CENTRO DE CIENCIAS BSICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERA BIOQUMICA

ACADEMIA DE BIOTECNOLOGA

Cultivo de Tejidos Vegetales

Ing. Bioqumica
6 semestre

Profesora Dra. Norma Chvez Vela

Pablo Rodrigo Snchez Hernndez

Claudia Georgina Dvila Zamora
Cristina Aime Aburto Snchez
Alicia Alejandra Mier Gonzlez
Cynthia Alejandra Alba Zavala
Ruth Mara Rivera Aburto
Jos Carlos Bon Lpez
Ixchel Campos Avelar

Fecha de entrega: Martes 10 de junio del 2014

1. Explique detalladamente los pasos que se tendran que seguir

para conseguir experimentalmente los mejores resultados de
organognesis de un cultivo de tejido vegetal (indique paso por
paso las variables y tcnicas de cultivo a desarrollar).
1. Desinfeccin del material vegetal
Es imprescindible que los inculos empleados en el cultivo de tejidos vegetales
sean aspticos ya que la mayora de las especies presentan contaminantes
superficiales e incluso patgenos endgenos, por lo que, de no eliminarse,
provocan la prdida total de los explantes.
Por lo anterior se lleva a cabo lo siguiente:

Predesinfeccin de la semilla
Para este paso se puede emplear hipoclorito de sodio comercial, en el cual se
sumergen las semillas durante 5 minutos para luego enjuagarse con agua de la
llave por 5 minutos ms.
Desinfeccin de las semillas
Bajo una campana de flujo laminar las semillas se colocan en una solucin de
perxido de hidrgeno durante 45 minutos con el propsito de eliminar el
exceso del agente desinfectante. Despus se realizan tres enjuagues con agua
bidestilada esterilizada.
Posteriormente las semillas se transfieren a etanol al 70% durante 1 minuto y
luego se enjuagan con agua destilada por 5 minutos.
Finalmente se sumergen las semillas durante 5 minutos en una solucin al 15%
de hipoclorito de sodio, adicionado con 0.5 ml de poliexietileno sorbitan
monolaurato (Tween-20) seguido de 3 enjuagues por 5 minutos con agua
esterilizada.
2. Medio de cultivo
Depender del tipo de cultivo a utilizar. Usualmente se emplean medios
bsicos como el DCR o el GD, a los cuales se les adicionan componentes
orgnicos como glicina, glutamina, etc. As como reguladores de crecimiento;
preferentemente en una relacin auxina/citocinina baja, para inducir la
formacin de la parte area.
Una vez preparados y vaciados en frascos de vidrio se deben esterilizar a
121C y 1 atm de presin por 15 minutos.
3. Explante o inculo
Se emplean embriones maduros como fuente de inculo, de los cuales se
disectan los cotiledones y se siembran en forma horizontal con el propsito de
que cada uno de los cotiledones est en contacto con el medio de cultivo.
4. Condiciones del cultivo in vitro
Las unidades experimentales se colocan en un cuarto de incubacin con un
fotoperiodo de 16 horas luz e intensidad 2000 lux, con una temperatura de
26C 2C durante 4 o 6 semanas para la etapa de induccin.

