de equipos, instrumentos y

herramientas para un laboratorio de tejidos vegetales.

2.5Aprender la importancia de la esterilidad de materiales y de la persona que

realiza el trabajo.
3 MATERIALES
3.1 MATERIAL BIOLOGICO

 Helecho
3.2 INSUMOS

 Etanol al 70%
 Hipoclorito de sodio al 2.5%
 Medios de cultivo (estéril)
 Agua destilada (estéril)
3.3 MATERIAL DE VIDRIO

 Vasos de precipitado de 50 ml
 Matraces Erlenmeyer de 200ml
 Frascos estériles
3.4 APARATOS Y EQUIPOS

 Cámara de flujo laminar horizontal

3.5 OTROS

 Mechero
 Pinzas (estéril)
 Bisturí (estéril)
 Plastigraf
 Ligas
 Algodón
 Papel (estéril)
4 PROCEDIMIENTO DETALLADO
4.1Selección: escoger la planta a la que se le extraerá el explante, en nuestro
caso fue el helecho

4.2Establecimiento invitro: en esta etapa se tiene que desinfectar el explanto ,

esta consiste en:

 Lavar con detergente tuvven o agrimicin

 Lavar con agua estéril (agua destilada llevada a la autoclave); el
autoclave es una maquina donde se lleva a unas temperaturas altas
con el fin de que las bacterias que puedan estar en el medio se
mueran y no afecten al cultivo
 Echar etanol al 70%, para seguir esterilizando
 Reposar con hipoclorito de sodio (lejía) por 10 min ,para eliminar las
bacterias que sobrevivieron al autoclave y al alcohol
  Lavar con agua estéril para remover el hipoclorito de sodio y restos
de la bacteria
4.2.2Una vez desinfectado se procede a la adaptación del medio artificial, el cual
se realizara en la cámara de flujo laminar siempre teniendo en cuenta la
necesidad de realizarse en una constante esterilidad del material.

Primero se puso las pinzas y el bisturí en alcohol luego se llevó al mechero

luego se llevó al alcohol luego al mechero luego al alcohol y finalmente al
mechero, se esperó que enfrié y se sacó un un pedazo de la ex plántula y se la
puso en una superficie esterilizada que en nuestro caso fue un recipiente de
vidrio

Luego se llevó las pinzas al mechero con el fin de esterilizar se esperó que enfrié
y se sujetó con las pinzas la ex plántula y se cortó con el bisturí ya esterilizado
la parte inferior del explanto y se eliminó.

Se colocó de manera vertical la parte superior de explanto en un frasco estéril

que contenía al agar con los (nutrientes, macronutrientes, micronutrientes,
vitaminas, etc.)

Luego se pasó todo el borde del frasco al mechero para eliminar bacterias
Luego se puso el plástico como si fuera una tapa y se colocó el nombre
correspondiente en el frasco y se llevó al medio artificial donde se regulo el
fotoperiodo (horas día horas noche)

 Propagación o multiplicación: luego de la plantación in vito se fue

controlando el crecimiento de los brotes de la planta cada 3 ,4 ,5 días en
donde se fue generando masa suficiente en brotes, para el posterior
enraizamiento. En este proceso de propagación habrá una mayor
cantidad de cito quininas ya que son las encargadas de hacer crecer
brotes.
 Enraizamiento: en esta etapa lo que abunda son las auxinas que son las
encargadas de hacer crecer las raíces, para este proceso se le tuvo que
haber cambiado a otro medio donde haya mayor cantidad de auxina,
esto se realizó con el fin de que los brotes o embriones somáticos se
conviertan en plántulas completas.
 Rusticación. En este proceso la plántula que fue cultivada invitro se
adaptara a un ambiente exvitro para luego sembrarla como una planta
normal.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En este proceso se tenía ya lista el explanto ya se encontraba lavado lo
que realizamos fue el establecimiento in vitro. Para esto se tuvo que tener
cuidados de esterilización tanto del material que se usó como de las áreas
de contacto con la planta, para esto nos lavamos las manos con jabon
luego nos echamos alcohol al 70 %
Una parte también importante se tuvo que tener un barbijo y tener el
cabello bien amarrado se tuvo todos estos cuidados para que no crezcan
hongos en el cultivo in vitro.
Primero se esterilizo el bisturí y las pinzas
Se extrajo el explanto
Se le corto su raíz ya que este ya no servía porque estuvo en contacto con
la lejía y si lo dejábamos iba a impedir que la planta crezca
Luego este fue plantado en un una mezcla de agar con macromoléculas
micro moléculas proteínas vitaminas hormonas etc.
Se llevó al mechero los bordes del frasco y se tapó con el plástico.
Se estuvo controlando cada 3, 4, 5 días y estos fueron los resultados:

