TÉCNICO SUPERIOR EN LABORATORIO DE

DIAGNÓSTICO CLÍNICO Y BIOMÉDICO

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

PRÁCTICAS DE LABORATORIO GUIÓN DOS.

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Contenido
NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO.............................................. 3
Normas específicas para trabajar en un laboratorio de cultivos celulares: La técnica
aséptica. ..................................................................................................... 4
OBJETIVOS GENERALES DE LA PRÁCTICA ........................................................ 5
INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 6
◼ FUNDAMENTOS. ................................................................................... 7
CAMBIO DE MEDIO. MANTENIMIENTO ............................................................. 9
◼ MATERIAL Y REACTIVOS ....................................................................... 9
◼ MÉTODO ............................................................................................. 9
SUBCULTIVO CELULAR. TRIPSINIZACIÓN ........................................................ 11
◼ MATERIAL Y REACTIVOS ...................................................................... 11
◼ MÉTODO ............................................................................................ 11
CONTAJE CON CÁMARA DE NEUBAUER ........................................................... 13
◼ Fundamento ....................................................................................... 13
◼ Material ............................................................................................. 13
◼ Método .............................................................................................. 13
◼ RESULTADOS. .................................................................................... 14
PRÁCTICA 4 ............................................................................................... 15
CONGELACIÓN DE CÉLULAS.......................................................................... 15
◼ FUNDAMENTO..................................................................................... 15
◼ MATERIALES. ..................................................................................... 15
◼ MÉTODOS .......................................................................................... 15
Descongelación de líneas celulares ................................................................. 16

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NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

1. Es obligatoria la utilización de bata de laboratorio.

2. Sobre las mesas del laboratorio deben aparecer únicamente el material con el
que se va a trabajar. Los abrigos, bolsos, libros, etc. deben situarse en las
zonas dedicadas a tal fin.
3. Al finalizar la sesión práctica, el puesto de trabajo debe quedar limpio, recogido
y en perfectas condiciones de uso.
4. No se permite la entrada al laboratorio con comida o bebida.

5. En el laboratorio se debe llevar el pelo recogido y se debe tener precaución con

la llama de los mecheros.
6. En caso de accidentes, tales como roturas, derramamiento de cultivos, cortes,
quemaduras, etc. deberá advertirse inmediatamente al profesor encargado del
laboratorio, quien dará las instrucciones oportunas.
7. No debe arrojarse por la pila ni a la basura los cultivos y materiales con los que
se ha trabajado, hasta que no hayan sido esterilizados. Deberán depositarse
en los recipientes dispuestos a tal efecto.
8. Antes de salir del laboratorio es preciso lavarse las manos con agua y jabón.

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Normas específicas para trabajar en un laboratorio de
cultivos celulares: La técnica aséptica.

1. Lavado de manos.
2. Uso de guantes desechables y bata específica de cultivos.
3. La puerta de la sala debe estar siempre cerrada.
4. Uso exclusivo de material y reactivos estériles.
5. No introducir mecheros bunsen en las cabinas porque crean turbulencias.
6. Colocar en la cabina sólo el material que se va a utilizar en la sesión de trabajo.
7. No sacar el material estéril de su embalaje hasta el momento de uso.
8. El material usado reutilizable de vidrio se puede colocar en un recipiente con
hipoclorito sódico al 10%. Después lavar y esterilizar.
9. El material fungible que se utilícese deposita en contenedores adecuados para
material contaminado.
10. Restringir el acceso a la sala de cultivos al personal que esté realizando algún
procedimiento.
11. Limpiar las cabinas de flujo laminar con etanol al 70% o desinfectante especial para
cabinas.
12. Conocer la lámpara UV antes y después de trabajar durante al menos 15 minutos.
13. Realizar el mantenimiento adecuado de los filtros HEPA

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 OBJETIVOS GENERALES DE LA PRÁCTICA
Los objetivos fundamentales de esta práctica son:

- Conocer el equipamiento y funcionamiento de una sala de cultivos celulares.

- Aprender a preparar medios de cultivos celulares.

- Conocer y utilizar la técnica aséptica.

- Realizar “pases” de una línea celular de cultivo que crece en monocapa: HT1080 (células humanas
derivadas de tejido conectivo de un paciente con fibrosarcoma)

- Realizar el contaje de células con una cámara de Neubauer.

- Aprender a congelar y conservar una línea celular.