5. Induccin y desarrollo de yemas adventicias

Se evala el nmero de cotiledones que respondieron al tratamiento, es decir,
aquellos que presenten visiblemente estructuras nodulares en la superficie.
6. Alargamiento de yemas
Los cotiledones que presenten primordios de yemas deben ser transferidos a
medios DCR o GD pero sin reguladores de crecimiento, con el propsito de
acelerar el alargamiento. Deben permanecer ah aproximadamente 6 semanas
durante las cuales se evale el nmero de cotiledones que presenten brotes,
en donde se observen al menos dos primordios foliares bien desarrollados.
7. Formacin de brotes
Una vez concluida la etapa de alargamiento de yemas, los explantes se
transfieren a medios de cultivo DCR o GD sin reguladores de crecimiento,
adicionados con 0.1% de carbn activado. En estas condiciones permanecen
por 8 semanas y se evalan el nmero de brotes por cotiledn, el nmero de
brotes por embrin y el nmero de brotes mayores a 5 mm.
8. Enraizamiento
En esta fase se procede a separa los brotes, tomndose en consideracin
nicamente aquellos que midan 5mm o ms. Posteriormente los brotes
mencionados se colocan por 2.5 horas en una solucin saturada con 1.75 mg
de NAA y 0.20 mg de IBA estandarizada a un pH de 4.5; despus se siembran
en medios de cultivo DCR y GD con reguladores de crecimiento
auxina/citoquinina en relacin alta para favorecer la formacin de races y con
0.1% de carbn activado, permaneciendo 8 semanas en estas condiciones en
el cuarto de incubacin con las mismas condiciones de temperatura y
fotoperiodo de las etapas anteriores.
Fuentes:
Tesis: Induccin de organognesis y embriognesis somtica en Pinus
cembroides (Zucc) y Pinus halepensis (Mill). Universidad Autnoma de Nuevo
Len.
http://eprints.uanl.mx/1803/1/1080071706.PDF
http://www.uam.es/docencia/LAvanFis/CI/CharlaCultinvitro0607.pdf
2. Seleccione un cultivo de importancia regional y explique
detalladamente que tcnicas de CTV se podran aplicar para
mejorar la productividad de este. Justifique su respuesta
El maz es una gramnea de produccin mundial, cuya adaptabilidad permite su
cultivo en ms de 113 pases. Entre sus principales usos se encuentran la
alimentacin humana, animal y produccin de almidones; por otra parte, es un
insumo para la elaboracin de aceites, pinturas, caucho y jabones, entre otros.

En Mxico es el principal cultivo, dada su importancia en la ingesta diaria de la

poblacin. No obstante, de los ms de 30 millones de toneladas que se
consumen anualmente, solo 21.5 millones son producidas nacionalmente. Es
decir, somos deficitarios en cerca de 28.1% del consumo nacional aparente.
Por estas razones, sera recomendable modificar el cultivo, agregando un
regulador de crecimiento vegetal. Para poder realizarlo se debe tener en
cuenta que la respuesta del cultivo depende de su estado fisiolgico, su origen
y tipo celular.
Tambin se puede realizar una micropropagacin que es una tcnica muy
utilizada en cultivos de importancia econmica. Permite cultivar clulas,
tejidos, rganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos de forma
rpida. As, a partir de una planta madre se obtienen numerosos explantes que,
sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darn lugar a nuevas
plantas iguales a la planta original, permitiendo su multiplicacin.
La creacin de cultivos con resistencia intrnseca al estrs bitico y abitico,
ayudara a estabilizar la produccin anual. Se estudiara las principales
condiciones que afectan el crecimiento del maz, o los virus ms persistentes y
en base a eso se realizaran las modificaciones adecuadas.
3. Investigue y reporte al menos cuatro investigaciones que se
estn haciendo o se hayan hecho en la regin y que involucren
CTV.
Nombre

Objetivo

Tipos de RCV

El cultivo in vitro
como
herramienta para
el
aprovechamiento,
mejoramiento y
conservacin de
especies del
gnero Agave
(2008)
MC. Manuel
Salvador
Domnguez
Rosales, Bil. Ma.
de la Luz
Gonzlez
Jimnez ,
Citlalli Rosales
Gmez, Csar

Propagacin
masiva in vitro
de varias
especies de
Agave

Cinetina (Cin)

Concentraciones
de RCV
1.5 mg/L

Benciladenina (BA)

1 mg/L 2.0 mg/L

6-,Dimetilalilaminopu
rina (2iP)
Tidiazurn (TDZ)

1.0 mg/L-2.0
mg/L

Metatopolina (MT)

1 mg/L

0.1 mg/L

Quiones Valles,
Silvestre
Delgadillo Daz de
Len,
Silvia Julieta
Mireles Ordaz ,Dr.
Eugenio Prez
Molphe Balch
Estudio de la
produccin de
Betelainas en
cultivos in vitro
de cactceas del
genero
Mammillaria
LAQB Leticia del
Roco Morones
Ruiz, Pas. Bil.
Axel Flores Serna,
TLQ Martha Evelia
Prez Reyes, IBQ
Hugo J. Lizalde
Viramontes, MC
Eugenio Prez
Molphe Balch.

