Práctica N°1: Cromatografía

Objetivo:
a) Conocer las diferentes técnicas de cromatografías y determinar su uso práctica dentro
del campo de la biología.
Teoría.
Esta técnica analítica permite la separación de las moléculas en la cromatografía basada en
un conjunto de técnicas asociadas al principio de retención selectiva. Permite separar los
distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de
dichos componentes.
Tenemos dos fases denominadas fase estacionaria y fase móvil. En este sistema las
moléculas se separan unas de otras según su afinidad a estas dos fases. Por ejemplo si la
molécula tiene alta afinidad por la fase estacionaria, esta se quedará más tiempo detenida que
otra molécula que no interactúa de ninguna forma con el soporte. Estos tipos de interacciones
pueden ser: electrostáticos, hidrofóbicos, de difusión y de afinidad.
Tipos de Cromatografía.-
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se pueden
distinguir distintos tipos de cromatografía:
a. Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un líquido.
b. Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido anclado a un soporte
sólido.
c. Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no volátil impregnado en un
sólido y la fase móvil es un gas.
d. Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.
Según el tipo de interacción (mecanismo de separación) que se establece entre los
componentes de la mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre:
1) Cromatografía de adsorción: la fase estacionaria es un sólido polar capaz de adsorber a los
componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.
2) Cromatografía de partición: la separación se basa en las diferencias de solubilidad de los
componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas.
3) Cromatografía de intercambio iónico: la fase estacionaria es un sólido que lleva anclados
grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones
presentes en la fase móvil
4) Cromatografía de exclusión: la separación se basa fundamentalmente en efectos de
exclusión, tales como diferencias en el tamaño de las moléculas y /o en su forma o en su
carga. El término cromatografía de exclusión por tamaño, se puede utilizar cuando la
separación se basa en el tamaño molecular. Los términos cromatografía de filtración sobre
gel o permeación sobre gel (GPC), se han utilizado con anterioridad para describir este
proceso cuando la fase estacionaria es un gel hinchado. El término cromatografía de
exclusión de iones es específico para la separación de iones en una fase acuosa.
5) Cromatografía de afinidad: esta expresión caracteriza a una particular variante de la
cromatografía, en la que se utiliza para la separación una interacción biológica específica
entre el analito y la fase.

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Cromatografía de Adsorción
La adsorción es la propiedad que tienen ciertos sólidos de aumentar la concentración en
su superficie de otras sustancias. La separación se debe a las diferencias de adsorción de los
componentes de una mezcla sobre la fase estacionaria.
La fase estacionaria ha de ser un sólido polar de gran superficie (adsorbente). La fase
móvil puede ser un gas o un líquido dando lugar a la cromatografía gas-sólido (CGS) o
líquido-sólido (CLS). El grado de adsorción varía según la naturaleza y superficie específica
de los adsorbentes y naturaleza de los solutos. Los enlaces entre moléculas adsorbidas y el
adsorbente han de ser débiles para que su fijación sea reversible, las uniones son debidas a
fuerzas intermoleculares (interacciones dipolo- dipolo o puentes de hidrógeno). Como regla
general, las polaridades del adsorbente y de los solutos han de ser opuestas.
 Cromatografía en Capa Fina
Esta técnica se usa generalmente en la separación e identificación de pequeñas cantidades
de muestras biológicas. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por
lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se
desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.
La mezcla a analizar se deposita a una pequeña distancia del borde inferior de la placa y
se introduce en una cubeta que contiene la fase móvil, que asciende a lo largo de la placa por
capilaridad, desplazando a los componentes de la mezcla a diferentes velocidades, lo que
provoca su separación. Cuando el frente del disolvente se encuentra próximo al extremo
superior de la placa esta se saca y se visualiza.
La relación entre la distancia recorrida por un
compuesto y por el disolvente desde el origen se
conoce como Rf (rate factor).
Rf = Distancia recorrida por el compuesto
Distancia recorrida por el disolvente

En una placa de vidrio se cubre con una

delgada capa uniforme del adsorbente (soporte), los
cuales necesitan un agente ligando como el sulfato
de calcio para facilitar la adherencia a la placa de
vidrio. El espesor normal que se espera obtener es
de unos 0.25 mm cuando se utilizan las placas para hacer análisis cualitativos. Si se trata de
trabajos preparativos se debe usar láminas con un espesor de 0.5 mm. Las placas de Silica se
utilizan para la separación y caracterización de aminoácidos, alcaloides, azúcares, ácidos
grasos, aceites esenciales, terpenoides y esteroides.