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INTRODUCCIÓN

El objetivo de esta práctica consiste en conocer cómo se trabaja en un laboratorio de cultivos

celulares.
Aprenderemos a mantener, pasar y conservar células animales.
Recuerda que se define el cultivo celular como el conjunto de procedimientos que hacen posible el
mantenimiento de células de organismos pluricelulares “in vitro”, preservando sus características
fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Gracias a esta práctica entenderemos cuáles son los factores que intervienen en el cultivo, los
procedimientos de un cultivo celular y las posibles fuentes de contaminación.
Recuerda que para trabajar en un laboratorio de cultivos celulares tenemos que trabajar en
condiciones de asepsia y que el equipamiento básico de un laboratorio de cultivos celulares es:
- Cabina de flujo laminar: Cabina de seguridad biológica de clase II. Previene la contaminación del
cultivo y protege al trabajador y al medio ambiente. Recuerda que consta de lámparas UVA para
esterilizar la superficie de trabajo antes de trabajar y también con filtros HEPA (High Efficiency
Particle Arresting) que son filtros de aire de alta eficiencia que retienen microorganismo y evitan
la contaminación de cultivos.
- Incubadores de CO2: Proporciona las condiciones ambientales óptimas para el crecimiento de
cultivos (temperatura, re circularización del aire, control del CO2 entre el 4 y 7%) y control de la
humedad.
- Microscopio invertido: Tiene invertidas la posición de la fuente de luz y el revólver de objetivos
respecto a un microscopio convencional.

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 ◼ FUNDAMENTOS.

Subcultivo

Ilustración 1. Curva de crecimiento celular

Antes de comenzar con la práctica deberíamos conocer la dinámica de crecimiento de un cultivo.

Esto se representa gráficamente con una curva de crecimiento que consta de las siguientes fases:
- Fase de latencia. Tramo recto sin pendiente. Corresponde a las primeras 24 h tras el pase. Las
células permanecen constantes o incluso pueden disminuir. Durante esta fase las células se
adhieren a la superficie.
- Fase de crecimiento exponencial: En este tipo celular ocurre de 24 a 48 horas y es cuando
las células aumentan de forma exponencial hasta alcanzar un máximo. En esta fase las células
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 proliferan y forman colonias celulares.
- Fase estacionaria: Tramo recto de pendiente nula. En esta fase, las células ya han ocupado
toda la superficie de la placa y ocurre la inhibición por contacto, las células inhiben su crecimiento
y si las células no se pasan, empezarían a morir. En este momento hay que realizar un subcultivo
o pase.

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 PRÁCTICA 1

CAMBIO DE MEDIO. MANTENIMIENTO

Cuando la línea celular ha crecido y ocupa gran parte de la superficie del frasco, en el medio se
consumen los nutrientes y se acumulan productos de deshecho. Se observa que el medio cambia de
un color rojo a un color naranja-amarillento que es la manifestación del cambio de pH del medio
(acidificación). Con el fin de reponer nutrientes y eliminar productos de degradación se cambia el medio
cada 2 a días, en el caso de este tipo de células.

◼ MATERIAL Y REACTIVOS

Material biológico:

▪ Frascos-25 con células HT1080

Material y reactivos.

▪ DMEM al 10% de FBS (suero fetal bovino) atemperado (en baño a 37°C al menos 30
minutos previos al cambio de medio)
▪ Pipetas 2 ml sin filtro para aspirar el medio.
▪ Pipetas 5 ml con filtro para añadir el medio y prepipeta.

Aparatos

▪ Campana de cultivos.
▪ Incubador de CO2.
▪ Aspirador de medio de cultivo con lejía.
▪ Puntas micropipeta p100

◼ MÉTODO

1. Preparar el medio de cultivo: Al medio DMEM añadiremos:

- 10% Suero fetal bovino descomplementado1 (50 ml a un frasco de 500 ml de DMEM)
- Antibióticos: Combinación de penicilina/estreptomicina a 100 U/ml y 100 µl/ml.

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Antes de añadir el FBS hay que inactivar las proteínas del comlemento. Para ello: 1. Se
descongela una botella de suero en un baño a 37ºC y después se sube la temperatura a
56ºC. 2. Se mantiene a esta temperatura durante 45 minutos. 3. Transcurrido ese tiempo,
sacar del baño, enfriar y hacer alícuotas de 50 ml para guardarlas a -20ºC. 4. Cuando se va
a usar, filtrar y añadir una alícuota a un bote
9 entero de DMEM.
 - Antifúngico: Anfotericina B a una concentración de 2-5µg/ml00000000009
2. Aspirar el medio dejando un poco del medio antiguo.
3. El motivo es mantener sustancias positivas para el crecimiento, si el medio está
completamente nuevo, induciría una parada o retraso en su crecimiento.
4. Para Frasco-25 añadir 5 ml de DMEM 10%FBS.
5. Dejar Frasco en incubadora de CO2.