Desarrollo de
sistemas para la
propagacin
masiva del clavel
(Dianthus
caryophyllus) y
del ave del
paraso (Strelitzia
reginae) a travs
del cultivo de
tejidos vegetales
TLQ Martha Evelia
Prez Reyes, MC
Eugenio Prez
Molphe Balch, IBQ

Estudiar la
produccin in
vitro de
betalanas bajo
diferentes
sistemas de
cultivo de tejidos
de cactceas del
genero
Mammillaria , as
como estudiar la
posibilidad de
incrementar
dicha produccin
mediante la
adicin de
compuestos
orgnicos al
medio de cultivo
y la seleccin de
lneas celulares
altamente
productoras de
pigmentos.
Presentar una
alternativa para
resolver los
problemas que
presenta la
propagacin del
clavel y del ave
del paraso.

Ac. indolactico
Ac.
2,4.diclorofenoxiac
tico
Ac. Indobutirico

0.1, 1.0 y 2.0

mg/L

Cinetina

2 mg/L

Ac. Naftalenactico

0.2 mg/L

Ac. Indolactico

0.5 mg/L

Hugo J. Lizalde
Viramontes, M.C.
Rafael Gutierrez
Campos
Seleccin de un
medio de cultivo
adecuado para
producir
pigmentos al
cultivar races
normales de
Betabel (Beta
vulgaris)

Seleccionar un
medio adecuado
para cultivar
races normales y
poder
posteriormente
compararlo con
los de produccin
por races
trasformadas.

ANA (cido
naftalenactico)

0.1 mg/L

4. Indique y explique los principales problemas que se asocian a

CTV, cmo pueden corregirse estos?
a. Contaminacin: sucede con mucha frecuencia porque los medios
que se utilizan son muy ricos, en los cuales puede crecer una
amplia gama de microorganismos. Entre estos se encuentran los
inmediatos: virus, bacterias, micoplasmas y hongos, que se
manifiestan al poco tiempo de montar el cultivo y los crpticos o
subliminales para los que el medio no es tan adecuado y su
crecimiento se nota mucho tiempo despus de establecido el
cultivo.
Las fuentes de contaminacin suelen ser dos, externa cuando
proviene del material y el ambiente en el que se manipulan los
tejidos e interna cuando los mismos microorganismos presentes
de forma natural en la planta crecen con ella al cultivarla in vitro.
Para evitar contaminacin externa se debe trabajar en un rea
axnica, idealmente una campana de flujo laminar todas las
manipulaciones que impliquen la exposicin de los tejidos o del
medio de cultivo; esterilizar todos los instrumento utilizados para
la manipulacin de los tejidos antes de hacer uso de ellos, en
autoclave y con alcohol al 70% para pasarlos despus por la
flama; guardar los frascos en un ambiente libre de polvo y de
corrientes de aire durante el periodo de incubacin,
perfectamente cerrados o con una membrana en la tapa tan
delgada que permita el intercambio de aire con el exterior,
impidiendo la entrada de agentes externos.
Dentro de la contaminacin interna tambin existe una
subdivisin entre los microorganismos endofticos cuyo hbitat se
encuentra dentro de los tejidos vegetales y aquellos organismos
que habitan en el exterior de la planta. Para los primeros se
cuenta con la opcin de utilizar antibiticos o aislar y cultivar
meristemos sometidos a quimioterapia o termoterapia. Para los
segundos se aplican mtodos de esterilizacin superficial del
tejido, usando compuestos qumicos capaces de eliminar a los

