ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA

Almeida Guerrero Andrea Carolina

UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE
NRC:1233
acalmeida4@espe.edu.ec

I. OBJETIVO GENERAL

Separar los componentes del extracto de una rosa, y comparar con un estándar vegetal
empleando la técnica de cromatografía en papel.

II. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

A. Redactar el procedimiento que se sigue para la técnica de cromatografía en papel

B. Determinar el factor de retención del extracto de una rosa y un estándar vegetal.
C. Emplear el espectrofotómetro para la determinación de la longitud de onda y la
absorbancia , tanto de la muestra como el estándar.
D. Determinar el factor de retención del extracto de una rosa, empleando la técnica de
cromatografía en papel.

III. MARCO TEÓRICO

A. Cromatografía

La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que presenta

distintas variantes. En toda separación cromatográfica hay dos fases (sólida, líquida o gas)
una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un
contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra
se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar
invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la
separación. Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se
mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el
producto queda retenido y su salida es mucho más lenta. (Quiored, 2015)

La cromatografía puede ser preparativa y analítica.

 La cromatografía preparativa se refiere a la separación de los componentes de una

mezcla para su posterior procesamiento, y se puede considerar un método de
purificación.
 En la cromatografía analítica generalmente se hace con una pequeña muestra
permitiendo para cuantificar la proporción relativa de los componentes en la mezcla.
 El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un
cromatograma es la polaridad del disolvente. Una lista de los disolventes más usados en
los diferentes tipos de cromatografía, en orden de polaridad creciente, se indica en la
Figura 1. Entre más polar sea un disolvente, más rápido es el movimiento de los
compuestos y menos efectiva la separación. (Iberoamericana, 2015)

Fig.1 Polaridad de los solventes

Iberoamericana 2015

B. Tipos de cromatografía en la fase móvil

a. Cromatografía líquida

La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un sólido que

interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido), o bien un
líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido
(cromatografía líquido -líquido). Esta forma de cromatografía puede realizarse con
diferentes arreglos experimentales: en columna, en capa delgada o en papel. (UNAM,
2007)

Fig.2 Cromatografía de líquidos

Slideplayer(2016)
b. Cromatografía de gases
 En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un
sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte
(cromatografía gas-líquido). Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la
única manera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del
sistema. La columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la
cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un
tubo muy delgado (0.2 5mm de diámetro) y largo (hasta 100m). De acuerdo con el
mecanismo de retención, la cromatografía se puede clasificar en los siguientes tipos: absorción
(normal, de fase reversa) , partición líquido-líquido , intercambio iónico , permeación sobre gel , de
afinidad. (UNAM, 2007)

Fig.3 Cromatografía de gases

Almeida Andrea (2018)

C. Tipos de cromatografía en la fase estacionaria.

a. Cromatografía en papel

La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar

análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica potente no requiere de ningún tipo de
equipamiento. La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de
filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la disolución y
evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender
por capilaridad. La separación se realiza en función de la afinidad de los solutos con las dos
fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó la muestra, y
las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Las
sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos físicos o químicos
Hay varios tipos de cromatografía, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel
invertido), radial y de separación de zonas y sectores. (UNAM, 2007)
 Fig.4 Cromatografía en papel
UNAM (2007)

b. Cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un

adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales
son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante
la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen
las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y
una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un
sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general
menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con
mayor velocidad serán los menos polares.
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados
con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen
con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. (UNAM, 2007)

Fig.5 Cromatografía de capa fina

Química (2015)
c. Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad

de fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de
soporte porque están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz
inerte que debe de tener una estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de
cambio de pH, detergentes y agentes disociantes, para así, retener y adsorber
específicamente a las proteínas, la fase estacionaria es sólida. (UNAM, 2007)

D. Técnica de cromatografía en papel

Consiste en la aplicación de una solución en un punto cercano a la hoja de papel filtro. Se