Tercer día

Cuarto día

Quinto día
Discusión : en esta oportunidad de hacer un cultivo invitro , este se
contamino con hongos , pese a que no se tuvo los cuidados necesarios ya
que en el momento de realizar el establecimiento invitro en la cámara de
flujo tal vez no se lavó correctamente el bisturí o tal vez este bisturí
contaminado choco con la planta y la infecto.
También puede que haya afectado el que los compañeros que estaban
cerca de la cámara de flujo se pongan a hablar muy fuerte haciendo así
que el medio se contamine; ya que se mencionó anteriormente que en la
cámara de flujo nadie habla esto porque se estaría infectando el aire que
circula y como nos encontrábamos en un lugar cerrado puede que haya
pasado esto.
6 CONCLUSIONES
Este cultivo invitro puede ayudar a disminuir el tiempo de crecimiento
de las plantas
Puede mejorar el genoma de la planta obteniendo así plantas resistentes
a insectos , de esta manera se estaría ayudando a cuidar el medio
ambiente aparte de que se estaría generando mayor productividad ya
que no se morirían estas plantas.
Para poder obtener resultados positivos se debe tener en cuenta cada
factor ya que si no se tiene los cuidados de esterilidad este afectara a la
planta retardando su crecimiento e incluso hasta matándola; ya que
digamos el hongo que se infiltro en el cultivo puede que comience a
competir por los nutrientes con el explanto que se estableció invitro, así
puede que le quite los alimentos al explanto y lo contamine afectando su
sobrevivencia del explanto y matándolo.
7 RECOMENDACIÓN
Cada vez que se realice un experimento en el laboratorio siempre hay
que tener los cuidados mencionados y los cuidados de limpieza ya que si
no se tiene estos cuidados de limpieza puede que afecte al experimento
como fue en este caso que por falta de esterilidad se produjo un
crecimiento de hongo en el medio de cultivo de la planta.
Poner la planta parada y que no choque mucho a la parte superior del
recipiente
Antes de taparla con el plástico pasar los bordes del recipiente en el
mechero para eliminar las bacterias.
8 CUESTIONARIO
8.1 ¿Porque se esteriliza el medio de cultivo, el material de vidrio y el
instrumental para el cultivo invitro?
Porque constantemente se está tocando bacterias ya que son parte de
nosotros ya que sin estas nuestro sistema inmune podría disminuir
afectándonos, por esta misma razón se tiene que esterilizar el material ya
que en el aire se encuentran las bacterias por esto se tuvo que hacer en
una maquina con flujo laminar, la cual producía cierto calor que mataba
la mayoría de las bacterias del medio ambiente. Lo mismo sucede con el
vidrio y los instrumentos que con solo el aire se pueden contaminar no
solo con bacterias también con hongos.
8.2 ¿Cuál es la finalidad de usar la cámara de flujo laminar para el cultivo
invitro?
En el aire se encuentran las bacterias , para poder realizar correctamente
este cultivo invitro se tuvo que hacer en una maquina con flujo laminar,
la cual producía cierto calor que mataba la mayoría de las bacterias del
medio ambiente.
8.3 ¿Por qué se agrega sacarosa a los medios de cultivo?
Porque la sacarosa es un medio de energía y así como los animales
necesitan energía las plantas también necesitan energía por eso es
fundamental la sacarosa o cualquier medio de energía para su
funcionamiento.
8.4Cuáles son las ventajas de utilizar cultivo invitro en los tejidos
vegetales?
 La disminución del tiempo de cultivo de las plantas así como la
disminución de costos de producción
 Disminución de la contaminación al medio ambiente ya que se
está creando plantas modificadas genéticamente que son
resistentes a las plagas así se disminuye el uso de contaminantes
Germinación de semillas
Extracción de metabolitos secundarios
Obtención de plantas libres de virus
Producción de plantas en peligro de extinción
Producción de plantas que son difíciles de sembrar por medios naturales
8.5 ¿Cuáles son las hormonas vegetales y que funciones cumplen cada
una de ellas?
 Auxina: promueve el crecimiento de la raíz
  Citoquininas: promueve el crecimiento de los brotes
 Etileno: favorece el crecimiento horizontal de la planta, favorece la
maduración de frutos, produce la curvatura de las hojas hacia
abajo, induce a la formación de raíces.
 Ácido abscisico: restringe el crecimiento y la capacidad
reproductora en épocas desfavorables; induce a la senescencia de
las hojas; controla el cierre de los estromas.
 Giberelinas: promueve el crecimiento aun mayor del vástago
induce la germinación de semillas induce a la floración estimulan
la germinación del polen, producen frutos partenocarpicos.
8.6 Haga una lista de las 15 palabras clave de esta práctica y tradúzcalas
al idioma de ingles
 Cultivo: culture
 Invitro: en vidrio
 Exvitro: i exvitro
 Hormonas: hormone
 Esterilidad: sterility
 Cámara de flujo: flow chamber
 Nutrientes: nutrients
 Auxinas: auxin
 Citoquininas: cytokinins
 Selección: selection
 Explanto: explant
 Establecimiento: establishment
 Propagación: propagation
 Enraizamiento: rooting
 Aclimatación :acclimatization
9 BIBLIOGRAFIA
https://www.google.com.pe/search?site=&source=hp&ei=6kQ-
V_GuBILne7XjqugB&q=cultivo+en+ingles&oq=cultivo+en+ingles&gs_l=mobile-gws-
hp.3..0j0i22i30l4.169.6176.0.7020.15.12.0.1.1.0.1927.10728.3-
4j1j1j1j3j2.12.0....0...1c.1.64.mobile-gws-hp..7.8.4645...41j0i131.wJIIn_ksB_0#tw=
http://www.mclibre.org/otros/daniel_tomas/1bachillerato/12_relacion_reproduccion_
plantas/hormonas-vegetales/hormonas-vegetales.html
https://www.google.com.pe/search?site=&source=hp&ei=pzg-
V6jtPI7tesuMk5gJ&q=hormonas+vegetales+&oq=hormonas+vegetales+&gs_l=mob
ile-gws-hp.3..0l5.2489.8999.0.12564.20.17.0.7.7.0.1921.17869.4-
1j5j4j3j4.17.0....0...1c.1.64.mobile-gws-hp..10.10.1994.3..41j0i131.LowKuHH0t5U
https://es.scribd.com/mobile/doc/16584088/Tecnicas-de-cultivo-in-vitro-de-
plantas(2016, 01).https://es.scribd.com/mobile/doc/16584088/Tecnicas-de-
cultivo-in-vitro-de-plantas. Obtenido 01, 2016,
de https://es.scribd.com/mobile/doc/16584088/Tecnicas-de-cultivo-in-vitro-de-
plantas
10 ANEXOS
http://www.eead.csic.es/video-tecnicas-cultivo-in-vitro
(Este video me dio una idea de cuáles eran los pasos para realizar un fecundación invitro y cuál
es la importancia de cada uno de ellos)