microorganismos, aplicados uno tras otro con el fin de

potencializar su efecto disminuyendo el tiempo de exposicin,
dando un lavado previo con agua y jabn a los explantes, usando
vaco o un detergente suave para que penetre ms fcilmente,
pretratar a las plantas madre con fungicidas y tenindolas en un
ambiente lo ms limpio posible; otra alternativa es la utilizacipon
de cultivos axnicos, estos se obtienen esterilizando semillas y
germinndolas en condiciones aspticas para obtener plntulas de
las que a su vez se obtienen explantes y si algn explante es muy
proclive a la contaminacin entonces se inocula con 1 o 2
explantes por recipiente para que la contaminacin no afecte al
resto del cultivo.
b. Vitrificacin: la planta adquiere un aspecto vtreo, con una pared
celular delgada y poco lignificada, grandes espacios intercelulares
llenos de agua, deformaciones en la cutcula y atrofia de los
estomas. Se cree que el proceso es favorecido por el exceso de
nutrientes, especialmente los carbohidratos, altos niveles de RCV,
baja intensidad luminosa, alta humedad relativa y alta
disponibilidad de agua en el medio. Las plantas pueden prosperar
in vitro, pero no in vivo. Se puede evitar parcialmente utilizando
altas concentraciones de agar en el medio, aadiendo
polietilenglicol, reduciendo la concentracin de RCVs y utilizando
algunos compuestos como el floroglucinol.
c. Oxidacin: al herir la planta para obtener un explante, el tejido
herido excreta gran cantidad de compuestos fenlicos que
intervienen en el proceso de cicatrizacin y que son oxidados,
creando quinonas que son txicas y pueden provocar la necrosis
de todo el explante. Hay cinco medidas que pueden tomarse: la
primera, cortar los explantes y colocarlos en agua estril que se
cambiara peridicamente, el agua puede estar adicionada o no
con un antioxidante; segunda, agregar antioxidantes al medio de
cultivo; tercera, usar en el medio de cultivo agentes que absorben
los compuestos fenlicos excretados; cuarta, incubar a bajas
temperaturas los primeros das y sub-cultivar con frecuencia y
quinta, dar un pre-tratamiento con fro a los explantes antes de
inocular.
Fuente:
Prez Molphe Balch, E. M., Ramrez Malagn, R., Nez Palenius, H. G., & Ochoa
Alejo, N. (1999). Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. Aguascalientes:
Editorial de la UAA.

5. Seleccione un cultivo de inters nacional e indique las mejoras

genticas que se estn haciendo o que se le hayan hecho,
aclarando que sistema de transformacin gentica se utiliz.
6. Importancia, aplicacin, ventajas y desventajas del cultivo de
races.
Importancia: las races son rganos muy importantes para la suprvivencia de la
planta, ya que realizan funciones como la absorcin y el transporte de agua y
nutrientes, adems de tener valor comercial porque algunas de ellas son
consumidas por los humanos. Representan tambin uno de los primeros logros
importantes dentro del cultivo de tejidos vegetales, con amplias posibilidades
de aumentar su importancia econmica gracias a las nuevas tcnicas que
involucran a Agrobacterium rhizogenes.
Aplicaciones:

Estudio de los procesos metablicos qu se relaconan con el metabolismo

de carbohidratos, vitaminas, reguladores del crecimiento y absorcin y
translocacin de nutrientes.
Estudios de diferenciacin y desarrollo de las races y en laninteraccin
de estas con otros organismos como Rhizobium y nematodos parasitos.
Estudio de sntesis de compuestos secundarios de inters para la posible
produccin masiva in vitro de los mismos.
Transformacin gentica con A. rhizogenes.

Ventajas:

Algunos tipos de races pueden mantenerse in vitro por tiempo

indefinido o por periodos muy largos de tiempo.
Cuando se transforma con Agrobacterium hay estabilidad gentica y
bioqumica, crecimiento rpido, capacidad biosinttica similar a las
races de la planta completa, se puede establecer cultivo en
fermentadores y es posible la manipulacin gentica.