Material y Reactivos
1. Silica Gel.
2. Láminas de vidrio Eluyentes:
1. n-butanol: ácido acético glacial: agua
3. Láminas porta objetos.
(60:15:25)
4. Envase con tapa (Cámara
2. HCl 1 N
cromatográfica)
3. Ácido acético glacial: HCl : Agua
5. Muestra: Flores y frutos de color
(60:6:20)
púrpura.
6. HCl metanólico 1%

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Procedimiento
1. Preparación de la Placa
a. Se mezcla el adsorbente con agua, hasta que la suspensión sea homogénea y esté
libre de grumos y aire.
b. La mezcla que se usa como adsorbente se coloca sobre una lámina de vidrio de ha
sido previamente lavada con mezcla sulfocrómica.
o
c. Se deja secar durante 15 minutos en una estufa a 100°C ó a 120 C. La temperatura
elimina la humedad del adsorbente y lo activa de esta forma.
d. Las láminas portaobjetos cuidadosamente lavadas se embadurnan con la suspensión
sumergiéndolas en una cubeta que las contiene.

2. Preparación y Aplicación de la muestra

a. La muestra (1 gr. de pétalos) se coloca en un tubo pequeño y se agrega 5 mL de HCl
metanólico (1%). Se muele hasta que el líquido quede fuertemente coloreado. Utilice
el sobrenadante para la Cromatografía.
b. Coloque la muestra en la superficie del silicagel, forme un diámetro de 1 a 5 mm.
con una micropipeta (colocar 10 - 100 uL de muestra).
c. Las manchas deben tener un diámetro de unos 3 mm y estar separadas por una
distancia de 1 ó 2 centímetros

3. Desarrollo del Cromatograma

a. Las placas de vidrio se colocan en la cuba cromatográfica cuidando que el origen no
sea tocado por el solvente.
b. Para evitar que el solvente que ésta saturando la cámara se evapore es necesario
cerrar las tapas herméticamente, si es posible embadurnándolas con Silica o grasa.
c. Después del desarrollo de la cromatografía se remueven las placas, se marca el frente
de corrida y se secan en la estufa a 110°C.

Realizar las siguientes anotaciones y cálculos:

Muestras Dm Ds Rf
A
B

Dm: distancia recorrida por la muestra

Ds: distancia recorrida por el solvente (desde origen hasta frente de solvente)
Rf = Dm/Ds (es el factor de retención). Permite identificar un compuesto en una mezcla al
comparar su Rf con el de un compuesto conocido (preferiblemente cuando se hacen eluir en
la misma placa de CCF).

Cuestionario
1. ¿Qué criterios permiten elegir el solvente adecuado para separar solutos?
2. Si de un fluido biológico deseas separar los lípidos, cuál sería el tratamiento de la muestra,
que soporte y que tipo de solvente utilizaría?
3. ¿Cuáll sería el soporte y el solvente adecuado para separar terpenos de esteroles?

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Cromatografía en Columna
Fundamento.- La cromatografía en columna es una técnica que se usa para separar o
identificar compuestos de interés biológico de una mezcla. Se emplea un medio a través del
cual fluye un líquido provocando una migración diferencial de los compuestos que se aplican.
Los solutos se distribuyen entre la fase móvil y la fase estacionaria (material sólido y poroso
denominado matriz).
Las matrices de las columnas están diseñadas de manera de interactuar con la carga de las
proteínas (cromatografía de intercambio iónico) o con los aminoácidos expuestos en su
superficie (cromatografía de interacción hidrofóbica), o pueden llevar unida alguna molécula
que, a su vez, interacciona específicamente con la proteína que se quiere retener
(cromatografía de afinidad). La cromatografía de exclusión molecular (o cromatografía de
filtración en gel o de tamiz molecular), es diferente de las anteriores, pues conduce al
fraccionamiento de las proteínas según su tamaño. En este caso, la matriz está formada por
pequeñas esferas porosas que permiten la entrada de proteínas de un cierto tamaño, que son
retardadas, mientras las moléculas mayores pasan o eluyen, más rápido.