Medio de Murashige & Skoog

peso para el mg/l del

Componente Peso molecular stock medio ()del medio ()SOL Stock ml/l
macronutrientes
NH4NO3 80.04 16g 1650 20.6mM 1000mM 0.0206
KNO3 101.01 20.2g 1900 18.8mM 1000mM 0.0188
CaCl2.2H2O 147.02 14.7g 440 2.99mM 1000mM 0.00299
MgSO4.7 H2O 246.37 24,6g 370 1.5mM 1000mM 0.0015
KH2PO4 136.09 1.36g 170 1.25mM 100mM 0.00125
Micronutrientes
MnSO4.4H2O 223.07 223mg 22.3 100uM 10000uM 0.01
ZnSO4.7H2O 287.46 287.46mg 8.6 29uM 10000uM 0.0029
H3BO3 61.83 61.83mg 6.2 100uM 10000uM 0.01
KI 166 16.6mg 0.83 5uM 1000uM 0.005
Na2MoO4.2H2O 241.95 24.2mgt 0.25 1uM 1000uM 0.001
CuSO4.5H2O 249.68 2.49mg 0.025 0.1uM 100uM 0.001
CoCl2.6H2O 237.93 2.38mg 0.025 0,1uM 100uM 0.001
FeEDTA
Na2EDTA.2H2O 337.98 338mg 37.3 100uM 10000uM 0.01
FeSO4.7H2O 278.05 278mg 27.8 100uM 10000uM 0.01
VITAMINAS & otros
GLICINA 75.07 75mg 2 26.6uM 10000uM 0.00266
Ac.Nicotinico 123.11 12.31mg 0.5 4uM 1000uM 0.004
Piridoxina.HCl 205.63 20.56mg 0.5 2.4uM 1000uM 0.0024
Tiamina.HCl 337.27 33.72mg 0.1 0.3uM 1000uM 0.0003
Mio-inositol 180.16 1.8mg 100 550uM 10000uM 0.055