crea una fase liquida estacionaria cuando el papel se impregna con un poco de disolvente
adecuado. Un borde del papel cerca del lugar donde se coloca la muestra se sumerge en
otro disolvente en el que los componentes de la mezcla son solubles en diversos grados. El
disolvente penetra en el papel por la acción capilar y al pasar por el punto de la muestra, se
lleva los diversos componentes de ésta. Los componentes se mueven con el disolvente que
fluye a velocidades que dependen de sus solubilidades en los disolventes estacionario y
móvil. La separación de los componentes se produce si hay diferencias en sus solubilidades
relativas en los dos disolventes. El disolvente que fluye llega lo más lejos del borde del
papel, ambos disolventes se evaporan, y la ubicación de los componentes separados se
identifica generalmente por aplicación de los reactivos que forman compuestos coloreados
con las sustancias separadas.
Los componentes separados aparecen como manchas individuales sobre el camino del
disolvente. Si el disolvente fluye en una dirección en la cual no es capaz de separar todos
los componentes de forma satisfactoria, el papel se puede girar 90 ° y el proceso se repite
utilizando otro disolvente.
En la cromatografía en papel, la distancia que ha viajado cada componente se mide desde la
parte superior de la mancha aplicada; en la cromatografía en capa delgada se mide desde el
centro de la mancha. Si los componentes no corren uniformemente, sino que se desplazan
formando una cola, el Rf debe reportarse como un rango de valores. (UNAM, 2007)

E. Factor de retención RF

La constante Rf (Factor de retención) es simplemente una manera de expresar la posición

de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal y mide la retención de un
componente. Se define como:

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛

𝑅𝑓 = (1)
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la

mancha, los cálculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los Rf
sean reproducirles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase
móvil, fase estacionaria, cantidad de muestra)
El máximo valor de Rf que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un Rf entre 0,55 y 0,7.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se
desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los Rf y si son distintos,
puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el
contrario, si los Rf son iguales, los compuestos pueden ser iguales o no. (Mendoza, 2014)
También se puede definir el coeficiente de distribución, K, en términos de la concentración
del soluto en la fase móvil, Cm, y en la fase estacionaria, Cs:

𝐶𝑠
𝐾= (2)
𝐶𝑚

F. Factores de influencia en la retención

La retención que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la

diferencia de polaridades entre las fases estacionaria y la móvil, promoviendo que el soluto
se reparta entre ellas según su coeficiente de distribución. De esta manera, al separarse una
mezcla que contenga solutos con polaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de
distribución distintos, la retención será diferente para cada uno.

G. Elección del absorbente

Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del
adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque
también se le puede añadir un adherente. En la elección del eluyente influyen varios
factores: precio, pureza, no utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad), no utilizar
compuestos muy volátiles, evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez menos polares. (UNAM, 2007)

Fig6.Diferencias del eluyente

UNAM (2007)
H. Definición Botánica de la Rosa

Orden: Rosales
Familia: Rosaceae
Subfamilia: Rosoideae
Género: Rosa

Los rosales son de hoja perenne o caduca, con una longitud de 5 a 15 centímetros. Las
hojas se disponen de forma alterna a lo largo del tallo, es decir, no se encuentran de forma
paralela, y el tallo, a menudo espinoso, es erecto o curvado en algunos casos. Las flores son
la parte más llamativa de las plantas. Por lo general tienen 5 pétalos, pero otras pueden
tener más o menos; muchas especies híbridas o cultivadas presentan mayor cantidad. Los
pétalos tienen 2 lóbulos y debajo se sitúan 4 o 5 pétales, de acuerdo con la especie. Los
colores son diversos: desde el blanco hasta el rojo brillante con especies de color rosado,
amarillo, fucsia, etcétera. (bioenciclopedia, 2014)

Fig7.Rosas rojas
Almeida Andrea (2018)

Las rosas pueden crecer en todo el mundo, pero mayormente en zonas templadas y
subtropicales y con excepción en las regiones más frías. La mayoría de las especies
silvestres son nativas del continente asiático, pero el origen exacto del género es
desconocido.

Las rosas que fueron ocupadas en laboratorio fueron extraídas del sector El Colibrí en el
cantón Rumiñahui de un invernadero de casa.
I. Antocianinas

Las antocianinas son pigmentos responsables por una variedad de colores atractivos y
brillantes de frutas, flores y hojas que varían desde el rojo vivo al violeta o azul. Son
obtenidas fácilmente por extracción a frío con metanol o etanol débilmente acidificado.

Las antocianinas son pigmentos responsables por una variedad de colores atractivos y
brillantes de frutas, flores y hojas que varían desde el rojo vivo al violeta o azul. Son
obtenidas fácilmente por extracción a frío con metanol o etanol débilmente acidificado.

Son siempre encontradas en la forma de glucósidos fácilmente hidrolizados por

calentamiento con HCl 2N, en azúcares y agliconas, denominadas antocianidas. Las
antocianidas tienen como estructura básica el catión 2- fenilbenzopirilium, también
denominado flavilio.