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 PRÁCTICA 2

SUBCULTIVO CELULAR. TRIPSINIZACIÓN

Para levantar las líneas celulares se realiza una suspensión celular mediante el uso de tripsina
(proteasa), que digiere aquellas proteínas celulares implicadas en la adhesión celular

◼ MATERIAL Y REACTIVOS

Material biológico:

▪ Frascos-25 con células HT1080

Material y reactivos.

▪ Frascos-25 tratados para el tratamiento de células adherentes.

▪ DMEM (medio MEM -medio mínimo esencial de Eagle- mejorado por Dulbeco) al 10%
de FBS (suero fetal bovino) atemperado (en baño a 37°C al menos 30 minutos previos
al cambio de medio)
▪ PBS (tampón fosfato salino). En baño a 37°C al menos 30 minutos previos al cambio
de medio.
▪ Tripsina 0.25% con EDTA 0.53 mM: En baño a 37°C al menos 30 minutos previos al
cambio de medio.
▪ Pipetas 2 ml sin filtro para aspirar el medio.
▪ Pipetas 5 ml con filtro para añadir el medio y prepipeta.
▪ Tubos falcon de 15 ml para recoger las células.

Aparatos

▪ Campana de cultivos.
▪ Incubador de CO2.
▪ Aspirador de medio de cultivo con lejía.
▪ Puntas micropipeta p100

◼ MÉTODO

1. Aspirar el medio de cultivo del frasco previamente obtenida de incubadora de CO2.

2. Lavar 1 vez con 5ml de PBS para contribuir a debilitar la adherencia de las células al Frasco de
cultivo celular (así se elimina el suero del medio que contiene inhibidor de tripsina).
3. Añadir al frasco de cultivo 1 de Tripsina según tamaño del frasco. Mover horizontalmente por 1
minuto para cubrir toda la superficie. Dar unos pequeños golpecitos si es necesario y en células
resistentes incubar frasco con línea celular MÁS Tripsina por 5 minutos a 37° C.
4. Ir observando al microscopio para ver si se han levantado (las células deben verse redondas y
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 en movimiento (señal de que han perdido adherencia).
5. Parar la tripsina añadiendo 5 ml de medio DMEM al medio de cultivo.
6. Pipetear 2 o más veces la suspensión para acabar de levantar las células (pipetear arriba y
abajo, esparciendo la suspensión por toda la superficie del frasco).
7. Añadir las células a un tubo falcon para contarlas.
8. De los 6 ml que tenemos en el tubo falcon sembrar 1 ml en el nuevo falcon y conservar el resto
de células para congelarlas en el siguiente paso.
9. Añadir 5 ml de medio de cultivo DMEM.
10. Dejar Frasco en incubadora de CO2.

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 PRÁCTICA 3

CONTAJE CON CÁMARA DE NEUBAUER

◼ Fundamento
Para saber el número de células que existen en nuestros cultivos celulares, contaremos las células en la
cámara de Neubauer, un tipo de contador de células manual.

◼ Material

Material biológico:

▪ Suspensión de células HT1080

Material y reactivos.

▪ Cámara de Neubauer.
▪ Cubreobjetos de 22x22 mm
▪ Contador de células.
▪ Micropipeta p-200 o p-20 y puntas adecuadas.
▪ Tripán Blue al 0.4% en PBS.
▪ Tubos eppendorfs de 1.5 ml.
▪ Microscopio invertido para aumentar el contraste.

◼ Método
1. Preparar la muestra en un tubo eppendorf: Añadir 50 microlitros de muestra de células en
suspensión y 50 microlitros de azul tripán (dilución ½, el FD=2). Recuerda agitar bien la
suspensión de células para cogerlas bien. (Si la densidad inicial fuera muy elevada y cuesta
contar, hacer una dilución previa de las células 1/10-1/100 en PBS 1X)
2. El azul de tripán, un colorante vital, se introduce en las células con la membrana rota, muertas.
Observaremos:
• Las células vivas serán las células refringentes y blancas.
• Células azules. Son células muertas.
3. Cargar la muestra en la cámara de Neubauer: 10-20 microlitros con la micropipeta.
4. Colocar la cámara en el microscopio y poner el objetivo 10X. Veremos 16 cuadros de conteo.
5. Establecer criterios de conteo. Nosotros vamos a contar las que tocan el límite izquierdo y el
límite superior de cada uno de ellos cuadros. De esta forma evitaremos repetir el contaje de
células en dos cuadros.
6. Hacer media entre las zonas contadas: L1 y L4. Multiplicar por 10000 (ya que el volumen de
suspensión situado encima de un cuadrado es de = 1mm x 1mm x 0.1 mm= 0.1 mm3) y lo
multiplicaremos por la dilución. De este modo tendremos el número de células por mililitro.
7. Aplica la siguiente fórmula para calcular el número de células:
𝑐𝑒𝑙 𝑁 𝑥 10000 𝑥 𝐹𝐷
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 ( ) =
𝑚𝑙 𝑁º 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑜𝑠

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 Donde:
N= Número de células contadas en cada uno de los cuadrantes grandes (L1, L2, L3 o L4, cada
cuadrante tiene 16 cuadritos)
FD= Factor de dilución. Ejemplo: 1/5= multiplicar por 5.
Nº de cuadrantes= En nuestro caso contaremos sólo dos cuadrantes.
8. Si quieres puedes bajarte la aplicación CellsCalculator.

Ilustración 2. Cámara de Neubauer y orden de contaje

◼ RESULTADOS.

¿Cuántas células tienes en 1 ml de tu suspensión celular?

¿Cuántas células tienes en el total de tu suspensión celular?

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 PRÁCTICA 4
CONGELACIÓN DE CÉLULAS

◼ FUNDAMENTO
Las líneas celular continuas se pueden mantener en el tiempo mediante congelación con FBS al 10% de DMSO.

◼ MATERIALES.

Material biológico:

▪ Suspensión de células HT1080

Material y reactivos.

• DMEM al 10% de FBS (en baño a 37°C por 30 minutos previos)

• PBS (en baño a 37°C por 30 minutos previos)
• Tripsina
• FBS.
• DMSO.
• Frasco Vial (criotubo)
• Micropipetas 200 µl y micropipetas de 1000 µl.
• Puntas 100 µl o 200 µl
• Pipetas 2 ml sin filtro para aspirar.
• Pipetas de 5 ml con filtro
• Falcon-15 ml
• Frasco con línea celular previamente obtenida de incubador de CO2
• Frosty con isopropanol o recipiente con hielo conservar vial

Aparatos

▪ Campana de cultivos.
▪ Incubador de CO2.
▪ Aspirador de medio de cultivo con lejía.
▪ Centrífuga.

◼ MÉTODOS
1. Nosotros partiremos de la suspensión de células que obtuvimos cuando tripsinizamos en el paso
anterior. Si no realizaremos el proceso de tripsinización habitual.
2. Contar las células (nosotros ya las tenemos contadas)
3. Centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos.

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 4. Resuspender en el volumen adecuado para congelar unas 106 cél/ml.
5. Las células las congelaremos en 1 ml: 900 µl de FBS y 100 µl de DMSO (dimetilsulfóxido) como agente
crioprotector.
6. El DMSO es bastante tóxico. Para minimizar el tiempo que las células pasan a temperatura ambiente
en presencia de DMSO se debe enfriar las células lo antes posible (4°C), introducir en el frosty o en un
recipiente con hielo.
7. Etiquetar viales con línea celular y fecha.
8. Enfriar viales en hielo a 4°C por 5 minutos.
9. Luego congelar viales a -20°C por 2 horas.
10. El siguiente paso es congelar a -80°C o/n (también se puede dejar varios días si fuera necesario)
11. Al día siguiente guardar en Nitrógeno Líquido.

Ilustración 3. Frosty

Descongelación de líneas celulares

No realizaremos esta parte de la práctica, pero se haría del siguiente modo:

1. Sacar el criotubo con las células del tanque de Nitrógeno líquido.
2. Descongelar en la mano (hasta que queden algunos trocitos de hielo) o en un baño a 37ºC.
3. Limpiar la superficie del vial con etanol 70% para evitar contaminaciones.
4. Con ayuda de la pipeta, echar las células en un tubo de 15 ml (Falcon) cónico y añadir 5-10 ml de
medio a 37ºC.
5. Centrifugar 5 minutos, 800-1300 rpm, 37 ºC.
6. Retirar sobrenadante con ayuda de la pipeta o aspirando, para eliminar el DMSO.
7. Añadir al pellet 3 ml de medio y resuspenderlo con la pipeta recogiendo todo el contenido y soltar a
cierta distancia del fondo para ayudar a que se retire el botón del fondo, varias veces.
8. Verter todo el contenido en el frasco de cultivo
9. Añadir medio: 4 - 5 ml para los frascos de 25 cm3
10. Rotular indicando: Tipo de línea celular, fecha y nº de pase.
11. Estufa a 37ºC, 5% CO2

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