Desventajas:

Se deben regular los RCV exgenos para evitqr que la raz se diferencie.
Agrobacterium nicamente transforma dicotiledneas.
Para la produccin y obtencin de metabolitos secundarios en
biofermentadores est limitado nicamente a aquellos que se sintetizan
en la raz.

Fuente:
Prez Molphe Balch, E. M., Ramrez Malagn, R., Nez Palenius, H. G., & Ochoa
Alejo, N. (1999). Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. Aguascalientes:
Editorial de la UAA.

7. Importancia, aplicacin, ventajas y desventajas del cultivo de

embriones somticos.
Importancia: los embriones somticos demuestran la pluripotencialidad
las clulas vegetales, ya que ciertas clulas, bajo ciertas condiciones
cultivo in vitro tienen la capacidad de formar embriones mediante
proceso muy similar a la embriognesis cigtica, teniendo tambin
capacidad de formar una nueva planta despus de un proceso
germinacin.

de
de
un
la
de

Aplicaciones:

Semillas artificiales en las que el embrin est envuelto en una

matriz de nutrientes, con cido abscsico como retardador.
Obtencin de clones de la planta madre.

Ventajas:

Mayor productividad respecto al nmero de plantas producidas.

No hay variabilidad se pueden realizar estudios de gentica
Origen unicelular, es una va de regeneracin aplicable a la
transformacin gentica.

Desventajas:

Se puede hacer en un menor nmero de especies que la

organognesis, porque es un fenmeno en apariencia ms
complicado.
Su germinacin slo ocurre in vitro o cuando se les proporcionan
depsitos artificiales de nutrientes.
No todas las especies tienen clulas inducibles que se puedan
transformar a prioembriognicas.
Se debe mantener un cuidadoso control de los RCVs durante todo el
proceso.

Fuente:
Prez Molphe Balch, E. M., Ramrez Malagn, R., Nez Palenius, H. G., & Ochoa
Alejo, N. (1999). Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. Aguascalientes:
Editorial de la UAA.

8. Importancia, aplicacin, ventajas y desventajas del cultivo de

tejido calloso.
Importancia: Se le denomina as a una masa amorfa de clulas vegetales poco
diferenciadas y de rpida proliferacin. Se obtiene y mantiene con facilidad in
vitro, con la posibilidad de usarlo para obtener clulas de cultivo en suspensin
o para la regeneracin de plantas.
Aplicaciones:

Modelo para estudios de metabolismo celular, produccin de

compuestos secundarios, fitotoxicologa y ultraestructura celular.
Estudio de mecanismos celulares de respuesta a condiciones de estrs.
Cultivo de donde se obtienen las clulas en suspensin.
Paso intermedio en la regeneracin de plantas por organognesis o
embriognesis somtica.

Ventajas:

Es inducible en casi cualquier tejido vegetal.

Alta friabilidad (tendencia de las clulas a separarse unas de otras).
Puede mantenerse tiempo indefinido si se subcultiva con frecuencia.
Debido a las variaciones genticas es posible regenerar plantas
fenotpicamente diferentes a la original, sirve para programas de
mejoramiento gentico en los que la variabilidad gentica natural est
muy reducida.

Desventajas:

Demanda subcultivos frecuentes, de lo contrario se presenta

agotamiento de los nutrientes, desecacin del medio e incluso la
necrosis.
Difcil determinacin de la tasa del crecimiento, lo que dificulta conocer
las efectos de los RCVs aadidos, dificultando tambin el saber la
concentracin ptima de los mismos.
Aparicin de cambios genticos y epigenticos que causan una prdida
progresiva de la capacidad morfognica de los tejidos, afectando los
estudios genticos y la capacidad de regeneracin de plantas a partir del
mismo.

Fuente:
Prez Molphe Balch, E. M., Ramrez Malagn, R., Nez Palenius, H. G., & Ochoa
Alejo, N. (1999). Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. Aguascalientes:
Editorial de la UAA.