Fig8.Estructura antocianinas
Almeida Andrea (2018)

IV. MATERIALES Y EQUIPOS

Tabla1.Materiales y equipos utilizados

Materiales de Equipos Reactivos Materiales

Seguridad
Mandil Metanol 1 mortero
Espectrofotómetro. Marca:Merck
Marca: Hach, Código: 30114
Modelo:DR5000
Guantes de 1 caja petri
latex
Mascarilla - - 3 tubos de ensayo

Gafas de - - Papel filtro

seguridad
- - - Hojas de flores

- - - Tinta vegetal

Almeida Andrea (2018)

V. PROCEDIMIENTO

A. Obtención de la fase estacionaria y fase móvil

1. Medir la altura interna y el diámetro de cada uno de los frascos de vidrio, recortar dos
rectángulos en el papel filtro de 12x5.5 cm y llevar las a la estufa por unos minutos y
retirarlas.
2. Trazar tres líneas la primera a 1 cm, la segunda a 2 cm, y la tercera a 10 cm desde la
base
3. En el frasco colocar una cantidad pequeña menor a 1 cm de Metanol.
B. Extracción del colorante de las flores
1. Para la rosa roja, en un mortero colocar las hojas sin el tallo.
2. Machacar hasta observar la presencia del colorante.
3. Con ayuda de una tela exprimir y colocar en una caja petri.
C. Aplicación de los estándares de la muestra en los estándares de cromatografía
1. En el papel filtro a lo ancho de la línea que está a 2 cm , con ayuda de un lápiz colocar la
ubicación del estándar y de la muestra (rosa roja) , deben estar completamente
separados.
2. Con ayuda de un compás colocar pequeñas gotas del estándar rojo y de la muestra en el
papel filtro. Llevar la placa a la estufa por pocos minutos y luego retirarla para colocar
otras gotas del estándar y la muestra hasta que se note el concentrado.
3. En el Frasco con Metanol introducir la placa en el centro del frasco y lo tapamos, la
placa debe estar recta y no se debe realizar ninguna manipulación.
4. Esperamos que la fase móvil suba hasta la línea trazada en la parte superior del papel
siendo este el límite del solvente.
5. Una vez observado que la fase móvil está cerca, retirar la placa del frasco y llevarla a la
estufa, para posterior realizar las mediciones para los cálculos
D. Preparación de las muestras para medir absorción
1. Recortar la distancia recorrida del colorante rojo y de la muestra de la placa.
2. Colocar las muestras recortadas en los tubos de ensayo con metanol.
3. Obtener un total de 3 tubos de ensayos para realizar el análisis en el espectrofotómetro.
4. Conectar el equipo y encenderlo.
5. Con la muestra en blanco realizar un scan molecular y determinar el espectro de la
sustancia.
6. Luego de obtener el blanco marcar como cero y obtener la absorbancia de cada muestra,
con su respectivo espectro molecular.

VI. DATOS EXPERIMENTALES

 Tabla2. Medidas de las distancias en el papel filtro

Medidas del papel filtro 12 x 5,5 cm

Medidas para la fase móvil y estática 1 cm , 2 cm , 10 cm
Distancia recorrida del estándar 7,4 cm
Distancia recorrida de la muestra 6,9 cm
Distancia recorrida del solvente 10,2 cm
Almeida Andrea (2018)

Tabla3.Datos obtenidos del análisis espectrofotométrico

Muestra Espectro molecular Absorbancia

Muestra estándar 525 nm 0,044
Muestra de rosa 525 nm 0,0 04
Almeida Andrea (2018)

VII. CÁLCULOS

Haciendo uso de la fórmula del factor de retención o factor de respuesta (1)

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛
𝑅𝑓 = (1)
𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑒𝑙 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛

a. Colorante vegetal rojo

7,4 𝑐𝑚
𝑅𝑓 =
10,2 𝑐𝑚

𝑅𝑓 = 0,725

b. Muestra de rosa roja

6,9 𝑐𝑚
𝑅𝑓 =
10,2 𝑐𝑚

𝑅𝑓 = 0,677

VIII. RESULTADOS

Tabla4.Detalle de los resultados obtenidos de cada muestra

 Muestra Factor de retención
Colorante vegetal rojo 0,725
Muestra de rosa roja 0,677
Almeida Andrea (2018)

IX. DISCUSIÓN CIENTÍFICA

La separación de los componentes de las muestras, surge de la interacción con el

disolvente, es decir la fase móvil y dependiendo de la polaridad que tenga .El disolvente
compite con los componentes de la muestra por los sitios de unión. Estos componentes son
desplazados reversible y continuamente en la dirección del flujo del disolvente. A pesar que
esta técnica es sencilla, se debe tener en cuenta varios inconvenientes que se pueden
presentar así como la presencia de otra sustancia en el papel , la evaporación del disolvente
u otros factores ambientales que afecten a la fase móvil.