Para el análisis de los eluatos de la columna; los compuestos separados en una

cromatografía en columna son coloreados, el progreso de la separación se puede monitorizar
visualmente. No obstante, a menudo los compuestos que deben ser aislados suelen ser
incoloros. En este caso, se recogen secuencialmente pequeñas fracciones de eluatos en tubos
rotulados y la composición de cada fracción se analiza por cromatografía en capa fina. Una
vez identificadas las diferentes fracciones que contienen el mismo producto, se reúnen, se
elimina el disolvente y se analiza la identidad de los componentes por métodos
espectroscópicos.

Materiales y Reactivos
1. Sephadex G-25
2. Tubo de vidrio (1 x 08 cm)
3. Buffer Fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2
4. Reservorio de Buffer con mangueras
5. Muestra: Azul de dextrano 10mg/mL y rojo de fenol 0.5%

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Procedimiento
1. Se prepara una suspensión de Sephadex G-25 en buffer fosfato de potasio 50 mM, pH
7.2; se vierte una vez equilibrada en el tubo (1 x 08 cm) dejando una capa de buffer de
elución.
2. Conectar el reservorio que tiene el mismo buffer (de elución) y se deja equilibrar la
columna.
3. Se destapa el tubo y se aplica la muestra en la parte superior del Sephadex G-25, lavando
con el buffer para eliminar las trazas de muestra que aún queden en las paredes de la
columna.
4. Se agrega un exceso de buffer y se conecta al reservorio.
5. Se colectan fracciones de 0,5 mL por tubo. El tubo con mayor intensidad de color
representa el volumen de exclusión de la columna (Vo o volumen muerto). Se determina
con más exactitud leyendo las fracciones en un espectrofotómetro a 620 o 260 nm.
6. La posición del pico correspondiente a la elución del rojo de fenol también se realiza
visualmente.
Realizar las siguientes anotaciones:

Volumen Volumen de Volumen

Muestras Tiempo
Muerto Elución Total
A
B

- Volumen muerto o de exclusión (V0) es el volumen del solvente que rodea a las esferas.
- Volumen de elución (Ve) es el volumen de solvente necesario para eluir el soluto de la
columna desde el momento en que se puso en contacto con el gel.
- Vx es el volumen ocupado por las esferas del gel.
Vt = V0+Vx
Calcular el Volumen relativo de Elución
Vr = Ve / V0 representa el comportamiento de un soluto particular en un gel
determinado y es independiente del tamaño de la columna del gel.
Cuestionario:
1. ¿Cuál es la relación entre el Peso Molecular de los solutos separados por cromatografía en
columna y el Volumen relativo de Elución?
2. Indique 03 soportes utilizados para la cromatografía de exclusión, mencionando sus
características.
3. Si tenemos una proteína de 700 KDa y tiene como soporte para cromatografía de
exclusión sephadex G-25, sephadex G-75, sephadex G-200, ¿Cuál de ellos utilizaría?
Justifique su respuesta.

Bibliografía

1. Plummer T. D. (1981): Introducción a la Bioquímica Práctica. Ed. Mc Graw-Hill

Latinoamerica S.A.
2. Bryan L.W. y Wilson K. (1981): Principios y Técnicas de Bioquímica Experimental. Ed.
Omega, S.A. Barcelona 36, España.
3. Gutiérrez R., Ana y Santa Cruz C., C. (1998) Guía de Prácticas Bioquímica. Universidad
Nacional Federico Villarreal.

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