X. CONCLUSIONES

1.El crecimiento y desplazamiento de la muestra del extracto de la rosa roja es 6,9 cm lo

que quiere decir que su desplazamiento fue corto y lento al interactuar con la fase móvil
que es metanol , esto sucede porque el compuesto es poco polar y tiene una mayor facilidad
de eluirse con el disolvente.

2. El recorrido de la muestra estándar ,que es colorante vegetal rojo presento una medida de
7,4 cm ,comprándolo con la muestra de la rosa roja si presenta una diferencia significativa
de medio centímetro lo que se llega a concluir que esta sustancia es mas polar en relación a
la sustancia anterior puesto que se adsorben más firmemente a los centros activos de la fase
estacionaria

3.El factor de retención del colorante vegetal rojo es mayor presentando una cantidad de
0,725 lo que quiere decir que tiene una afinidad con el disolvente en este caso el metanol
considerado como un disolvente polar lo que ayuda a que el movimiento sea más rápido y
menos efectiva la separación.

4. El factor de retención de la muestra es menor que el estándar siendo 0,677; lo que se

comprueba que las dos sustancias no son iguales , esto quiere decir que el colorante vegetal
no es totalmente natural.

5. Sólo puede lograrse la separación exitosa de los componentes de una mezcla si la

selección del eluyente es la adecuada. Si el disolvente no es lo suficientemente polar para
mover los componentes de la mezcla, habrá muy poca o ninguna separación. En cambio, si
el disolvente es demasiado polar todos los componentes se moverán fácilmente y el
resultado nuevamente será poca o ninguna separación
XI. RECOMENDACIONES
1. Se debe tomar muy en cuenta la concentración de la mancha de la muestra o estándar ya
que al ser muy baja no se tiene éxito en la separación de componentes por lo cual hay que
proceder a enriquecer la mancha tantas veces como sea necesario sin excederse y secarla
adecuadamente.

2. Para el análisis por cromatografía se recomienda utilizar diferentes disolventes para

determinar el más adecuado y observar la diferencia que hay entre ellos.
3. Se recomienda elegir un eluyente en el que los componentes de la mezcla presenten un
Rf medio en torno a 0.3‐0.5. Para compuestos poco polares, se debe utilizar un disolvente
apolar como el hexano. En el caso de compuestos con polaridad media, se aconseja utilizar
mezclas hexano/acetato de etilo en distintas proporciones. Los productos más polares,
requieren disolventes más polares como mezclas de diclorometano/metanol en distintas
proporciones.

4. La cromatografía en papel es una técnica muy utilizada ya que es sencilla de hacerlo, es

por eso que es recomendable aplicarla para comparar muestras, determinar el grado de
pureza de un compuesto.
5. Para realizar el procedimiento de cromatografía es recomendable que se elija una flor
distinta para observar las diferencias en el desplazamiento y relacionándolo con la
polaridad de dicha muestra.

XII. BIBLIOGRAFÍA

bioenciclopedia. (2014). http://www.bioenciclopedia.com/rosa/. Obtenido de

http://www.bioenciclopedia.com/rosa/

Iberoamericana, U. (2015). Universidad Iberoamericana . Obtenido de

http://www.bib.uia.mx/gsdl/docdig/didactic/IngCienciasQuimicas/lqoa001.pdf

Mendoza, P. (2014). Equipo Quimica Experimental . Obtenido de

https://www.sites.google.com/site/equipoquimicaexperimental6/pactica-6-
destilacion-simple-y-cromatografia-en-papel

Quiored. (2015). Quiored. Obtenido de http://www.ugr.es/~quiored/lab/oper_bas/crom.htm

UNAM. (Diciembre de 2007). UNAM. Obtenido de

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
XIII. ANEXOS

Anexo1.Medicion en papel filtro Anexo2. Extracción del color

Almeida Andrea (2018) Almeida Andrea

Anexo3. Colorante de la muestra Anexo4. Colocación de las muestras

Almeida Andrea (2018) Almeida Andrea (2018)

Anexo5. Separación de componentes Anexo6. Colocación del papel en el vaso

Almeida Andrea (2018) Almeida Andrea (2018)
Anexo7. Recortes de las muestras Anexo8. Colocación de las muestras
Almeida Andrea (2018) Almeida Andrea (2018)

Anexo8. Medición del espectro molecular

Almeida Andrea (2018)